烟草角虫作为大麻素临床前研究的昆虫模型系统

摘要

本方案为在大麻素研究中使用烟草角虫 Manduca sexta 提供了教学信息。 这里描述的方法包括所有必要的用品和方案，以监测昆虫模型的生理和行为变化，以响应大麻二酚（CBD）治疗。

摘要

随着医学中对大麻素的日益关注，几种哺乳动物模式生物已被用于阐明其未知的药物功能。然而，哺乳动物研究仍然存在许多困难，这需要开发用于大麻素研究的非哺乳动物模式生物。作者建议将烟草角虫 Manduca sexta 作为一种新的昆虫模型系统。该协议提供了有关用不同量的大麻二酚（CBD）制备人造饮食的信息，建立培养环境，并监测其对CBD治疗的生理和行为变化。简而言之，在接受角虫卵后，在25°C下以12:12的明暗循环允许卵1-3天孵化，然后随机分配到对照组（基于小麦胚芽的人造饮食;AD），载体（AD + 0.1%中链甘油三酯油;MCT油）和治疗组（AD + 0.1%MCT + 1 mM或2mM CBD）。一旦培养基准备好，将1^龄 幼虫单独放入带有木制烤串棒的50 mL试管中，然后用干酪布覆盖试管。以2天的间隔进行测量，以对CBD管理的生理和行为反应。这种简单的培养程序使研究人员能够在给定的实验中测试大型标本。此外，相对较短的生命周期使研究人员能够研究大麻素治疗对同质种群多代的影响，从而允许数据支持高等哺乳动物模式生物的实验设计。

引言

在过去几年中，公众的注意力一直集中在大麻素上，因为它们具有治疗潜力，包括治疗癫痫¹，帕金森病²，多发性硬化症³以及各种形式的癌症^4，5，6 与大麻二酚（CBD）。由于 大麻 在2018年的"农业改进法"中作为农业商品合法化，公法115-334（2018年农业法案）， 大麻 及其大麻素衍生物在食品，化妆品和制药行业中呈指数级增长。此外，单一大麻素和大麻素混合物的临床级分离株已在人类受试者⁷、细胞系^5、8和各种动物模型系统中成功测试^9，10。

临床试验是验证大麻素对特定疾病的疗效和不良反应的理想选择。然而，临床试验中存在许多挑战，包括伦理/IRB批准、招募和保留受试者¹¹。为了克服这些障碍，使用了各种人类细胞系，因为人源性细胞系具有成本效益，易于处理，可以绕过伦理问题，并提供一致且可重复的结果，因为细胞系是"纯细胞群，没有其他细胞和化学物质的交叉污染"¹²。

Alves等人（2021）¹³ 在胎盘滋养层中以剂量依赖性方式测试CBD，胎盘滋养层细胞是胎盘的特化细胞，在胚胎植入和与蜕膜化母体子宫的相互作用中起着至关重要的作用¹⁴。他们的结果表明，CBD导致细胞活力丧失，细胞周期进展破坏和细胞凋亡诱导。这些观察结果表明了孕妇使用 大麻 的潜在负面影响¹³。同样，一系列细胞系也用于检查CBD在人类疾病中的药理作用，特别是各种形式的癌症。 体外 研究成功地证明了胰腺^癌细胞15、^breast8和结直肠癌细胞¹⁶的抗癌作用。然而，虽然具有广泛可用且易于处理的特定细胞系，但由于其生长条件或处理的改变，HeLa，HEK293等特定细胞系容易发生遗传和表型变化¹⁷。

在大麻研究中，各种动物模型系统，从小鼠18，豚鼠¹⁹和兔子¹⁹等小动物到犬20，仔猪²¹，猴子²²，马²³等大型动物，已被用于探索未知的治疗效果。小鼠一直是大麻素研究的首选动物模型系统，因为它们的解剖学，生理学和遗传相似性^与人类24。最重要的是，小鼠的神经系统中有CB1 / 2受体，这些受体存在于人类中。它们的生命周期也比人类受试者短，更容易维护和丰富的遗传资源，因此更容易在整个生命周期中监测大麻素的影响。哺乳动物系统被广泛使用，并已成功证明CBD可缓解癫痫发作¹，创伤后应激障碍⁹，口腔溃疡²⁵和痴呆样症状¹⁰。小鼠模型还使社区内个体的社会互动研究成为可能，这在大型动物和人类中非常困难²⁶。

尽管动物模型系统具有所有优点，但它仍然成本高昂，并且在药物管理和数据收集期间需要重症监护。此外，由于实验设计和严谨性的局限性，在研究中使用小鼠的不可重复性和对人类条件的概括性差，因此存在审查²⁷。

随着对大麻素的医学/临床前研究的需求不断增加，需要一个非哺乳动物模型系统。传统上，无脊椎动物模型比脊椎动物模型具有独特的优势。显著的好处包括饲养许多标本的便利性和低成本，并使研究人员能够监测多代遗传同质种群²⁸。最近的一项研究证明，果蝇 黑腹果 蝇是一种有效的昆虫模型系统，用于研究大麻素在调节进食行为中的药理功能²⁹。在昆虫模型系统中，作者专注于烟草角虫 Manduca sexta，也称为卡罗来纳狮身人面像蛾或鹰蛾，作为大麻素研究的新型昆虫模型系统。

Manduca sexta 属于Sphingidae家族。这种昆虫是美国南部最常见的植物害虫，它们以茄科植物为食。昆虫模型在昆虫生理学，生物化学，神经生物学和药物相互作用研究方面有着悠久的历史。 Manduca sexta的研究组合包括一个基因组序列草案，允许对基本细胞过程进行分子水平的理解³⁰。该模型系统的另一个关键好处是其大尺寸，在幼虫发育的18-25天内长度超过100毫米，重量达到10克以上。大尺寸使研究人员能够轻松实时监测形态和行为变化，以响应CBD治疗。此外，由于大小，用腹部神经系统检查电生理反应，包括在没有高分辨率显微镜设置的情况下从幼虫上解剖的神经节。独特的功能使研究人员能够轻松调查对施用大麻素的急性和长期反应。

尽管有这种多功能性， 但M. sexta 直到最近才被探索，因为它适合作为 大麻 和大麻素研究的实验模型。2019年，作者首次使用昆虫模型系统来解决 大麻 已经进化到产生大麻二酚以保护自己免受昆虫食草动物侵害^{的假设30，31}。结果清楚地表明，这些植物利用CBD作为喂养威慑，并抑制了害虫 M. sexta caterpillar的生长，并导致死亡率增加³¹。该研究还证明了CBD对中毒乙醇幼虫的拯救作用，确定了乙醇作为CBD载体的潜在载体效应。如图所示，昆虫模型系统在3-4周内有效地研究了大麻素的治疗效果，并且比其他动物系统更少的劳动力和成本。虽然昆虫模型缺乏大麻素受体（即没有CB1/2受体），但模型系统提供了一个有价值的工具，通过大麻素受体无关的方式了解大麻素的药理作用。

本研究的作者以前曾使用烟草角虫作为大麻素研究的模型系统³¹。在仔细考虑了使用 M. sexta的益处和风险之后，我们提供了一种方法，涉及适当的护理和准备临床前试验的饮食，为未来的临床前实验室使用提供了机会。

研究方案

1. 角虫制备及大麻二酚处理

1. 获得150-200可行 M。 六角 蛋和小麦胚芽为基础的人造饮食（见 材料表）。
2. 将角虫卵放入具有小麦胚芽人造饮食（AD）层的聚苯乙烯培养皿中，并将卵转移到保持25°C且相对湿度为40%-60%的昆虫饲养室（ 见材料表）。
3. 让烟草角虫卵在相对湿度保持在25°C且相对湿度为40%-60%的昆虫饲养室内孵化1-3天。
4. 通过将1.26克>98%纯度的CBD分离物加入20毫升EtOH（200度）或100%中链甘油三酯（MCT）油中，制备大麻二酚（CBD）储备溶液（200mM）（见 材料表）。
   注意:CBD隔离物对光敏感，因此请在黑暗处处理。
5. 向1，000g AD中添加5 mL和10 mL的200 mM CBD储备溶液，使日粮的最终浓度分别为1 mM和2mM CBD。
   注意:确保饮食和CBD储备溶液充分混合，直到形成完全均匀的混合物。用手将含有CBD库存的AD混合在塑料袋中至少45分钟。
   注意:咖啡搅拌机或任何其他金属研磨机似乎无效。
6. 将20g三种培养基，对照（AD），载体（AD + 0.1%的EtOH或MCT油）和含有CBD的培养基（AD + 0.1%的EtOH或MCT油+ 1mM / 2mM CBD）分配到50 mL管的底部。
7. 将1龄幼虫（约2毫米长）随机分布在50 mL试管中，并用穿孔盖或干酪布盖住（见 材料表）。
   注意:将管子倒置，在保持25°C且相对湿度为40%-60%的昆虫饲养室中生长昆虫。
8. 在昆虫饲养室（见 材料表）内种植它们，保持在25°C，具有12小时的光/暗循环。

2. 六分枝 杆菌幼虫生长、饮食消耗和死亡率测量

1. 在转移到单个容器后，以分析天平和死亡率以2天间隔测量幼虫生长（即大小和重量），直到化蛹被识别为硬化的外胚层的深棕色。
   1. 在将幼虫引入各自的饮食之前，记录每组幼虫的初始质量（以克为单位），并在每次测量时从初始质量中减去幼虫的质量，以确定幼虫发育阶段之间的质量增益，直到幼虫完成化蛹阶段。
   2. 记录幼虫发育阶段之间的天数，以了解幼虫生长阶段之间发育时间框架的差异，直到每种饮食的化蛹。
      注意:从容器中刮掉粪便，以避免任何霉菌污染。根据实验目的收集物质以供将来测试（例如，CBD积累率计算，微生物分析）。重要的是在多发性或蜕皮的脆弱时期仔细处理昆虫。从容器中取出幼虫时，用平尖和宽镊子轻轻抓住昆虫的主体，并且在昆虫脱落过程中不要强行去除皮肤的外层。
2. 通过权衡1龄幼虫和化蛹之间容器的饮食损失来测量饮食消耗³¹。在实验开始时记录初始饮食克数，并在幼虫进入完全化蛹阶段时从剩余的饮食量中减去初始量。
   注意:粪便物质应从饮食测量中排除。通过将容器倒置，可以很容易地从介质中去除粪便和其他碎屑（即皮肤脱落物）。
3. 对于移动性测量，允许受试昆虫在腔室环境中适应至少5分钟，并使用自动计算机化的恐惧调节室跟踪三^组5龄昆虫（长度为80-100毫米）行进的距离³¹（见材料表）。
4. 使用运动检测软件（参见材料表）分析移动响应³¹，使用视频录制 60 帧/秒，持续 5 分钟，生成运动指数。

3. 统计分析

1. 利用Tukey的后测试³²，通过单因子方差分析幼虫生长（即大小和重量）和运动指数的差异。
2. 使用对数秩（Mantel-Cox）测试³³ 进行生存曲线比较。
   注:所有统计分析均使用统计分析软件进行（见 材料表）。

结果

曼杜卡六分仪 作为检查大麻素毒性的模型系统
图1 描述了使用烟草角虫 Manduca sexta的CBD实验的关键组成部分。大量昆虫（>20）在25°C下以12小时:12小时=光:暗循环单独饲养。每隔2天测量昆虫的大小，体重和死亡率，以监测高剂量CBD（2mM）治疗后的短期和长期反应。

图2 显示了CBD对昆虫生长和?...

讨论

喂养研究表明，高剂量的CBD（2 mM）抑制了昆虫的生长并增加了死亡率³¹。昆虫模型还显示出对乙醇的敏感性;然而，CBD有效地解毒了乙醇毒性，将其存活率，饮食消耗和食物搜索行为提高到与对照组相似的水平（图3A，B）³¹。所描述的昆虫模型系统由三个关键步骤组成:（1）确保 M. sexta的卵在大小和时间上均匀孵化，（2?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytic balance	Mettler Instrument Corp.	AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)	Lilu's Garden
Cheesecloth	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes	VWR	89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	EX0276-1
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber	Darwin Chambers	INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil	Walmart
Motion detection software (Actimetrics)	Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)	VWR INTERNATIONAL	688161
Tobacco hormworm artificial diet	Carolina Biological Supply Company	Item # 143908	Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs	Carolina Biological Supply Company	Item # 143880	Unit of 30-50