JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Настоящий протокол содержит инструктивную информацию по использованию табачного рогатого червя Manduca sexta в исследованиях каннабиноидов. Метод, описанный здесь, включает в себя все необходимые материалы и протоколы для мониторинга физиологических и поведенческих изменений модели насекомых в ответ на лечение каннабидиолом (CBD).

Аннотация

С повышенным вниманием к каннабиноидам в медицине, несколько модельных организмов млекопитающих были использованы для выяснения их неизвестных фармацевтических функций. Тем не менее, многие трудности остаются в исследованиях млекопитающих, что требует разработки модельных организмов, не относящихся к млекопитающим, для исследований каннабиноидов. Авторы предполагают, что табачный роговой червь Manduca sexta является новой модельной системой насекомых. Этот протокол предоставляет информацию о подготовке искусственной диеты с различным количеством каннабидиола (КБД), создании среды культивирования и мониторинге их физиологических и поведенческих изменений в ответ на лечение КБД. Короче говоря, после получения яиц рогового червя яйцам разрешалось вылупляться в течение 1-3 дней при 25 °C в цикле 12:12 свет-темнота, прежде чем они были случайным образом распределены в контроль (искусственная диета на основе зародышей пшеницы; AD), транспортное средство (AD + 0,1% среднецепочечного триглицеридного масла; MCT oil) и группы обработки (AD + 0,1% MCT + 1 мМ или 2 мМ CBD). После того, как среда была подготовлена, личинки 1-й звезды были индивидуально помещены в пробирку объемом 50 мл с помощью деревянной шампурной палочки, а затем пробирка была покрыта марлей. Измерения проводились через 2-дневные интервалы для физиологических и поведенческих реакций на введение КБД. Эта простая процедура культивирования позволяет исследователям тестировать большие образцы в данном эксперименте. Кроме того, относительно короткие жизненные циклы позволяют исследователям изучать влияние каннабиноидных методов лечения на несколько поколений однородной популяции, что позволяет получать данные для поддержки экспериментального проекта в более высоких модельных организмах млекопитающих.

Введение

В последние годы внимание общественности было сосредоточено на каннабиноидах из-за их терапевтического потенциала, включая лечение эпилепсии1, болезни Паркинсона2, рассеянного склероза3 и различных форм рака4,5,6 с помощью каннабидиола (CBD). Поскольку каннабис легализован как сельскохозяйственный товар в Законе об улучшении сельского хозяйства 2018 года, Публичном законе 115-334 (Законопроект о фермах 2018 года), каннабис и его каннабиноидные производные в пищевой, косметической и фармацевтической промышленности экспоненциально увеличились. Кроме того, клинические изоляты одиночных каннабиноидов и каннабиноидных смесей были успешно протестированы на людях7, клеточных линиях5,8 и различных модельных системах животных9,10.

Клиническое испытание было бы идеальным для подтверждения эффективности и неблагоприятного воздействия каннабиноидов на конкретное заболевание. Тем не менее, существует множество проблем в клинических испытаниях, включая этическое / IRB одобрение, набор и удержание субъектов11. Чтобы преодолеть эти препятствия, были использованы различные клеточные линии человека, потому что клеточные линии человеческого происхождения экономически эффективны, просты в обращении, могут обходить этические проблемы и обеспечивать последовательные и воспроизводимые результаты, поскольку клеточные линии представляют собой «чистую популяцию клеток, которые не имеют перекрестного загрязнения других клеток и химических веществ»12.

Alves et al. (2021)13 протестировали КБД дозозависимым образом в плацентарных трофобластах, которые являются специализированными клетками плаценты, играющими важную роль в имплантации эмбриона и взаимодействии с децидуализированной материнской маткой14. Их результаты показали, что КБД вызывает потерю жизнеспособности клеток, нарушение прогрессирования клеточного цикла и индукцию апоптоза. Эти наблюдения демонстрируют потенциальные негативные последствия употребления каннабиса беременными женщинами13. Аналогичным образом, ряд клеточных линий также использовался для изучения фармакологических эффектов КБД при заболеваниях человека, в частности, различных формах рака. Исследования in vitro успешно продемонстрировали противораковые эффекты в клетках рака поджелудочной железы15, молочной железы8 и колоректального рака16. Однако, будучи широко доступными и простыми в обращении, конкретные клеточные линии, такие как HeLa, HEK293, склонны к генетическим и фенотипическим изменениям из-за изменений в условиях их роста или обработки17.

В исследованиях каннабиса различные системы моделей животных, начиная от мелких животных, таких как мышь18, морская свинка19 и кролик19, до крупных животных, таких как собака20, поросенок21, обезьяна22, лошадь23, были использованы для изучения неизвестных терапевтических эффектов. Мыши были наиболее предпочтительной модельной системой на животных для исследований каннабиноидов из-за их анатомического, физиологического и генетического сходства с людьми24. Самое главное, что мыши имеют рецепторы CB1/2 в своей нервной системе, которые присутствуют у людей. Они также имеют более короткий жизненный цикл, чем люди, с более легким обслуживанием и обильными генетическими ресурсами, что значительно облегчает мониторинг воздействия каннабиноидов на протяжении всего жизненного цикла. Система млекопитающих широко используется и успешно продемонстрировала, что КБД снимает судорожные расстройства1, посттравматическое стрессовое расстройство9, язвы полости рта25 и симптомы, подобные деменции10. Мышиная модель также позволила изучить социальное взаимодействие людей в сообществе, что чрезвычайно сложно у крупных животных и людей26.

Несмотря на все преимущества системы моделирования животных, она по-прежнему является дорогостоящей и требует интенсивной терапии во время введения лекарств и сбора данных. Кроме того, существует тщательное изучение использования мышей в исследованиях из-за невоспроизводимости и плохой рекапитуляции человеческих условий из-за ограничений в экспериментальном дизайне и строгости27.

С ростом спроса на медицинские/доклинические исследования каннабиноидов необходима модельная система, не относящаяся к млекопитающим. Модели беспозвоночных традиционно давали отличительные преимущества по сравнению с моделями позвоночных. Значительные преимущества включают в себя простоту и низкую стоимость выращивания многих образцов и возможность исследователей контролировать несколько поколений генетически однородных популяций28. Недавнее исследование доказало, что плодовая муха, Drosophila melanogaster, является эффективной модельной системой насекомых для изучения фармакологических функций каннабиноидов в модуляции пищевого поведения29. Среди модельных систем насекомых авторы сосредоточились на табачном рогатом черве, Manduca sexta, также известном как каролинская сфинксовая моль или ястребиная моль, в качестве новой системы моделей насекомых для исследований каннабиноидов.

Manduca sexta принадлежит к семейству Sphingidae. Насекомое является наиболее распространенным вредителем растений на юге Соединенных Штатов, где они питаются солнцестоятельными растениями. Модель насекомых имеет долгую историю исследований в области физиологии насекомых, биохимии, нейробиологии и исследований лекарственного взаимодействия. Исследовательский портфель Manduca sexta включает в себя проект последовательности генома, позволяющий понять на молекулярном уровне основные клеточные процессы30. Еще одним важным преимуществом этой модельной системы является ее большой размер, достигающий более 100 мм в длину и 10 г в весе в течение 18-25 дней развития личинок. Большой размер позволяет исследователям легко отслеживать морфологические и поведенческие изменения в режиме реального времени в ответ на лечение КБД. Кроме того, из-за размера были исследованы электрофизиологические реакции с брюшной нервной системой, включая ганглии, рассеченные из личинок без настроек микроскопа высокого разрешения. Уникальная особенность позволяет исследователям легко исследовать острые и долгосрочные реакции на введенный каннабиноид (ы).

Несмотря на такую универсальность, M. sexta только недавно был исследован на предмет его пригодности в качестве экспериментальной модели для исследований каннабиса и каннабиноидов. В 2019 году авторы впервые использовали систему моделирования насекомых для рассмотрения гипотезы о том, что каннабис эволюционировал для производства каннабидиола, чтобы защитить себя от насекомых-травоядных30,31. Результат ясно показал, что растения эксплуатировали КБД в качестве средства сдерживания питания и ингибировали рост насекомого-вредителя M. sexta caterpillar, а также вызывали повышенную смертность31. Исследование также продемонстрировало спасительное воздействие КБД на интоксицированных личинок этанола, определив потенциальный эффект этанола в качестве носителя КБД. Как показано, модельная система насекомых эффективно исследовала терапевтические эффекты каннабиноидов в течение 3-4 недель с меньшими трудозатратами и затратами, чем другие системы животных. Хотя в модели насекомых отсутствуют каннабиноидные рецепторы (т.е. нет рецепторов CB1/2), модельная система предоставляет ценный инструмент для понимания фармакологических ролей каннабиноидов с помощью каннабиноидного рецептора.

Авторы этого исследования ранее работали с табачным роговым червем в качестве модельной системы для исследований каннабиноидов31. После тщательного рассмотрения преимуществ и рисков использования M. sexta мы предоставили метод, предполагающий надлежащий уход и подготовку диеты для доклинических испытаний, которые открывают возможности для будущего доклинического лабораторного использования.

протокол

1. Препарат рогового червя и лечение каннабидиолом

  1. Получить 150-200 жизнеспособных М. искусственные диеты на основе яиц секста и зародышей пшеницы (см. Таблицу материалов).
  2. Поместите яйца рогатого червя в полистирольную чашку Петри со слоем искусственной диеты (AD) на основе зародышей пшеницы и перенесите яйца в камеру выращивания насекомых (см. Таблицу материалов), поддерживаемую при температуре 25 ° C с относительной влажностью 40-60%.
  3. Дайте яйцам табачного рогатого червя в течение 1-3 дней вылупиться внутри камеры выращивания насекомых, поддерживаемой при 25 °C с относительной влажностью 40-60%.
  4. Готовят раствор каннабидиола (CBD) (200 мМ), добавляя 1,26 г изолята CBD >98% чистоты в 20 мл EtOH (200 proof) или 100% среднецепочечного масла триглицеридов (MCT) (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Изолят CBD светочувствительный, поэтому обращайтесь в темноте.
  5. Добавьте 5 мл и 10 мл из 200 мМ раствора КБД к 1000 г БА, чтобы получить конечные концентрации диет 1 мМ и 2 мМ КБД соответственно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что диета и раствор КБД хорошо смешиваются до тех пор, пока не образуется полностью однородная смесь. Смешайте AD, содержащий запас CBD, в полиэтиленовом пакете в течение не менее 45 минут вручную.
    ВНИМАНИЕ: Кофемешалка или любая другая металлическая мясорубка оказалась неэффективной.
  6. Дозируйте 20 г трех сред, контрольных (AD), транспортных средств (AD + 0,1% масла EtOH или MCT) и CBD, содержащих среды (AD + 0,1% масла EtOH или MCT + 1 мМ / 2 мМ CBD) на дно трубки объемом 50 мл.
  7. Случайным образом распределите личинок 1-й звезды (длиной ~ 2 мм) по отдельности в пробирке объемом 50 мл и накройте перфорированной крышкой или марлей (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Поместите трубку вверх ногами и выращивайте насекомых в камере выращивания насекомых, поддерживаемой 25 ° C с относительной влажностью 40%-60%.
  8. Выращивайте их в камере выращивания насекомых (см. Таблицу материалов), поддерживаемой при температуре 25 °C с циклом 12 ч света/темноты.

2. Рост личинок M. sexta , потребление рациона и измерения смертности

  1. Измерьте рост личинок (т.е. размер и вес) с аналитическим балансом и смертностью с интервалом в 2 дня после переноса в отдельные контейнеры до тех пор, пока окукливание не будет распознано как темно-коричневая окраска затвердевшего слоя экзокутикулы.
    1. Запишите начальную массу (в граммах) каждой группы личинок перед введением личинок в их соответствующий рацион и вычтите массу личинок при каждом измерении из начальной массы, чтобы определить прирост массы между стадиями развития личинок до тех пор, пока личинки не завершат стадию окукливания.
    2. Запишите количество дней между стадиями развития звезды, чтобы понять различия во временных рамках развития между стадиями роста личинок до окукливания на каждой диете.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Соскоблите фекалии с контейнера, чтобы избежать загрязнения плесенью. Соберите материал для будущих испытаний в зависимости от целей эксперимента (например, расчет скорости накопления КБД, микробное профилирование). Важно бережно обращаться с насекомым в хрупкие периоды аполиза или экдиза. Вынимая личинок из емкости, аккуратно захватите основное тело насекомого плоским кончиком и широкими щипцами и не заставляйте удалять внешний слой кожи, когда насекомое находится в процессе линьки.
  2. Измерьте потребление диеты31 , взвесив потерю контейнера между личинками 1-й звезды и окукливанием. Запишите начальные граммы диеты в начале эксперимента и вычтите начальное количество из оставшегося количества рациона, когда личинки вступят в полную стадию окукливания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Фекалии должны быть исключены из измерения рациона. Фекалии и другой мусор (т.е. кожные линьки) можно легко удалить из среды, поместив контейнер вверх ногами.
  3. Для измерений подвижности позвольте подвергшемуся насекомому акклиматизироваться в камерной среде в течение не менее 5 мин и отслеживать расстояния31 , которые прошли три группы насекомых 5-й звезды (длиной 80-100 мм) с использованием автоматизированной компьютеризированной камеры кондиционирования страха (см. Таблицу материалов).
  4. Анализируйте реакцию мобильности31 с помощью видео, записанного со скоростью 60 кадров/с в течение 5 минут, с помощью программного обеспечения для обнаружения движения (см. Таблицу материалов), которое генерирует индекс движения.

3. Статистический анализ

  1. Проанализируйте различия в росте личинок (т.е. размере и весе) и индексе движения с помощью односторонней ANOVA с помощью пост-теста Туки32.
  2. Используйте тест log-rank (Mantel-Cox)33 для сравнения кривых выживания.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Все статистические анализы проводились с использованием программного обеспечения для статистического анализа (см. Таблицу материалов).

Результаты

Manduca sexta как модельная система для изучения токсичности каннабиноидов
На рисунке 1 показаны ключевые компоненты эксперимента CBD с использованием табачного рогатого червя Manduca sexta. Большое количество насекомых (>20) выращивалось индивидуально...

Обсуждение

Исследование кормления показало, что высокие дозы КБД (2 мМ) ингибируют рост насекомого и увеличивают смертность31. Модель насекомых также показала чувствительность к этанолу; однако КБД эффективно детоксифицировал токсичность этанола, увеличивая их выживаемость, потребл?...

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов.

Благодарности

Это исследование было поддержано Институтом исследований каннабиса при Университете штата Колорадо-Пуэбло и Министерством науки и ИКТ (2021-DD-UP-0379), а также городом Чхунчхон (Hemp R&D and industrialization, 2020-2021).

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Analytic balanceMettler Instrument Corp.AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)Lilu's Garden
CheeseclothVWR INTERNATIONAL470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubesVWR89093-192
Ethyl Alcohol, 200 ProofSigma-AldrichEX0276-1
Fear conditioning chamberCoulbourn Instruments
Insect rearing chamberDarwin ChambersINR034
Medium chain triglycerides (MCT) oilWalmart
Motion detection software (Actimetrics)Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)VWR INTERNATIONAL688161
Tobacco hormworm artificial dietCarolina Biological Supply CompanyItem # 143908Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggsCarolina Biological Supply CompanyItem # 143880Unit of 30-50

Ссылки

  1. Kaplan, J. S., Stella, N., Catterall, W. A., Westenbroek, R. E. Cannabidiol attenuates seizures and social deficits in a mouse model of Dravet syndrome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (42), 11229-11234 (2017).
  2. Leehey, M. A., et al. Safety and tolerability of cannabidiol in Parkinson Disease: An open label, dose-escalation study. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (4), 326-336 (2020).
  3. Al-Ghezi, Z. Z., Miranda, K., Nagarkatti, M., Nagarkatti, P. S. Combination of cannabinoids, delta 9- tetrahydrocannabinol and cannabidiol, ameliorates experimental multiple sclerosis by suppressing neuroinflammation through regulation of miRNA-mediated signaling pathways. Frontiers in Immunology. 10, 1921 (2019).
  4. Seltzer, E. S., Watters, A. K., MacKenzie, D., Granat, L. M., Zhang, D. Cannabidiol (CBD) as a promising anti-cancer drug. Cancers (Basel). 12 (11), 3203 (2020).
  5. Garcia-Morales, L., et al. CBD reverts the mesenchymal invasive phenotype of breast cancer cells induced by the inflammatory cytokine IL-1beta). International Journal of Molecular Sciences. 21 (7), 2429 (2020).
  6. Jeong, S., et al. Cannabidiol promotes apoptosis via regulation of XIAP/Smac in gastric cancer. Cell Death and Disease. 10 (11), 846 (2019).
  7. Devinsky, O., et al. Open-label use of highly purified CBD (Epidiolex®) in patients with CDKL5 deficiency disorder and Aicardi, Dup15q, and Doose syndromes. Epilepsy & Behavior. 86, 131-137 (2018).
  8. de la Harpe, A., Beukes, N., Frost, C. L. CBD activation of TRPV1 induces oxidative signaling and subsequent ER stress in breast cancer cell lines. Biotechnology and Applied Biochemistry. , (2021).
  9. Gasparyan, A., Navarrete, F., Manzanares, J. Cannabidiol and sertraline regulate behavioral and brain gene expression alterations in an animal model of PTSD. Frontiers in Pharmacology. 12, 694510 (2021).
  10. Aso, E., et al. Cannabidiol-enriched extract reduced the cognitive impairment but not the epileptic seizures in a Lafora disease animal model. Cannabis and Cannabinoid Research. 5 (2), 150-163 (2020).
  11. Kadam, R. A., Borde, S. U., Madas, S. A., Salvi, S. S., Limaye, S. S. Challenges in recruitment and retention of clinical trial subjects. Perspectives in Clinical Research. 7 (3), 137-143 (2016).
  12. Kaur, G., Dufour, J. M. Cell lines: Valuable tools or useless artifacts. Spermatogenesis. 2 (1), 1-5 (2012).
  13. Alves, P., Amaral, C., Teixeira, N., Correia-da-Silva, G. Cannabidiol disrupts apoptosis, autophagy and invasion processes of placental trophoblasts. Archives of Toxicology. , (2021).
  14. . Trophoblast Available from: https://en.wikipedia.org/wiki/Trophoblast (2021)
  15. Yang, Y., et al. Cannabinoids inhibited pancreatic cancer via P-21 activated kinase 1 mediated pathway. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8035 (2020).
  16. Jeong, S. Cannabidiol-induced apoptosis is mediated by activation of Noxa in human colorectal cancer cells. Cancer Letters. 447, 12-23 (2019).
  17. Capes-Davis, A., et al. Cell lines as biological models: Practical steps for more reliable research. Chemical Research in Toxicology. 32 (9), 1733-1736 (2019).
  18. Chuang, S. H., Westenbroek, R. E., Stella, N., Catterall, W. A. Combined antiseizure efficacy of cannabidiol and clonazepam in a conditional mouse model of Dravet syndrome. Journal of Experimental Neurology. 2 (2), 81-85 (2021).
  19. Orvos, P., et al. The electrophysiological effect of cannabidiol on hERG current and in guinea-pig and rabbit cardiac preparations. Scientific Reports. 10 (1), 16079 (2020).
  20. Verrico, C. D., et al. A randomized, double-blind, placebo-controlled study of daily cannabidiol for the treatment of canine osteoarthritis. Pain. 161 (9), 2191-2202 (2020).
  21. Barata, L., et al. Neuroprotection by cannabidiol and hypothermia in a piglet model of newborn hypoxic-ischemic brain damage. Neuropharmacology. 146, 1-11 (2019).
  22. Beardsley, P. M., Scimeca, J. A., Martin, B. R. Studies on the agonistic activity of delta 9-11-tetrahydrocannabinol in mice, dogs and rhesus monkeys and its interactions with delta 9-tetrahydrocannabinol. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 241 (2), 521-526 (1987).
  23. Ryan, D., McKemie, D. S., Kass, P. H., Puschner, B., Knych, H. K. Pharmacokinetics and effects on arachidonic acid metabolism of low doses of cannabidiol following oral administration to horses. Drug Testing and Analysis. 13 (7), 1305-1317 (2021).
  24. Bryda, E. C. The Mighty Mouse: The impact of rodents on advances in biomedical research. Missouri Medicine. 110 (3), 207-211 (2013).
  25. Qi, X., et al. CBD promotes oral ulcer healing via inhibiting CMPK2-mediated inflammasome. Journal of Dental Research. , (2021).
  26. Mastinu, A., et al. Prosocial effects of nonpsychotropic Cannabis sativa in mice. Cannabis and Cannabinoid Research. , (2021).
  27. Justice, M. J., Dhillon, P. Using the mouse to model human disease: increasing validity and reproducibility. Disease Models & Mechanisms. 9 (2), 101-103 (2016).
  28. Andre, R. G., Wirtz, R. A., Das, Y. T., An, C. . Insect Models for Biomedical Research. , 61-72 (1989).
  29. He, J., Tan, A. M. X., Ng, S. Y., Rui, M., Yu, F. Cannabinoids modulate food preference and consumption in Drosophila melanogaster. Scientific Reports. 11 (1), 4709 (2021).
  30. Kanost, M. R., et al. Multifaceted biological insights from a draft genome sequence of the tobacco hornworm moth, Manduca sexta. Insect Biochemistry and Molecular Biology. 76, 118-147 (2016).
  31. Park, S. H., et al. Contrasting roles of cannabidiol as an insecticide and rescuing agent for ethanol-induced death in the tobacco hornworm Manduca sexta. Scientific Reports. 9 (1), 10481 (2019).
  32. Tukey, J. W. Comparing individual means in the analysis of variance. Biometrics. 5 (2), 99-114 (1949).
  33. Mantel, N. Evaluation of survival data and two new rank order statistics arising in its consideration. Cancer Chemotherapy Reports. 50 (3), 163-170 (1966).
  34. Watts, S., Kariyat, R. Picking sides: Feeding on the abaxial leaf surface is costly for caterpillars. Planta. 253 (4), 77 (2021).
  35. McPartland, J. M., Agraval, J., Gleeson, D., Heasman, K., Glass, M. Cannabinoid receptors in invertebrates. Journal of Evolutionary Biology. 19 (2), 366-373 (2006).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

178Manduca sexta

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены