카나비노이드 전임상 연구를 위한 곤충 모델 시스템으로 담배 혼웜

요약

본 프로토콜은 카나비노이드 연구에서 담배 혼웜 만두카 sexta 를 사용하기위한 교육 정보를 제공합니다. 여기에 설명된 방법은 칸 나비 디올 (CBD) 치료에 대한 응답으로 곤충 모델의 생리적 및 행동 변화를 모니터링하는 모든 필요한 공급 및 프로토콜을 포함한다.

초록

의학에서 카나비노이드에 대한 관심이 증가함에 따라 여러 포유류 모델 유기체가 알려지지 않은 제약 기능을 해명하는 데 사용되었습니다. 그러나, 많은 어려움은 카나비노이드 연구를 위한 비 포유류 모형 유기체의 발달을 필요로 하는 포유류 연구에 남아 있습니다. 저자는 담배 뿔벌레 만두카 sexta 새로운 곤충 모델 시스템으로 제안한다. 이 프로토콜은 다양한 양의 칸 나비 디올 (CBD)으로 인공 식단을 준비하고, 재배 환경을 설정하고, CBD 치료에 대한 응답으로 생리적 및 행동 적 변화를 모니터링하는 방법에 대한 정보를 제공합니다. 간략하게, 뿔벌레 알을 수신하는 즉시, 계란은 12:12 광어두운 주기에 25°C에서 1-3 일을 허용하였고, 무작위로 제어에 분배되기 전에 부화하였다(밀 배아 계 인공 식단; AD), 차량(AD + 0.1% 중형 체인 트리글리세라이드 오일; MCT 오일) 및 치료 그룹 (AD + 0.1 % MCT + 1 mM 또는 CBD2 mM). 미디어가 준비되면, ^{1 번째} 인스타 애벌레는 나무 꼬치 스틱이있는 50 mL 테스트 튜브에 개별적으로 배치 된 다음 시험관은 치즈 천으로 덮여있었습니다. 측정은 CBD 관리에 대한 생리적 및 행동 적 반응을 위해 2 일 간격으로 수행되었습니다. 이 간단한 재배 절차는 연구원이 주어진 실험에서 큰 표본을 시험할 수 있게 합니다. 또한, 상대적으로 짧은 수명 주기는 연구원이 더 높은 포유류 모형 유기체에 있는 실험적인 디자인을 지원하는 데이터를 허용하는 동질적인 인구의 다세대에 칸 나비노이드 처리의 충격을 연구하는 것을 가능하게 합니다.

서문

지난 몇 년 동안, 대중의 관심은 간질 ¹, 파킨슨 병², 다발성 경화증 및 칸 나비 디올 (CBD)을 가진 다양한 형태의 암^4,5,6의 치료를 포함하여 치료 잠재력으로 인해 카나비노이드에 중점을 두었습니다. 대마초는 2018 년 농업 개선법에서 농업 상품으로 합법화되기 때문에, 공법 115-334 (2018 농장 법안), 대마초와 식품, 화장품 및 제약 산업의 카나비노이드 유도체는 기하 급수적으로 증가했습니다. 또한, 단일 카나비노이드 및 카나비노이드 혼합물의 임상 등급 분리는 인간 과목⁷, 세포주 ^5,8 및 다양한 동물 모델 시스템에서 성공적으로 테스트되었습니다^9,10.

임상 시험은 특정 질병에 카나비노이드의 효능과 부작용을 검증하는 데 이상적입니다. 그러나, 임상 시험에 있는 수많은 도전이 있습니다, 윤리적/IRB 승인, 모집 및 과목의 보유를 포함하여 ¹¹. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 인간 유래 세포주는 비용 효율적이고, 다루기 쉽고, 윤리적 문제를 우회할 수 있고, 세포주로서 일관되고 재현 가능한 결과를 제공하기 때문에 다양한 인간 세포주를 사용하였다.¹² 다른 세포 및 화학 물질의 교차 오염이 없는 세포의 순수한 집단이다.

Alves et al. (2021)¹³ 은 태반의 특수 세포인 태반 트로포블라스트에서 투여 의존형 방식으로 CBD를 테스트했는데, 이는 태아 이식 및 열화된 모성 자궁과의 상호 작용에 필수적인 역할을 하는 태반의 전문 세포입니다¹⁴. 그들의 결과는 CBD가 세포 생존 가능성 손실, 세포 주기 진행 중단 및 세포 세포 흡입 유도를 일으키는 원인이 되었다는 것을 보여주었습니다. 이러한 관측은 임산부에 의해 대마초 사용의 잠재적 인 부정적인 영향을 보여줍니다¹³. 마찬가지로, 일련의 세포주들은 또한 인간 질병, 특히 다양한 형태의 암에서 CBD의 약리학적 효과를 검사하는 데 사용되었습니다. 시험관 내 연구는 성공적으로 췌장¹⁵, 유방⁸ 및 대장암 세포¹⁶에서 항암 효과를 입증했습니다. 그러나, 널리 이용 가능하고 취급하기 쉬운 동안, HeLa와 같은 특정 세포주, HEK293는 그들의 성장 조건 또는 취급¹⁷에 있는 변경 때문에 유전및 표현적인 변경에 경향이 있습니다.

대마초 연구에서는 마우스¹⁸, 기니 피그¹⁹ 및 ^rabbit19와 같은 작은 동물에서 개^{20, piglet21, monkey22}, ^horse23과 같은 큰 동물에 이르기까지 다양한 동물 모델 시스템이 알려지지 않은 치료 효과를 탐구하는 데 사용되었습니다. 마우스는 인간에 대한 해부학적, 생리적, 유전적 유사성으로 인해 카나비노이드 연구를 가장 선호하는 동물 모델 시스템이었습니다²⁴. 가장 유의하게, 마우스는 인간에 있는 그들의 신경계에 있는 CB1/2 수용체가 있습니다. 그(것)들은 또한 더 쉬운 유지 보수 및 풍부한 유전 자원을 가진 인간 적인 과목 보다는 더 짧은 수명 주기가, 따라서 전체 수명 주기 내내 칸 나비 노이드의 효력을 감시하는 것이 훨씬 쉽게 만듭니다. 포유류 시스템은 널리 사용되며 CBD가 발작 장애¹, 외상 후 스트레스 장애⁹, 구강 궤양 ²⁵ 및 치매와 같은 증상을 완화한다는 것을 성공적으로 입증했습니다¹⁰. 마우스 모델은 또한 큰 동물과 인간26에서 매우 어려운 지역 사회 내에서 개인의 사회적 상호 작용 연구를 가능하게^했다26.

동물 모델 시스템의 모든 장점에도 불구하고 여전히 비용이 많이 들며 약물 투여 및 데이터 수집 중에 집중 치료가 필요합니다. 추가적으로, 실험 디자인 및 엄격²⁷에 있는 한계 때문에 불변성 및 인간 조건의 가난한 회수 때문에 연구에서 마우스를 사용하는 감시가 있습니다.

카나비노이드의 의료/전임상 연구에 대한 수요가 증가함에 따라 비 포유류 모델 시스템이 필요합니다. 무척추 동물 모델은 전통적으로 척추 동물 모델에 비해 독특한 이점을 부여했습니다. 중요한 이득은 많은 견본을 양육하고 연구원이 유전적으로 균일한 인구의 다세대 를 감시하는 가능하게 하는 용이하고 낮은 비용을 포함합니다²⁸. 최근 연구는 과일 비행을 입증, Drosophila 멜라노가스터, 공급 행동을 변조에 칸 나비 노이드의 약리적 기능을 조사하는 효과적인 곤충 모델 시스템^으로29. 곤충 모델 시스템 중, 저자는 담배 뿔벌레에 초점을 맞추고, 만두카 sexta, 또한 캐롤라이나 스핑크스 나방 또는 매 나방으로 알려진, 칸 나비 노이드 연구를위한 새로운 곤충 모델 시스템으로.

만두카 섹스타는 스핑기다의 가족에 속한다. 곤충은 미국 남부에서 가장 흔한 식물 해충으로, 그들은 천체 식물을 먹입니다. 곤충 모델은 곤충 생리학, 생화학, 신경 생물학 및 약물 상호 작용 연구에 오랜 역사를 가지고 있습니다. Manduca sexta의 연구 포트폴리오에는 필수 세포 프로세스의 분자 수준 이해를 허용하는 초안 게놈 서열이 포함되어 있습니다³⁰. 이 모델 시스템의 또 다른 중요한 이점은 18-25일 동안 의 길이가 100mm 이상, 무게는 10g에 달하는 큰 크기입니다. 큰 크기는 연구원이 CBD 치료에 대한 응답으로 실시간으로 형태학적 및 행동 변화를 쉽게 모니터링 할 수 있습니다. 또한, 크기 때문에, 전기 생리학적 반응은 고해상도 현미경 설정 없이 애벌레에서 해부된 신경을 포함하여 복부 신경계로 검토되었다. 독특한 기능을 통해 연구자들은 투여된 카나비노이드(들)에 대한 급성 및 장기 반응을 쉽게 조사할 수 있습니다.

이러한 다양성에도 불구하고, M. sexta는 최근에 대마초와 카나비노이드 연구에 대한 실험 모델로의 적합성에 대한 탐구되었습니다. 2019년, 저자는 대마초가 곤충 초식 동물^30,31로부터 자신을 보호하기 위해 Cannabidiol을 생산하기 위해 진화했다는 가설을 해결하기 위해 처음으로 곤충 모델 시스템을 사용했다. 그 결과 식물이 CBD를 먹이 억제책으로 악용하고 해충 곤충 M. sexta 애벌레의 성장을 억제하고 사망률 증가를 유발하는 것으로 나타났습니다³¹. 이 연구는 또한 CBD의 캐리어로서 에탄올의 잠재적 인 차량 효과를 식별하는 술에 취한 에탄올 애벌레에 CBD의 구출 효과를 입증했습니다. 도시된 바와 같이, 곤충 모델 시스템은 다른 동물 시스템에 보다 적은 인건비와 비용으로 3-4 주 이내에 칸 나비 노이드의 치료 효과를 효과적으로 조사했다. 곤충 모델은 카나비노이드 수용체 (즉, CB1/2 수용체 없음)가 부족하지만, 모델 시스템은 카나비노이드 수용체 독립적 인 방식을 통해 칸 나비 노이드의 약리적 역할을 이해하는 귀중한 도구를 제공합니다.

이 연구의 저자는 이전에 카나비노이드 연구를위한 모델 시스템으로 담배 hornworm와 함께 일^{했습니다31}. M. sexta를 사용하는 이점과 위험을 신중하게 고려한 후, 우리는 미래의 전임상 실험실 사용을 위한 기회를 허용하는 전임상 시험을 위한 식단의 적절한 관리 및 준비와 관련된 방법을 제공했습니다.

프로토콜

1. 혼웜 제제 및 칸나비디올 치료

1. 150-200 실행 가능한 M을 가져옵니다. sexta 계란과 밀 배아 기반 인공 식단 ( 재료의 표 참조).
2. 혼웜 알을 밀 배아 기반 인공 식단(AD) 층으로 폴리스티렌 페트리 접시에 넣고 달걀을 40%-60%의 상대 습도로 25°C에서 유지한 곤충 사육챔버( 재료표 참조)로 옮긴다.
3. 담배 뿔벌레 알을 1-3일 동안 허용하여 상대 습도가 40%-60%로 25°C에서 유지되는 곤충 사육실 내부를 부화시도록 한다.
4. 칸 나비 디올 (CBD) 재고 솔루션 (200 mM)을 추가하여 1.26 g의 >98 % 순도 CBD는 EtOH (200 증거) 또는 100 % 중형 체인 트리글리세라이드 (MCT) 오일 ( 재료 표 참조)의 20mL로 분리합니다.
   참고 : CBD 격리는 빛에 민감하므로 어두운 에서 처리하십시오.
5. 200mM CBD 주식 솔루션의 5 mL 및 10 mL을 AD 1,000 g에 추가하여 각각 CBD의 다이어트 1 mM 및 2 mMM의 최종 농도를 가져옵니다.
   참고 : 완전히 균일 한 혼합물이 형성 될 때까지 식이 요법과 CBD 주식 솔루션이 잘 혼합되어 있는지 확인하십시오. CBD 의 재고가 들어있는 AD를 비닐 봉지에 45 분 이상 손으로 혼합하십시오.
   주의: 커피 믹서 또는 다른 금속 분쇄기 는 효과가 없는 것으로 나타났습니다.
6. 3개의 미디어, 제어(AD), 차량(EtOH 또는 MCT 오일의 AD + 0.1%) 및 CBD(EtOH 또는 MCT 오일의 0.1% + CBD의 1mM/2 mMMM)를 50mL 튜브 의 바닥으로 분배합니다.
7. 50mL 테스트 튜브에 개별적으로 1번째 인스타 애벌레(~2mm 길이)를 무작위로 분배하고 천공된 뚜껑이나 치즈클로스로 덮 습니다(재료표 참조).
   참고: 튜브를 거꾸로 놓고 곤충을 40%-60%의 상대 습도로 25°C 유지한 곤충 사육실에서 재배합니다.
8. 12h 빛/어두운 주기로 25°C에서 유지되는 곤충 사육실 내부( 재료 표 참조)에서 자랍니다.

2 . M. sexta 애벌레 성장, 다이어트 소비 및 사망률 측정

1. 포이션이 강화된 외피성 층의 어두운 갈색 색으로 인식될 때까지 개별 용기로 옮겨진 후 2일 간격으로 분석 밸런스 및 사망률로 애벌레 성장(즉, 크기 및 중량)을 측정한다.
   1. 각 애벌레 그룹의 초기 질량(그램)을 각각의 식단에 도입하기 전에 유충의 질량을 기록하고 애벌레가 새끼 단계를 완료할 때까지 애벌레 발달 단계 사이의 질량 이득을 결정하기 위해 초기 질량에서 각 측정에서 애벌레의 질량을 빼는다.
   2. 각 식단에 새끼까지 애벌레 성장 단계 사이의 발달 기간의 차이를 이해하기 위해 인스타 발달 단계 사이의 일 수를 기록합니다.
      참고: 금형 오염을 방지하기 위해 용기에서 배설물을 긁어냅니다. 실험 목적에 따라 향후 테스트(예: CBD 누적 비율 계산, 미생물 프로파일링)에 따라 문제를 수집합니다. 다각증 또는 자궁 근증의 깨지기 쉬운 기간 동안 곤충을 조심스럽게 처리하는 것이 중요합니다. 용기에서 애벌레를 꺼내는 경우, 곤충의 본체를 평평한 끝과 넓은 집게로 부드럽게 잡고 곤충이 흘리는 과정에서 피부의 외부 층을 제거하도록 강요하지 않습니다.
2. 1^차 내항애와 새끼 사이의 용기의 다이어트 손실을 계량하여 다이어트 소비³¹을 측정합니다. 실험 의 시작 부분에 다이어트의 초기 그램을 기록하고 애벌레가 완전한 새끼 단계에 들어갔을 때 다이어트의 나머지 양에서 초기 금액을 빼.
   참고: 대변은 식단 측정에서 제외되어야 합니다. 배설물 및 기타 파편(즉, 피부 창고)은 용기를 거꾸로 배치하여 미디어에서 쉽게 제거할 수 있습니다.
3. 이동성 측정을 위해, 대상 곤충이 챔버 환경을 최소 5분 이상 수용하고 5^번째 인스타 곤충(길이 80-100mm)의 3개 그룹이 자동화된 전산화된 공포 컨디셔닝 챔버를 사용하여 이동한 거리³¹을 추적할 수 있도록 허용한다(재료표 참조).
4. 모션 인덱스를 생성하는 모션 감지 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 60프레임/s의 비디오 녹화^{를 통해 이동성} 반응을 분석합니다.

3. 통계 분석

1. Tukey의 사후 테스트³²를 통해 애벌레 성장(즉, 크기 및 중량)과 모션 인덱스의 차이를 일방적으로 ANOVA로 분석합니다.
2. 서바이벌 곡선 비교를 위해 로그 랭크(Mantel-Cox) ^test33 을 사용합니다.
   참고: 모든 통계 분석은 통계 분석 소프트웨어를 사용하여 수행되었습니다( 재료 표 참조).

결과

칸 나비 노이드 독성을 검사하는 모델 시스템으로 만두카 sexta
그림 1 은 담배 혼벌레 만두카 sexta를 사용하여 CBD 실험의 주요 구성 요소를 묘사한다. 곤충의 큰 숫자 (>20)는 개별적으로 12 시간 :12 h = 빛 : 어두운 주기에 25 ° C에서 사육되었다. 곤충의 크기, 무게 및 사망률은 고용량 CBD (2 mM) 치료 후 단기 및 장기 응답을 모니터링하기 ?...

토론

수유 연구는 CBD (2 mM)의 고용량이 곤충의 성장을 억제하고 사망률을 증가시켰다는 것을 보여 주었다³¹. 곤충 모델은 또한 에탄올에 대한 민감성을 보였다; 그러나 CBD는 에탄올 독성을 효과적으로 취화하여 생존율, 식이 소비 및 식품 검색 행동을 대조군과 유사한 수준으로 증가시켰습니다(그림 3A, B)³¹. 설명된 곤충 모델 시스템...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytic balance	Mettler Instrument Corp.	AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)	Lilu's Garden
Cheesecloth	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes	VWR	89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	EX0276-1
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber	Darwin Chambers	INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil	Walmart
Motion detection software (Actimetrics)	Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)	VWR INTERNATIONAL	688161
Tobacco hormworm artificial diet	Carolina Biological Supply Company	Item # 143908	Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs	Carolina Biological Supply Company	Item # 143880	Unit of 30-50