Tabakhornwurm als Insektenmodellsystem für präklinische Cannabinoid-Studien

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll enthält Anleitungsinformationen für die Verwendung des Tabakhornwurms Manduca sexta in der Cannabinoidforschung. Die hier beschriebene Methode umfasst alle notwendigen Vorräte und Protokolle zur Überwachung physiologischer und Verhaltensänderungen des Insektenmodells als Reaktion auf die Behandlung mit Cannabidiol (CBD).

Zusammenfassung

Mit zunehmender Aufmerksamkeit für Cannabinoide in der Medizin wurden mehrere Modellorganismen von Säugetieren verwendet, um ihre unbekannten pharmazeutischen Funktionen aufzuklären. In der Säugetierforschung bleiben jedoch viele Schwierigkeiten bestehen, die die Entwicklung von Nicht-Säugetier-Modellorganismen für die Cannabinoidforschung erfordern. Die Autoren schlagen den Tabakhornwurm Manduca sexta als neuartiges Insektenmodellsystem vor. Dieses Protokoll enthält Informationen zur Vorbereitung der künstlichen Diät mit unterschiedlichen Mengen an Cannabidiol (CBD), zur Einrichtung einer Anbauumgebung und zur Überwachung ihrer physiologischen und Verhaltensänderungen als Reaktion auf die CBD-Behandlung. Kurz gesagt, nach Erhalt der Hornwurmeier durften die Eier 1-3 Tage bei 25 ° C in einem 12:12-Hell-Dunkel-Zyklus schlüpfen, bevor sie zufällig in die Kontrolle verteilt wurden (Weizenkeim-basierte künstliche Diät; AD), Vehikel (AD + 0,1% mittelkettiges Triglyceridöl; MCT-Öl) und Behandlungsgruppen (AD + 0,1% MCT + 1 mM oder 2 mM CBD). Sobald das Medium vorbereitet war, wurden die Larven des 1^. Stadiums einzeln mit einem Holzspieß in ein 50-ml-Reagenzglas gegeben, und dann wurde das Reagenzglas mit einem Käsetuch bedeckt. Die Messungen wurden in 2-Tage-Intervallen für physiologische und Verhaltensreaktionen auf die CBD-Verabreichung durchgeführt. Dieses einfache Kultivierungsverfahren ermöglicht es den Forschern, große Proben in einem bestimmten Experiment zu testen. Darüber hinaus ermöglichen die relativ kurzen Lebenszyklen den Forschern, die Auswirkungen von Cannabinoidbehandlungen über mehrere Generationen einer homogenen Population zu untersuchen, so dass Daten ein experimentelles Design in höheren Säugetiermodellorganismen unterstützen können.

Einleitung

In den letzten Jahren konzentrierte sich die öffentliche Aufmerksamkeit auf Cannabinoide aufgrund ihres therapeutischen Potenzials, einschließlich der Behandlung von ^Epilepsie1, ^{Parkinson-Krankheit2}, Multipler Sklerose3 und verschiedenen Krebsarten4,5,6 mit Cannabidiol (CBD). Seit Cannabis im Agricultural Improvement Act von 2018, Public Law 115-334 (farm bill 2018), als landwirtschaftliche Ware legalisiert ist, haben Cannabis und seine Cannabinoid-Derivate in der Lebensmittel-, Kosmetik- und Pharmaindustrie exponentiell zugenommen. Darüber hinaus wurden Isolate einzelner Cannabinoide und Cannabinoidmischungen in klinischer Qualität erfolgreich an menschlichen ^Probanden7, ^{Zelllinien5,8} und verschiedenen Tiermodellsystemen ^getestet9,10.

Eine klinische Studie wäre ideal, um die Wirksamkeit und die Nebenwirkungen von Cannabinoiden auf eine bestimmte Krankheit zu validieren. Es gibt jedoch zahlreiche Herausforderungen in klinischen Studien, einschließlich ethischer/IRB-Zulassung, Rekrutierung und Bindung der ^Probanden11. Um diese Hürden zu überwinden, wurden verschiedene menschliche Zelllinien verwendet, da vom Menschen stammende Zelllinien kostengünstig und einfach zu handhaben sind, die ethischen Probleme umgehen können und konsistente und reproduzierbare Ergebnisse liefern, da die Zelllinien eine "reine Population von Zellen sind, die keine Kreuzkontamination anderer Zellen und Chemikalien aufweisen"¹².

Alves et al. (2021)¹³ testeten CBD dosisabhängig in den Plazenta-Trophoblasten, spezialisierten Zellen der Plazenta, die eine wesentliche Rolle bei der Embryonenimplantation und interaktion mit der dezidualisierten mütterlichen Gebärmutter ^spielen14. Ihre Ergebnisse zeigten, dass CBD den Verlust der Zelllebensfähigkeit, die Störung der Zellzyklusprogression und die Apoptose-Induktion verursachte. Diese Beobachtungen zeigen die potenziellen negativen Auswirkungen des Cannabiskonsums durch schwangere ^Frauen13. Ebenso wurde eine Reihe von Zelllinien verwendet, um die pharmakologischen Wirkungen von CBD bei menschlichen Krankheiten, insbesondere verschiedenen Krebsarten, zu untersuchen. Die In-vitro-Studien zeigten erfolgreich krebshemmende Wirkungen in ^{Bauchspeicheldrüsen-15}-, ^Brust-8- und Darmkrebszellen16. Spezifische Zelllinien wie HeLa, HEK293 sind zwar weit verbreitet und einfach zu handhaben, aber anfällig für genetische und phänotypische Veränderungen aufgrund von Veränderungen ihrer Wachstumsbedingungen oder ^handhabung17.

In der Cannabisforschung wurden verschiedene Tiermodellsysteme, von Kleintieren wie ^Maus18, Meerschweinchen19 und ^Kaninchen19 bis hin zu großen Tieren wie ^Canine20, ^Ferkel21, ^Affe22, ^Pferd23, verwendet, um unbekannte therapeutische Wirkungen zu erforschen. Mäuse waren aufgrund ihrer anatomischen, physiologischen und genetischen Ähnlichkeit mit dem Menschen das am meisten bevorzugte Tiermodellsystem für die ^{Cannabinoidforschung24}. Am wichtigsten ist, dass Mäuse CB1/2-Rezeptoren in ihrem Nervensystem haben, die beim Menschen vorhanden sind. Sie haben auch einen kürzeren Lebenszyklus als menschliche Probanden, mit einfacherer Wartung und reichlich vorhandenen genetischen Ressourcen, wodurch es viel einfacher wird, die Auswirkungen von Cannabinoiden während eines gesamten Lebenszyklus zu überwachen. Das Säugetiersystem ist weit verbreitet und hat erfolgreich gezeigt, dass CBD Anfallsleiden1, posttraumatische ^{Belastungsstörungen9}, orale ^Geschwüre25 und demenzähnliche ^Symptome10 lindert. Das Mausmodell hat auch eine Studie zur sozialen Interaktion von Individuen innerhalb einer Gemeinschaft ermöglicht, die bei großen Tieren und Menschen äußerst schwierig ^ist26.

Trotz aller Vorteile des Tiermodellsystems ist es immer noch kostspielig und erfordert intensive Pflege bei der Verabreichung von Medikamenten und der Datenerhebung. Darüber hinaus wird die Verwendung von Mäusen in der Forschung aufgrund von Unreproduzierbarkeit und schlechter Rekapitulation menschlicher Bedingungen aufgrund von Einschränkungen im experimentellen Design und in der Strenge ^untersucht27.

Mit der steigenden Nachfrage nach medizinischen/präklinischen Studien zu Cannabinoiden wird ein Modellsystem für Nicht-Säugetiere benötigt. Wirbellose Modelle boten traditionell deutliche Vorteile gegenüber Wirbeltiermodellen. Zu den wesentlichen Vorteilen gehören die einfache und niedrige Kosten der Aufzucht vieler Exemplare und die Möglichkeit für Forscher, mehrere Generationen genetisch homogener Populationen zu ^{überwachen28}. Eine kürzlich durchgeführte Studie bewies, dass die Fruchtfliege , Drosophila melanogaster, ein wirksames Insektenmodellsystem ist, um pharmakologische Funktionen von Cannabinoiden bei der Modulation des Fressverhaltens zu ^{untersuchen29}. Unter den Insektenmodellsystemen konzentrierten sich die Autoren auf den Tabakhornwurm Manduca sexta, auch bekannt als Carolina-Sphinxmotte oder Falkenmotte, als neuartiges Insektenmodellsystem für die Cannabinoidforschung.

Manduca sexta gehört zur Familie der Schwärmer (Sphingidae). Das Insekt ist der häufigste Pflanzenschädling im Süden der Vereinigten Staaten, wo sie sich von Nachtschattengewächsen ernähren. Das Insektenmodell hat eine lange Geschichte in der Forschung in der Insektenphysiologie, Biochemie, Neurobiologie und Arzneimittelwechselwirkungsstudien. Das Forschungsportfolio von Manduca sexta umfasst einen Entwurf der Genomsequenz, der ein Verständnis wesentlicher zellulärer Prozesse auf molekularer Ebene ^{ermöglicht30}. Ein weiterer entscheidender Vorteil dieses Modellsystems ist seine Größe, die in den 18-25 Tagen der Larvenentwicklung mehr als 100 mm Länge und 10 g Gewicht erreicht. Die große Größe ermöglicht es den Forschern, morphologische und Verhaltensänderungen in Echtzeit als Reaktion auf die CBD-Behandlung einfach zu überwachen. Aufgrund der Größe wurden auch elektrophysiologische Reaktionen mit dem abdominalen Nervensystem untersucht, einschließlich Ganglien, die von den Larven ohne hochauflösende Mikroskopeinstellungen seziert wurden. Die einzigartige Funktion ermöglicht es den Forschern, akute und langfristige Reaktionen auf die verabreichten Cannabinoide leicht zu untersuchen.

Trotz dieser Vielseitigkeit wurde M. sexta erst vor kurzem auf seine Eignung als experimentelles Modell für Cannabis- und Cannabinoidstudien untersucht. Im Jahr 2019 verwendeten die Autoren das Insektenmodellsystem zum ersten Mal, um die Hypothese zu behandeln, dass Cannabis sich entwickelt hat, um Cannabidiol zu produzieren, um sich vor Insektenfressern zu ^{schützen30,31}. Das Ergebnis zeigte deutlich, dass die Pflanzen CBD als Nahrungsabschreckung nutzten und das Wachstum des Schädlingsinsekts M. sexta raupe hemmten sowie eine erhöhte Mortalität ^{verursachten31}. Die Studie zeigte auch die rettende Wirkung von CBD auf berauschte Ethanollarven und identifizierte den potenziellen Vehikeleffekt von Ethanol als Träger des CBD. Wie gezeigt, untersuchte das Insektenmodellsystem effektiv die therapeutischen Wirkungen von Cannabinoiden innerhalb von 3-4 Wochen mit weniger Arbeit und Kosten als andere Tiersysteme. Obwohl dem Insektenmodell Cannabinoidrezeptoren fehlen (d.h. keine CB1/2-Rezeptoren), bietet das Modellsystem ein wertvolles Werkzeug, um die pharmakologischen Rollen von Cannabinoiden auf cannabinoidrezeptorunabhängige Weise zu verstehen.

Die Autoren dieser Studie haben zuvor mit dem Tabakhornwurm als Modellsystem für die Cannabinoidforschung ^gearbeitet31. Nach sorgfältiger Abwägung der Vorteile und Risiken der Anwendung von M. sexta haben wir eine Methode zur Verfügung gestellt, die die richtige Pflege und Vorbereitung der Ernährung für präklinische Studien beinhaltet und Möglichkeiten für den zukünftigen präklinischen Laboreinsatz bietet.

Protokoll

1. Hornwurmpräparation und Cannabidiol-Behandlung

1. Erhalten Sie 150-200 lebensfähige M. Sexta-Eier und weizenkeimbasierte künstliche Diäten (siehe Materialtabelle).
2. Legen Sie die Hornwurmeier in eine Polystyrol-Petrischale mit einer weizenkeimbasierten künstlichen Diätschicht (AD) und übertragen Sie die Eier in eine Insektenaufzuchtkammer (siehe Materialtabelle), die bei 25 ° C mit 40% -60% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wird.
3. Lassen Sie Tabakhornwurmeier 1-3 Tage lang in der Insektenaufzuchtkammer schlüpfen, die bei 25 ° C mit 40% -60% relativer Luftfeuchtigkeit gehalten wird.
4. Bereiten Sie Cannabidiol (CBD) -Stammlösung (200 mM) vor, indem Sie 1,26 g CBD-Isolat mit >98% Reinheit in 20 ml EtOH (200 Proof) oder 100% mittelkettiges Triglyceridöl (MCT) hinzufügen (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: CBD-Isolat ist lichtempfindlich, also bei Dunkelheit handhaben.
5. Fügen Sie 5 ml und 10 ml der 200 mM CBD-Stammlösung zu den 1.000 g AD hinzu, um die endgültigen Konzentrationen der Diäten 1 mM bzw. 2 mM CBD zu erhalten.
   HINWEIS: Stellen Sie sicher, dass die Diät und die CBD-Brühenlösung gut gemischt sind, bis eine vollständig homogene Mischung gebildet wird. Mischen Sie den AD-haltigen CBD-Bestand für mindestens 45 Minuten von Hand in eine Plastiktüte.
   ACHTUNG: Kaffeemischer oder jede andere Metallmühle schien unwirksam zu sein.
6. Geben Sie 20 g der drei Medien, Kontrolle (AD), Vehikel (AD + 0,1% EtOH- oder MCT-Öl) und CBD-haltige Medien (AD + 0,1% EtOH- oder MCT-Öl + 1 mM/2 mM CBD) an den Boden des 50-ml-Röhrchens ab.
7. 1. Larven (~2 mm lang) nach dem Zufallsprinzip einzeln in einem 50 ml Reagenzglas verteilen und mit einem perforierten Deckel oder Käsetuch abdecken (siehe Materialtabelle).
   HINWEIS: Stellen Sie die Röhre auf den Kopf und züchten Sie Insekten in einer Insektenaufzuchtkammer, die 25 ° C mit 40% -60% relativer Luftfeuchtigkeit aufrechterhalten wird.
8. Züchten Sie sie in einer Insektenaufzuchtkammer (siehe Materialtabelle), die bei 25 ° C mit einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Stunden gehalten wird.

2. M. sexta Larvenwachstum, Nahrungsaufnahme und Mortalitätsmessungen

1. Messen Sie das Larvenwachstum (d. H. Größe und Gewicht) mit einer Analysenwaage und Mortalität in 2-Tages-Intervallen nach dem Transfer in einzelne Behälter, bis die Verpuppung als dunkelbraune Färbung einer gehärteten Exokutikulaschicht erkannt wird.
   1. Notieren Sie die Anfangsmasse (in Gramm) jeder Larvengruppe, bevor Sie die Larven in ihre jeweilige Ernährung einführen, und subtrahieren Sie die Masse der Larven bei jeder Messung von der Anfangsmasse, um die Massenzuwächse zwischen den Entwicklungsstadien der Larven zu bestimmen, bis die Larven das Verpuppungsstadium abgeschlossen haben.
   2. Notieren Sie die Anzahl der Tage zwischen den Entwicklungsstadien des Stadiums, um Unterschiede im Entwicklungszeitraum zwischen den Stadien des Larvenwachstums bis zur Verpuppung auf jeder Diät zu verstehen.
      HINWEIS: Kratzen Sie die Fäkalien aus dem Behälter ab, um Schimmelpilzkontamination zu vermeiden. Sammeln Sie die Materie für zukünftige Tests in Abhängigkeit von Experimentzwecken (z. B. Berechnung der CBD-Akkumulationsrate, mikrobielle Profilerstellung). Es ist wichtig, das Insekt während der fragilen Perioden der Apolyse oder Ekdysis sorgfältig zu behandeln. Wenn Sie die Larven aus einem Behälter entnehmen, greifen Sie vorsichtig den Hauptkörper des Insekts mit einer flachen Spitze und einer breiten Pinzette und zwingen Sie nicht, die äußere Hautschicht zu entfernen, wenn ein Insekt gerade abgeworfen wird.
2. Messen Sie den ^{Futterverbrauch31} , indem Sie den Futterverlust des Behälters zwischen 1^. Larven und Verpuppung wiegen. Notieren Sie die ersten Gramm Diät zu Beginn des Experiments und ziehen Sie die anfängliche Menge von der verbleibenden Futtermenge ab, wenn die Larven in das vollständige Verpuppungsstadium eingetreten sind.
   HINWEIS: Die Fäkalien sollten von der Diätmessung ausgeschlossen werden. Die Fäkalien und andere Ablagerungen (z. B. Hautschuppen) können leicht aus dem Medium entfernt werden, indem der Behälter auf den Kopf gestellt wird.
3. Lassen Sie das betroffene Insekt für Mobilitätsmessungen mindestens 5 Minuten lang die Kammerumgebung akklimatisieren und verfolgen Sie die ^{Entfernungen31} , die drei Gruppen von Insekten des 5^. Stadiums (80-100 mm Länge) mit einer automatisierten, computergestützten Angstkonditionierungskammer zurücklegten (siehe Materialtabelle).
4. Analysieren Sie die ^{Mobilitätsreaktion31} durch Video, das 60 Bilder/s für 5 Minuten mit einer Bewegungserkennungssoftware (siehe Materialtabelle) aufgezeichnet wurde, die einen Bewegungsindex generiert.

3. Statistische Auswertung

1. Analysieren Sie die Unterschiede im Larvenwachstum (d. h. Größe und Gewicht) und den Bewegungsindex durch Einweg-ANOVA mit Tukeys Post-Test32.
2. Verwenden Sie den log-rank (Mantel-Cox) ^Test33 für Überlebenskurvenvergleiche.
   ANMERKUNG: Alle statistischen Analysen wurden mit einer statistischen Analysesoftware durchgeführt (siehe Materialtabelle).

Ergebnisse

Manduca sexta als Modellsystem zur Untersuchung der Toxizität von Cannabinoiden
Abbildung 1 zeigt die Schlüsselkomponenten des CBD-Experiments mit dem Tabakhornwurm Manduca sexta. Eine große Anzahl von Insekten (>20) wurde einzeln bei 25 °C auf einem 12 h:12 h = Hell:Dunkel-Zyklus aufgezogen. Die Größe, das Gewicht und die Mortalität der Insekten wurden in 2-Tage-Intervallen gemessen, um kurz- und langfristige Reaktionen nach eine...

Diskussion

Die Fütterungsstudie zeigte, dass hohe Dosen von CBD (2 mM) das Wachstum des Insekts hemmten und die Mortalität ^erhöhten31. Das Insektenmodell zeigte auch eine Empfindlichkeit gegenüber Ethanol; CBD entgiftete jedoch effektiv die Ethanoltoxizität und erhöhte ihre Überlebensrate, ihren Nahrungskonsum und ihr Lebensmittelsuchverhalten auf ein ähnliches Niveau wie die Kontrollgruppe (Abbildung 3A,B)³¹. Das beschriebene Ins...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytic balance	Mettler Instrument Corp.	AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)	Lilu's Garden
Cheesecloth	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes	VWR	89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	EX0276-1
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber	Darwin Chambers	INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil	Walmart
Motion detection software (Actimetrics)	Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)	VWR INTERNATIONAL	688161
Tobacco hormworm artificial diet	Carolina Biological Supply Company	Item # 143908	Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs	Carolina Biological Supply Company	Item # 143880	Unit of 30-50