El gusano del cuerno del tabaco como sistema modelo de insectos para estudios preclínicos de cannabinoides

Resumen

El presente protocolo proporciona información instructiva para el uso del gusano del tabaco Manduca sexta en la investigación de cannabinoides. El método descrito aquí incluye todos los suministros y protocolos necesarios para monitorear los cambios fisiológicos y de comportamiento del modelo de insecto en respuesta al tratamiento con cannabidiol (CBD).

Resumen

Con una mayor atención a los cannabinoides en la medicina, se han utilizado varios organismos modelo de mamíferos para dilucidar sus funciones farmacéuticas desconocidas. Sin embargo, siguen existiendo muchas dificultades en la investigación con mamíferos, lo que requiere el desarrollo de organismos modelo no mamíferos para la investigación de cannabinoides. Los autores sugieren el gusano del tabaco Manduca sexta como un nuevo sistema modelo de insectos. Este protocolo proporciona información sobre la preparación de la dieta artificial con cantidades variables de cannabidiol (CBD), la creación de un entorno de cultivo y el monitoreo de sus cambios fisiológicos y de comportamiento en respuesta al tratamiento con CBD. Brevemente, al recibir los huevos de gusano del cuerno, a los huevos se les permitió 1-3 días a 25 ° C en un ciclo de luz-oscuridad de 12:12 para eclosionar antes de ser distribuidos al azar en el control (dieta artificial basada en germen de trigo; AD), vehículo (AD + 0.1% aceite de triglicéridos de cadena media; Aceite MCT) y grupos de tratamiento (AD + 0,1% MCT + 1 mM o 2 mM de CBD). Una vez que se preparó el medio, las larvas de ^1st instar se colocaron individualmente en un tubo de ensayo de 50 ml con un palo de pincho de madera, y luego el tubo de ensayo se cubrió con una gasa. Las mediciones se tomaron en intervalos de 2 días para las respuestas fisiológicas y conductuales a la administración de CBD. Este sencillo procedimiento de cultivo permite a los investigadores probar muestras grandes en un experimento determinado. Además, los ciclos de vida relativamente cortos permiten a los investigadores estudiar el impacto de los tratamientos con cannabinoides en múltiples generaciones de una población homogénea, lo que permite que los datos respalden un diseño experimental en organismos modelo de mamíferos superiores.

Introducción

En los últimos años, la atención pública se ha centrado en los cannabinoides debido a su potencial terapéutico, incluyendo el tratamiento de la ^epilepsia1, la enfermedad de ^Parkinson2, la esclerosis ^múltiple3 y diversas formas de cáncer4,5,6 con cannabidiol (CBD). Desde que el cannabis se legalizó como un producto agrícola en la Ley de Mejora Agrícola de 2018, la Ley Pública 115-334 (la Ley Agrícola de 2018), el cannabis y sus derivados cannabinoides en las industrias alimentaria, cosmética y farmacéutica han aumentado exponencialmente. Además, se han probado con éxito aislados de grado clínico de cannabinoides individuales y mezclas de cannabinoides en sujetos ^humanos7, líneas ^celulares5,8 y diversos sistemas de modelos ^animales9,10.

Un ensayo clínico sería ideal para validar la eficacia y los efectos adversos de los cannabinoides en una enfermedad específica. Sin embargo, existen numerosos desafíos en los ensayos clínicos, incluida la aprobación ética / IRB, el reclutamiento y la retención de los ^sujetos11. Para superar estos obstáculos, se utilizaron varias líneas celulares humanas porque las líneas celulares derivadas de humanos son rentables, fáciles de manejar, pueden eludir los problemas éticos y proporcionar resultados consistentes y reproducibles, ya que las líneas celulares son una "población pura de células que no tienen contaminación cruzada de otras células y productos químicos"¹².

Alves et al. (2021)¹³ probaron el CBD de manera dosis-dependiente en los trofoblastos placentarios, que son células especializadas de la placenta que desempeñan un papel esencial en la implantación embrionaria y la interacción con el útero materno decidualizado14. Sus resultados mostraron que el CBD causó pérdida de viabilidad celular, interrupción de la progresión del ciclo celular e inducción de la apoptosis. Estas observaciones demuestran los posibles impactos negativos del consumo de Cannabis por parte de las mujeres embarazadas13. Del mismo modo, también se utilizaron una serie de líneas celulares para examinar los efectos farmacológicos del CBD en enfermedades humanas, en particular, diversas formas de cáncer. Los estudios in vitro demostraron con éxito efectos anticancerígenos en células de cáncer de ^páncreas15, ^mama8 y ^{colorrectal16}. Sin embargo, aunque están ampliamente disponibles y son fáciles de manejar, las líneas celulares específicas como HeLa, HEK293 son propensas a cambios genéticos y fenotípicos debido a alteraciones en sus condiciones de crecimiento o ^manejo17.

En la investigación del cannabis, se han utilizado varios sistemas de modelos animales, que van desde animales pequeños como el ^ratón18, el conejillo ^{de indias19 y el conejo19} hasta animales grandes como canino20, lechón21, ^{mono22, caballo23}, para explorar efectos terapéuticos desconocidos. Los ratones han sido el sistema modelo animal preferido para la investigación de cannabinoides debido a su similitud anatómica, fisiológica y genética con los ^humanos24. Lo más significativo es que los ratones tienen receptores CB1/2 en su sistema nervioso, que están presentes en los humanos. También tienen un ciclo de vida más corto que los sujetos humanos, con un mantenimiento más fácil y abundantes recursos genéticos, lo que hace que sea mucho más fácil monitorear los efectos de los cannabinoides a lo largo de todo un ciclo de vida. El sistema de mamíferos es ampliamente utilizado y ha demostrado con éxito que el CBD alivia los trastornos convulsivos1, el trastorno de estrés postraumático9, las úlceras ^orales25 y los síntomas similares ^{a la demencia10}. El modelo de ratón también ha permitido un estudio de interacción social de individuos dentro de una comunidad que es extremadamente difícil en animales grandes y ^humanos26.

A pesar de todas las ventajas del sistema de modelo animal, sigue siendo costoso y requiere cuidados intensivos durante la administración de medicamentos y la recopilación de datos. Además, existe un escrutinio del uso de ratones en la investigación debido a la irreproducibilidad y la mala recapitulación de las condiciones humanas debido a las limitaciones en el diseño experimental y el ^rigor27.

Con la creciente demanda de estudios médicos / preclínicos de cannabinoides, se necesita un sistema modelo no mamífero. Los modelos de invertebrados tradicionalmente conferían beneficios distintivos sobre los modelos de vertebrados. Los beneficios significativos incluyen la facilidad y el bajo costo de criar muchos especímenes y permitir a los investigadores monitorear múltiples generaciones de poblaciones genéticamente ^{homogéneas28}. Un estudio reciente demostró que la mosca de la fruta, Drosophila melanogaster, es un sistema modelo de insecto eficaz para investigar las funciones farmacológicas de los cannabinoides en la modulación de los comportamientos de ^{alimentación29}. Entre los sistemas modelo de insectos, los autores se centraron en el gusano del tabaco, Manduca sexta, también conocido como polilla de la esfinge de Carolina o polilla halcón, como un nuevo sistema modelo de insecto para la investigación de cannabinoides.

Manduca sexta pertenece a la familia de los Sphingidae. El insecto es la plaga de plantas más común en el sur de los Estados Unidos, donde se alimentan de plantas solanáceas. El modelo de insecto tiene una larga historia en la investigación en fisiología de insectos, bioquímica, neurobiología y estudios de interacción farmacológica. La cartera de investigación de Manduca sexta incluye un borrador de secuencia genómica, lo que permite una comprensión a nivel molecular de los procesos celulares ^esenciales30. Otro beneficio crucial de este sistema modelo es su gran tamaño, alcanzando más de 100 mm de longitud y 10 g de peso en los 18-25 días de desarrollo larvario. El gran tamaño permite a los investigadores monitorear fácilmente los cambios morfológicos y de comportamiento en tiempo real en respuesta al tratamiento con CBD. Además, debido al tamaño, se examinaron las respuestas electrofisiológicas con el sistema nervioso abdominal, incluidos los ganglios diseccionados de las larvas sin ajustes de microscopio de alta resolución. La característica única permite a los investigadores investigar fácilmente las respuestas agudas y a largo plazo a los cannabinoides administrados.

A pesar de tal versatilidad, M. sexta ha sido explorada recientemente por su idoneidad como modelo experimental para estudios de cannabis y cannabinoides. En 2019, los autores utilizaron el sistema modelo de insectos por primera vez para abordar la hipótesis de que el cannabis ha evolucionado para producir cannabidiol para protegerse de los insectos herbívoros30,31. El resultado mostró claramente que las plantas explotaron el CBD como elemento disuasorio de alimentación e inhibieron el crecimiento del insecto plaga M. sexta oruga, además de causar un aumento de la ^mortalidad31. El estudio también demostró los efectos de rescate del CBD a las larvas de etanol intoxicadas, identificando el posible efecto vehicular del etanol como portador del CBD. Como se muestra, el sistema modelo de insectos investigó efectivamente los efectos terapéuticos de los cannabinoides en 3-4 semanas con menos mano de obra y costos que otros sistemas animales. Aunque el modelo de insecto carece de receptores cannabinoides (es decir, no hay receptores CB1/2), el sistema modelo proporciona una herramienta valiosa para comprender las funciones farmacológicas de los cannabinoides a través de una manera independiente del receptor cannabinoide.

Los autores de este estudio han trabajado previamente con el gusano del tabaco como sistema modelo para la investigación de ^{cannabinoides31}. Después de una cuidadosa consideración de los beneficios y riesgos del uso de M. sexta, hemos proporcionado un método que implica el cuidado adecuado y la preparación de la dieta para ensayos preclínicos que permiten oportunidades para el uso futuro en laboratorio preclínico.

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Protocolo

1. Preparación del gusano del cuerno y tratamiento con cannabidiol

1. Obtener 150-200 M viables. sexta huevos y dietas artificiales basadas en germen de trigo (ver Tabla de Materiales).
2. Coloque los huevos del gusano del cuerno en una placa de Petri de poliestireno con una capa de dieta artificial (AD) a base de germen de trigo y transfiera los huevos a una cámara de cría de insectos (consulte la Tabla de materiales) mantenida a 25 ° C con 40% -60% de humedad relativa.
3. Permita que los huevos de gusano del cuerno del tabaco durante 1-3 días eclosionen dentro de la cámara de cría de insectos mantenida a 25 ° C con 40% -60% de humedad relativa.
4. Prepare la solución madre de cannabidiol (CBD) (200 mM) agregando 1.26 g de aislado de CBD de >98% de pureza en 20 ml de aceite de EtOH (prueba de 200) o 100% de triglicéridos de cadena media (MCT) (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: El aislado de CBD es sensible a la luz, así que manipule en la oscuridad.
5. Agregue 5 ml y 10 ml de la solución madre de CBD de 200 mM a los 1.000 g de AD para llevar las concentraciones finales de las dietas a 1 mM y 2 mM de CBD, respectivamente.
   NOTA: Asegúrese de que la dieta y la solución madre de CBD estén bien mezcladas hasta que se forme una mezcla completamente homogénea. Mezcle el AD que contiene existencias de CBD en una bolsa de plástico durante al menos 45 minutos a mano.
   PRECAUCIÓN: El mezclador de café o cualquier otro molinillo de metal parecía ser ineficaz.
6. Dispense 20 g de los tres medios, control (AD), vehículo (AD + 0.1% de aceite EtOH o MCT) y medios que contengan CBD (AD + 0.1% de etOH o aceite MCT + 1 mM / 2 mM de CBD) en la parte inferior del tubo de 50 ml.
7. Distribuya aleatoriamente las larvas de 1er instar (~ 2 mm de largo) individualmente en un tubo de ensayo de 50 ml y cúbralas con una tapa perforada o una gasa (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Coloque el tubo boca abajo y cultive insectos en una cámara de cría de insectos mantenida a 25 ° C con una humedad relativa del 40% al 60%.
8. Cultivarlos dentro de una cámara de cría de insectos (ver Tabla de Materiales) mantenida a 25 °C con un ciclo de luz/oscuridad de 12 h.

2. Mediciones del crecimiento larvario, el consumo de dieta y la mortalidad de M. sexta

1. Mida el crecimiento larvario (es decir, el tamaño y el peso) con una balanza analítica y la mortalidad a intervalos de 2 días después de ser transferido a contenedores individuales hasta que se reconozca la pupación como la coloración marrón oscuro de una capa de exocutícula endurecida.
   1. Registre la masa inicial (en gramos) de cada grupo de larvas antes de introducir las larvas en sus respectivas dietas y reste la masa de las larvas en cada medición de la masa inicial para determinar las ganancias de masa entre las etapas de desarrollo de las larvas hasta que las larvas completen la etapa de pupación.
   2. Registre el número de días entre las etapas de desarrollo de instar para comprender las diferencias en el marco de tiempo de desarrollo entre las etapas de crecimiento de las larvas hasta la pupación en cada dieta.
      NOTA: Raspe la materia fecal del recipiente para evitar cualquier contaminación por moho. Recopile el asunto para futuras pruebas dependiendo de los propósitos del experimento (por ejemplo, cálculo de la tasa de acumulación de CBD, perfil microbiano). Es importante manejar cuidadosamente el insecto durante los períodos frágiles de apólisis o ecdisis. Al sacar de las larvas de un recipiente, agarre suavemente el cuerpo principal del insecto con una punta plana y fórceps anchos y no fuerce a eliminar la capa externa de piel cuando un insecto esté en proceso de desprendimiento.
2. Medir el consumo de ^dieta31 pesando la pérdida de dieta del recipiente entre larvas de ^1ª instar y pupación. Registre los gramos iniciales de dieta al comienzo del experimento y reste la cantidad inicial de la cantidad restante de dieta cuando las larvas entraron en la etapa de pupación completa.
   NOTA: La materia fecal debe excluirse de la medición de la dieta. La materia fecal y otros desechos (es decir, desprendimientos de piel) se pueden eliminar fácilmente de los medios colocando el recipiente boca abajo.
3. Para las mediciones de movilidad, permita que el insecto sometido aclimate el entorno de la cámara durante al menos 5 minutos y rastree las ^distancias31 que tres grupos de insectos de ^5º instar (80-100 mm de longitud) recorrieron utilizando una cámara de acondicionamiento del miedo automatizada y computarizada (ver Tabla de materiales).
4. Analice la respuesta de ^movilidad31 a través de vídeo grabado a 60 fotogramas/s durante 5 min utilizando un software de detección de movimiento (ver Tabla de Materiales) que genera un índice de movimiento.

3. Análisis estadístico

1. Analizar las diferencias en el crecimiento larvario (es decir, tamaño y peso) y el índice de movimiento por ANOVA unidireccional con el post-test de Tukey32.
2. Utilice la prueba log-rank (Mantel-Cox)³³ para las comparaciones de la curva de supervivencia.
   NOTA: Todos los análisis estadísticos se realizaron utilizando software de análisis estadístico (ver Tabla de Materiales).

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Resultados

Manduca sexta como sistema modelo para examinar la toxicidad de los cannabinoides
La Figura 1 muestra los componentes clave del experimento de CBD utilizando el gusano del tabaco Manduca sexta. Un gran número de insectos (>20) se criaron individualmente a 25 ° C en un ciclo de 12 h: 12 h = luz: oscuridad. El tamaño, el peso y la mortalidad de los insectos se midieron a intervalos de 2 días para monitorear las respuestas a corto y lar...

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Discusión

El estudio de alimentación demostró que altas dosis de CBD (2 mM) inhibieron el crecimiento del insecto y aumentaron la ^mortalidad31. El modelo de insecto también mostró sensibilidad al etanol; sin embargo, el CBD destoxicó efectivamente la toxicidad del etanol, aumentando su tasa de supervivencia, consumo de dieta y comportamientos de búsqueda de alimentos a niveles similares al grupo de control (Figura 3A, B)³¹. El sist...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytic balance	Mettler Instrument Corp.	AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)	Lilu's Garden
Cheesecloth	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes	VWR	89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	EX0276-1
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber	Darwin Chambers	INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil	Walmart
Motion detection software (Actimetrics)	Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)	VWR INTERNATIONAL	688161
Tobacco hormworm artificial diet	Carolina Biological Supply Company	Item # 143908	Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs	Carolina Biological Supply Company	Item # 143880	Unit of 30-50