Hornworm del tabacco come sistema modello di insetto per studi pre-clinici sui cannabinoidi

Riepilogo

Il presente protocollo fornisce informazioni didattiche per l'uso del hornworm del tabacco Manduca sexta nella ricerca sui cannabinoidi. Il metodo qui descritto include tutte le forniture e i protocolli necessari per monitorare i cambiamenti fisiologici e comportamentali del modello di insetto in risposta al trattamento con cannabidiolo (CBD).

Abstract

Con una maggiore attenzione ai cannabinoidi in medicina, diversi organismi modello di mammiferi sono stati utilizzati per chiarire le loro funzioni farmaceutiche sconosciute. Tuttavia, rimangono molte difficoltà nella ricerca sui mammiferi, che richiede lo sviluppo di organismi modello non mammiferi per la ricerca sui cannabinoidi. Gli autori suggeriscono il hornworm del tabacco Manduca sexta come un nuovo sistema di modelli di insetti. Questo protocollo fornisce informazioni sulla preparazione della dieta artificiale con quantità variabili di cannabidiolo (CBD), sulla creazione di un ambiente di coltivazione e sul monitoraggio dei loro cambiamenti fisiologici e comportamentali in risposta al trattamento con CBD. In breve, dopo aver ricevuto le uova di hornworm, le uova sono state autorizzate 1-3 giorni a 25 ° C in un ciclo 12:12 luce-buio per schiudersi prima di essere distribuite casualmente nel controllo (dieta artificiale a base di germe di grano; AD), veicolo (AD + 0,1% olio di trigliceridi a catena media; Olio MCT) e gruppi di trattamento (AD + 0,1% MCT + 1 mM o 2 mM di CBD). Una volta preparato il supporto, le larve di ^1st instar sono state poste individualmente in una provetta da 50 ml con un bastoncino di spiedino di legno, quindi la provetta è stata coperta con una garza. Le misurazioni sono state effettuate a intervalli di 2 giorni per le risposte fisiologiche e comportamentali alla somministrazione di CBD. Questa semplice procedura di coltivazione consente ai ricercatori di testare campioni di grandi dimensioni in un determinato esperimento. Inoltre, i cicli di vita relativamente brevi consentono ai ricercatori di studiare l'impatto dei trattamenti con cannabinoidi su più generazioni di una popolazione omogenea, consentendo dati a supporto di un disegno sperimentale in organismi modello di mammiferi superiori.

Introduzione

Negli ultimi anni, l'attenzione pubblica si è concentrata sui cannabinoidi a causa del loro potenziale terapeutico, tra cui il trattamento dell'epilessia1, del morbo di ^Parkinson2, della sclerosi ^multipla3 e di varie forme di ^cancro4,5,6 con cannabidiolo (CBD). Da quando la cannabis è legalizzata come merce agricola nell'Agricultural Improvement Act del 2018, Public Law 115-334 (il Farm Bill del 2018), la cannabis e i suoi derivati cannabinoidi nelle industrie alimentari, cosmetiche e farmaceutiche sono aumentati esponenzialmente. Inoltre, isolati di grado clinico di singoli cannabinoidi e miscele di cannabinoidi sono stati testati con successo in soggetti ^umani7, linee ^cellulari5,8 e diversi sistemi di modelli ^animali9,10.

Uno studio clinico sarebbe l'ideale per convalidare l'efficacia e gli effetti avversi dei cannabinoidi su una specifica malattia. Tuttavia, ci sono numerose sfide negli studi clinici, tra cui l'approvazione etica / IRB, il reclutamento e la conservazione dei ^soggetti11. Per superare questi ostacoli, sono state utilizzate varie linee cellulari umane perché le linee cellulari di derivazione umana sono convenienti, facili da gestire, possono bypassare le questioni etiche e fornire risultati coerenti e riproducibili poiché le linee cellulari sono una "popolazione pura di cellule che non hanno contaminazione incrociata di altre cellule e sostanze chimiche"¹².

Alves et al. (2021)¹³ hanno testato il CBD in modo dose-dipendente nei trofoblasti placentari, che sono cellule specializzate della placenta che svolgono un ruolo essenziale nell'impianto dell'embrione e nell'interazione con l'utero materno ^{decidualizzato14}. I loro risultati hanno mostrato che il CBD ha causato la perdita di vitalità cellulare, l'interruzione della progressione del ciclo cellulare e l'induzione dell'apoptosi. Queste osservazioni dimostrano i potenziali impatti negativi dell'uso di cannabis da parte delle donne in gravidanza13. Allo stesso modo, una serie di linee cellulari sono state utilizzate anche per esaminare gli effetti farmacologici del CBD nelle malattie umane, in particolare varie forme di cancro. Gli studi in vitro hanno dimostrato con successo effetti antitumorali nelle cellule tumorali ^{pancreatiche15}, mammarie8 e colorettali16. Tuttavia, pur essendo ampiamente disponibili e facili da gestire, linee cellulari specifiche come HeLa, HEK293 sono soggette a cambiamenti genetici e fenotipici a causa di alterazioni nelle loro condizioni di crescita o ^{manipolazione17}.

Nella ricerca sulla cannabis, vari sistemi di modelli animali, che vanno da piccoli animali come topo18, porcellino d'India19 e ^coniglio19 a grandi animali come ^canine20, ^maialino21, ^scimmia22, ^cavallo23, sono stati utilizzati per esplorare effetti terapeutici sconosciuti. I topi sono stati il sistema animale modello più preferito per la ricerca sui cannabinoidi a causa della loro somiglianza anatomica, fisiologica e genetica con gli esseri ^umani24. Più significativamente, i topi hanno recettori CB1/2 nel loro sistema nervoso, che sono presenti negli esseri umani. Hanno anche un ciclo di vita più breve rispetto ai soggetti umani, con una manutenzione più facile e abbondanti risorse genetiche, rendendo così molto più facile monitorare gli effetti dei cannabinoidi durante un intero ciclo di vita. Il sistema dei mammiferi è ampiamente utilizzato e ha dimostrato con successo che il CBD allevia i disturbi convulsivi1, il disturbo da stress post-traumatico9, le ulcere ^orali25 e i sintomi simili alla ^demenza10. Il modello murino ha anche permesso uno studio dell'interazione sociale degli individui all'interno di una comunità che è estremamente difficile nei grandi animali e negli esseri ^umani26.

Nonostante tutti i vantaggi del sistema modello animale, è ancora costoso e richiede cure intensive durante la somministrazione del farmaco e la raccolta dei dati. Inoltre, vi è un esame dell'uso dei topi nella ricerca a causa dell'irriproducibilità e della scarsa ricapitolazione delle condizioni umane a causa delle limitazioni nella progettazione sperimentale e nel ^rigore27.

Con la crescente domanda di studi medici / preclinici sui cannabinoidi, è necessario un sistema modello non mammifero. I modelli di invertebrati tradizionalmente conferivano benefici distintivi rispetto ai modelli di vertebrati. I vantaggi significativi includono la facilità e il basso costo di allevare molti esemplari e consentire ai ricercatori di monitorare più generazioni di popolazioni geneticamente ^omogenee28. Un recente studio ha dimostrato che il moscerino della frutta, Drosophila melanogaster, è un efficace sistema modello di insetti per studiare le funzioni farmacologiche dei cannabinoidi nella modulazione dei comportamenti ^alimentari29. Tra i sistemi modello di insetti, gli autori si sono concentrati sul verme del tabacco, Manduca sexta, noto anche come falena della sfinge della Carolina o falena del falco, come un nuovo sistema modello di insetti per la ricerca sui cannabinoidi.

Manduca sexta appartiene alla famiglia degli Sphingidae. L'insetto è il parassita delle piante più comune negli Stati Uniti meridionali, dove si nutrono di piante solanacee. Il modello di insetto ha una lunga storia nella ricerca in fisiologia degli insetti, biochimica, neurobiologia e studi di interazione farmacologica. Il portafoglio di ricerca di Manduca sexta include una bozza di sequenza del genoma, che consente una comprensione a livello molecolare dei processi cellulari ^essenziali30. Un altro vantaggio cruciale di questo sistema di modelli è la sua grande dimensione, raggiungendo più di 100 mm di lunghezza e 10 g di peso nei 18-25 giorni di sviluppo larvale. Le grandi dimensioni consentono ai ricercatori di monitorare facilmente i cambiamenti morfologici e comportamentali in tempo reale in risposta al trattamento con CBD. Inoltre, a causa delle dimensioni, le risposte elettrofisiologiche sono state esaminate con il sistema nervoso addominale, compresi i gangli sezionati dalle larve senza impostazioni del microscopio ad alta risoluzione. La caratteristica unica consente ai ricercatori di studiare prontamente le risposte acute e a lungo termine ai cannabinoidi somministrati.

Nonostante tale versatilità, M. sexta è stato esplorato solo di recente per la sua idoneità come modello sperimentale per studi sulla cannabis e sui cannabinoidi. Nel 2019, gli autori hanno utilizzato per la prima volta il sistema modello di insetti per affrontare l'ipotesi che la Cannabis si sia evoluta per produrre Cannabidiolo per proteggersi dagli insetti erbivori30,31. Il risultato ha mostrato chiaramente che le piante sfruttavano il CBD come deterrente alimentare e inibiscono la crescita dell'insetto parassita M. sexta caterpillar, oltre a causare un aumento della ^mortalità31. Lo studio ha anche dimostrato gli effetti di salvataggio del CBD sulle larve di etanolo intossicate, identificando il potenziale effetto veicolo dell'etanolo come vettore del CBD. Come mostrato, il sistema modello di insetti ha studiato efficacemente gli effetti terapeutici dei cannabinoidi entro 3-4 settimane con meno manodopera e costi rispetto ad altri sistemi animali. Sebbene il modello degli insetti manchi di recettori cannabinoidi (cioè nessun recettore CB1/2), il sistema modello fornisce uno strumento prezioso per comprendere i ruoli farmacologici dei cannabinoidi attraverso un modo indipendente dal recettore dei cannabinoidi.

Gli autori di questo studio hanno precedentemente lavorato con il hornworm del tabacco come sistema modello per la ricerca sui ^{cannabinoidi31}. Dopo un'attenta considerazione dei benefici e dei rischi dell'uso di M. sexta, abbiamo fornito un metodo che coinvolge la cura e la preparazione adeguate della dieta per gli studi preclinici che consentono opportunità per un futuro uso preclinico di laboratorio.

Protocollo

1. Preparazione di Hornworm e trattamento con cannabidiolo

1. Ottenere 150-200 M. uova di sexta e diete artificiali a base di germe di grano (vedi Tabella dei materiali).
2. Posizionare le uova di hornworm in una capsula di Petri di polistirene con uno strato di dieta artificiale a base di germe di grano (AD) e trasferire le uova in una camera di allevamento degli insetti (vedi Tabella dei materiali) mantenuta a 25 °C con il 40% -60% di umidità relativa.
3. Lasciare che le uova di hornworm del tabacco per 1-3 giorni si schiudano all'interno della camera di allevamento degli insetti mantenuta a 25 °C con il 40%-60% di umidità relativa.
4. Preparare la soluzione madre di cannabidiolo (CBD) (200 mM) aggiungendo 1,26 g di isolato di CBD di purezza >98% in 20 ml di EtOH (prova 200) o olio di trigliceridi a catena media (MCT) al 100% (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: l'isolato di CBD è sensibile alla luce, quindi maneggia al buio.
5. Aggiungere 5 mL e 10 mL della soluzione madre di CBD da 200 mM ai 1.000 g di AD per portare le concentrazioni finali delle diete rispettivamente a 1 mM e 2 mM di CBD.
   NOTA: Assicurarsi che la dieta e la soluzione madre di CBD siano ben miscelate fino a formare una miscela completamente omogenea. Mescolare la scorta contenente AD di CBD in un sacchetto di plastica per almeno 45 minuti a mano.
   ATTENZIONE: il mixer da caffè o qualsiasi altro macinino metallico sembrava essere inefficace.
6. Erogare 20 g dei tre mezzi, controllo (AD), veicolo (AD + 0,1% di olio EtOH o MCT) e cbd contenenti supporti (AD + 0,1% di olio EtOH o MCT + 1 mM / 2 mM di CBD) sul fondo del tubo da 50 ml.
7. Distribuire in modo casuale le larve 1st instar (~ 2 mm di lunghezza) individualmente in una provetta da 50 ml e coprire con un coperchio perforato o una garza (vedi Tabella dei materiali).
   NOTA: Posizionare il tubo a testa in giù e far crescere gli insetti in una camera di allevamento degli insetti mantenuta a 25 °C con il 40%-60% di umidità relativa.
8. Coltivali all'interno di una camera di allevamento di insetti (vedi Tabella dei materiali) mantenuta a 25 °C con un ciclo luce/buio di 12 ore.

2. M. sexta crescita larvale, consumo di dieta e misurazioni della mortalità

1. Misurare la crescita larvale (cioè dimensioni e peso) con un bilancio analitico e la mortalità a intervalli di 2 giorni dopo essere stata trasferita in singoli contenitori fino a quando la pupa non viene riconosciuta come la colorazione marrone scuro di uno strato di esocuticola indurita.
   1. Registrare la massa iniziale (in grammi) di ciascun gruppo di larve prima di introdurre le larve nelle rispettive diete e sottrarre la massa delle larve ad ogni misurazione dalla massa iniziale per determinare i guadagni di massa tra gli stadi di sviluppo delle larve fino a quando le larve completano lo stadio di pupa.
   2. Registrare il numero di giorni tra le fasi di sviluppo instar per comprendere le differenze nel periodo di sviluppo tra le fasi di crescita delle larve fino alla pupa su ciascuna dieta.
      NOTA: raschiare via la materia fecale dal contenitore per evitare qualsiasi contaminazione da muffa. Raccogli la materia per i test futuri dipendenti dagli scopi dell'esperimento (ad esempio, calcolo del tasso di accumulo di CBD, profilazione microbica). È importante maneggiare attentamente l'insetto durante i fragili periodi di apolisi o ecdisia. Quando si estraggono le larve da un contenitore, afferrare delicatamente il corpo principale dell'insetto con una punta piatta e una pinza larga e non forzare a rimuovere lo strato esterno della pelle quando un insetto è in fase di spargimento.
2. Misurare il consumo di ^dieta31 pesando la perdita di dieta del contenitore tra le larve di ^1st instar e la pupa. Registrare i grammi iniziali di dieta all'inizio dell'esperimento e sottrarre la quantità iniziale dalla quantità rimanente di dieta quando le larve sono entrate nella fase completa di pupa.
   NOTA: La materia fecale deve essere esclusa dalla misurazione della dieta. La materia fecale e altri detriti (ad esempio, capannoni cutanei) possono essere facilmente rimossi dal supporto posizionando il contenitore a testa in giù.
3. Per le misurazioni della mobilità, consentire all'insetto sottoposto di acclimatare l'ambiente della camera per almeno 5 minuti e tracciare le ^distanze31 che tre gruppi di insetti ^5th instar (80-100 mm di lunghezza) hanno percorso utilizzando una camera di condizionamento della paura automatizzata e computerizzata (vedi Tabella dei materiali).
4. Analizza la risposta di ^mobilità31 attraverso video registrati a 60 fotogrammi /s per 5 minuti utilizzando un software di rilevamento del movimento (vedi Tabella dei materiali) che genera un indice di movimento.

3. Analisi statistica

1. Analizza le differenze nella crescita larvale (cioè dimensioni e peso) e l'indice di movimento con ANOVA unidirezionale con il post-test ^{di Tukey32}.
2. Utilizzare il test log-rank (Mantel-Cox)³³ per confronti della curva di sopravvivenza.
   NOTA: Tutte le analisi statistiche sono state eseguite utilizzando software di analisi statistica (vedi Tabella dei materiali).

Risultati

Manduca sexta come sistema modello per esaminare la tossicità dei cannabinoidi
La Figura 1 illustra i componenti chiave dell'esperimento CBD utilizzando il verme del tabacco Manduca sexta. Un gran numero di insetti (>20) sono stati allevati individualmente a 25 °C in un ciclo di 12 h:12 h = luce: buio. Le dimensioni, il peso e la mortalità degli insetti sono stati misurati a intervalli di 2 giorni per monitorare le risposte a breve e ...

Discussione

Lo studio sull'alimentazione ha dimostrato che alte dosi di CBD (2 mM) inibiscono la crescita dell'insetto e aumentano la ^mortalità31. Il modello di insetto ha anche mostrato sensibilità all'etanolo; tuttavia, il CBD ha efficacemente disintossicato la tossicità dell'etanolo, aumentando il tasso di sopravvivenza, il consumo di dieta e i comportamenti di ricerca alimentare a livelli simili al gruppo di controllo (Figura 3A, B) ³¹

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Analytic balance	Mettler Instrument Corp.	AE100S
Cannabidiol isolate (>99.4%)	Lilu's Garden
Cheesecloth	VWR INTERNATIONAL	470150-438
Corning 50mL clear polypropylene (PP) centrifuge tubes	VWR	89093-192
Ethyl Alcohol, 200 Proof	Sigma-Aldrich	EX0276-1
Fear conditioning chamber	Coulbourn Instruments
Insect rearing chamber	Darwin Chambers	INR034
Medium chain triglycerides (MCT) oil	Walmart
Motion detection software (Actimetrics)	Coulbourn Instruments
Polystyrene petri dish (120 mm x 120 mm x 17mm)	VWR INTERNATIONAL	688161
Tobacco hormworm artificial diet	Carolina Biological Supply Company	Item # 143908	Ready-To-Use-Hornworm-Diet
Tobacco hormworm eggs	Carolina Biological Supply Company	Item # 143880	Unit of 30-50