将人 iPSC 稳健分化为纯脂肪细胞群以研究脂肪细胞相关疾病

摘要

该方案允许从诱导多能干细胞（iPSC）产生纯脂肪细胞群。维甲酸用于将iPSCs分化为间充质干细胞（MSC），用于产生脂肪细胞。然后，采用基于尼罗河红染色的分选方法获得纯脂肪细胞。

摘要

诱导多能干细胞（iPSC）技术的最新进展允许产生不同的细胞类型，包括脂肪细胞。然而，目前的分化方法效率低，不能产生均匀的脂肪细胞群。在这里，我们通过使用基于全反式视黄体的方法以高产量生产间充质干细胞（MSCs）来规避这个问题。通过调节控制细胞增殖、存活和粘附的途径，我们的分化策略允许有效生成分化成纯多能MSC群体的胚胎体（EB）。该方法产生的大量MSC为产生脂肪细胞提供了理想的来源。然而，脂肪细胞分化导致的样品异质性仍然是一个挑战。因此，我们使用基于尼罗河红的方法使用FACS纯化含脂成熟脂肪细胞。这种分选策略使我们能够建立一种可靠的方法来使用具有降低样品异质性和增强细胞功能的脂肪细胞池来模拟脂肪细胞相关的代谢紊乱。

引言

间充质干细胞（MSCs）是产生中胚层起源细胞（如脂肪细胞，骨细胞和软骨细胞）的有效短暂资源，可以进一步用于模拟其各自的遗传疾病。然而，以前的方法依赖于从成人组织1获得这些MSC，这带来了从供体获得大量MSC的挑战，并且限制了它们在次优体外^{培养条件下保持}功能存活1^，2。这些障碍产生了对体外产生MSCs的方案的巨大需求。人诱导多能干细胞（iPSCs）可用作MSC的宝贵来源，表现出MSC特征³，^4，5。iPSCs衍生的间充质干细胞可用作多种疾病的治疗选择。此外，iPSCs衍生的MSCs产生脂肪细胞的能力使其成为研究人类脂肪生成，肥胖和脂肪细胞相关疾病的有价值的体外人类模型。

目前脂肪细胞的分化方案可分为两组，一组涉及使用化学或基于蛋白质的混合物分化脂肪细胞，结果产量为30%-60%⁶，⁷，^8，9，^而另一组涉及遗传操作以稳健地诱导控制脂肪细胞发育的关键转录因子，以产生80%-90%¹⁰的产量^，11.然而，基因操作并不能概括脂肪细胞分化的自然过程，并且经常掩盖脂肪生成过程中到达的微妙范式，使其对疾病建模目的无效^12，13。因此，我们提出了一种通过使用尼罗河红荧光标记含脂脂肪细胞来将化学衍生的成熟脂肪细胞与未成熟脂肪细胞进行分类的方法。

在这里，我们提出了一种协议，涉及将iPSC衍生的拟胚体（EB）与全反式 维甲酸瞬时孵育以产生大量快速增殖的MSC，这可以进一步用于产生脂肪细胞¹⁴。我们还提出了一种通过使用亲脂性染料荧光标记其脂滴来从异质分化池中分选化学衍生的成熟脂肪细胞的方法;尼罗河红。这将允许产生具有增强功能的成熟脂肪细胞的纯群体，以准确模拟脂肪细胞相关的代谢紊乱。

研究方案

该研究已获得适当的机构研究伦理委员会的批准，并按照1964年《赫尔辛基宣言》及其后来的修正案或类似的伦理标准中规定的伦理标准进行。该协议已获得HMC（编号16260/16）和QBRI（编号:2016-003）的机构审查委员会（IRB）的批准。这项工作还针对H1和H9等hESC进行了优化。血液样本是在完全知情同意的情况下从健康个体获得的。iPSCs由健康个体的外周血单核细胞（PBMC）产生。

1. 培养和维持 iPSC

1. 通过在敲除DMEM中以1:80的比例重建涂层基质来制备基底膜基质涂层板，并储存在4°C。
2. 通过将 50 mL 的 10 x 干细胞补充剂培养基与 5 mL 的 100 x 青霉素-链霉素 （P/S） 一起制备 iPSC 培养基，并在 4 °C 下短期储存或长期储存在 -20 °C。
3. 将板与包衣基质-1 mL 用于 6 孔板，500 μL 用于 12 孔板，250 μL 用于 24 孔板 - 并将板在 37 °C 下孵育 1-2 小时。
4. 取出等分试样的iPSCs培养基，并在使用前在室温下预热。
5. 在37°C水浴中解冻一瓶iPSC（ESC或iPSC），并转移到含有2-3mL培养基的15 mL锥形管中。
6. 在室温（RT-23°C）下以120× g 离心管4分钟。
7. 除去上清液，加入 2 mL 补充有 10 μM ROCK 抑制剂 （Y-27632） 的新鲜培养基。将细胞接种在基质包被的6孔板的一个孔中，并将板置于37°C。
8. 24小时后，取出培养基并用新鲜培养基替换。
9. 每天更换培养基，直到细胞达到80%-90%的汇合度。
10. 达到汇合后，按照下面概述的步骤传代细胞。
    1. 取出培养基并用Dulbecco的磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤细胞。
    2. 加入iPSC解离试剂（参见 材料表）-500μL用于6孔板的孔，250μL用于24孔板的孔 - 并在37°C下孵育1分钟。
    3. 取出解离试剂并将细胞在37°C下干燥孵育1分钟。
    4. 使用培养基-1 mL 收集细胞，用于 6 孔板的孔，250 μL 用于 24 孔板的孔 - 在 15 mL 锥形管中，并以 120 x g 离心 4 分钟。
    5. 将细胞重悬于培养基-2 mL 中，用于 6 孔板的孔，500 μL 重悬于补充有 10 μM ROCK 抑制剂的 24 孔板的孔中，并以 40% 汇合度将它们接种在新鲜的基质包被的板上。

2. iPSC分化为间充质干细胞

1. 通过将15%胎牛血清（FBS）和1%P / S添加到低葡萄糖DMEM +丙酮酸中来制备MSC分化培养基，并储存在4°C。
2. 达到 80% 汇合后，按照以下步骤使用 iPSC 形成拟胚体 （EB）。
   1. 用DPBS洗涤细胞，并用解离培养基/ EDTA-500μL孵育它们，用于6孔板的孔，250μL用于24孔板的孔。
   2. 在37°C孵育1分钟，吸出解离试剂并将细胞保持在37°C再保持1分钟。要开始MSC分化，需要~10-12 x 10⁶ 个细胞。
   3. 使用培养基将细胞收集在 15 mL 锥形管中。确保在收集时非常温和，以防止细胞变单一并允许EB形成。将细胞以120 x g 离心4分钟。
   4. 将细胞重悬于含有 10 μM ROCK 抑制剂的 3 mL MSC 分化培养基中。
   5. 在 24 孔超低附着板中混合并分配 0.5 mL/孔。
      注意:使用超低附着板会鼓励细胞聚集到EB中，而不是它们附着在表面上。
   6. 将板置于37°C的培养箱中。
3. 24小时后，按照以下步骤用高维甲酸（RA）处理诱导获得的EB。
   1. 将 10 μM RA 加入 3 mL MSC 分化培养基中。在 15 mL 管中收集 EB，并让它们稳定 15 分钟。
   2. 从EB中取出上清液，加入补充有10μM RA的MSC分化培养基。
   3. 轻轻重悬，并将 0.5 mL/孔分布在同一 24 孔超低附着板中。
   4. 将板置于37°C的培养箱中。 在接下来的48小时内不要打扰EB。
   5. 48小时后，在15mL管中收集EB，并让它们稳定15分钟。
   6. 从EB中取出上清液，加入补充有0.1μM RA的MSC分化培养基。
   7. 轻轻重悬，并将 0.5 mL/孔分布在同一 24 孔超低附着板中。
   8. 将板置于37°C的培养箱中。 在接下来的48小时内不要打扰EB。
4. 按照下面概述的步骤删除添加到单元格中的 RA。
   1. 最后一次RA处理48小时后，收集EB并让它们稳定15分钟。
   2. 除去上清液并加入不含细胞因子的DMEM低葡萄糖培养基。
   3. 轻轻重悬并将 0.5 mL/孔分布在 24 孔超低附着板中。将板置于37°C的培养箱中。
5. 按照下面概述的步骤对 iPSC 衍生的 EB 进行铺板。
   1. 从上一步（步骤2.4）开始48小时后，将EB收集在15mL管中并让它们稳定15分钟。
   2. 除去上清液并重悬于 2 mL 新鲜 MSC 分化培养基中。
   3. 转移到基底膜基质涂层的6孔板的两个孔中。
   4. 每隔一天更换一次介质，再增加 5 天。
   5. 5 天后，取出用过的培养基，并用含有 2.5 ng/mL 碱性成纤维细胞生长因子 （bFGF） 的新鲜 MSC 分化培养基代替。
6. 当电镀EB达到80%-90%汇合度时，按照下面概述的步骤通过它们。
   1. 用DPBS洗涤细胞，加入胰蛋白酶-EDTA-500μL以获得6孔板的孔，并将细胞在37°C孵育3分钟。
   2. 使用 MSC 分化培养基在 15 mL 锥形管中收集细胞，并以 750 x g 离心 4 分钟。
   3. 用 2.5 ng/mL 的 bFGF 重悬于 MSC 分化培养基中，并以 1:3 的比例将细胞接种在基底膜基质包被的平板上。
   4. 当细胞达到70%-80%汇合时重复传代。预计通过2-3次传代将获得3-6百万个细胞。

3. iPSCs来源的MSCs的流式细胞术分析

注意:在经历2-3代后，应访问细胞以提高MSC分化的效率。如果细胞以超过 90% 的效率表达 MSC 分化标志物 - CD44、CD73、CD90 和 CD105，并且不表达高水平的造血标志物 - CD14、CD19、CD34 和 CD45，则分化将被认为是成功的。可以按照以下步骤访问这些标记的效率。

1. 使用上述步骤（步骤2.6）传代细胞，并在V底96孔板的一个孔中获得1 x 10⁵ 个细胞。
2. 在4°C下以375× g 离心板4分钟。
3. 将 1 x 10⁵ 个细胞重悬于 100 μL 冷 DPBS 中，并用 1 μL 偶联抗体 （Ab）（参见 材料表），并在 4 °C 下孵育 30-40 分钟以防止暴露在光线下。
4. 将另外1 x 10⁵ 个细胞重悬于100μL冷DPBS中，浓度为1:100的共轭Ab的相应同种型对照，并在4°C下孵育30-40分钟以防止暴露在光线下。
5. 孵育后，将板在4°C下以375× g 离心4分钟。 通过在水槽上摇动板来丢弃上清液。
6. 将细胞重悬于 100 μL 冷 DPBS 中。
7. 将细胞在4°C下以375× g 离心4分钟。 弃去上清液。
8. 将细胞重悬于 200 μL 冷 DPBS 中，并收集在深色、冷的 1.5 mL 微量离心管中，并将其保存在冰上，直到通过荧光激活细胞分选 （FACS） 进行分析。
9. 对于 FACS 分析，使用侧向散射 （SSC-A） 与前向散射 （FSC-A） 分布细胞以排除碎片。此外，使用前向散射高度（FSC-H）与前向散射面积（FSC-A）分布门控细胞，以区分活细胞群中的单峰和双峰。
   注意:细胞相对于每个标记物的同种型对照位移进行门控，并且使用来自每个染色样品的至少10，000个门控事件进行分析。

4. 间充质干细胞分化为脂肪细胞

1. 通过将10%敲除血清替代（KOSR），1%谷氨酰胺，1%P / S，4.5ng / μL葡萄糖添加到最小必需培养基（MEM）-α中来制备脂肪细胞分化基础培养基，并储存在4°C。
2. 允许 MSC 达到 90% 以上的汇合度。继续培养它们48小时，使它们经历一段时间的生长停滞。
3. 通过向基础培养基中加入 100 μg/mL 的 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤 （IBMX）、1 μM 地塞米松、0.2 U/mL 胰岛素、100 μM 吲哚美辛和 10 μM 罗格列酮，制备完整的脂肪细胞分化培养基。
4. 去除MSC分化培养基并使用DPBS洗涤细胞。
5. 加入完整的脂肪细胞分化培养基-2mL用于6孔板的孔，1mL用于12孔板的孔-并将细胞在37°C孵育。 每隔一天更换一次完整的分化培养基，持续 14 天。

5.脂肪细胞分化效率的评价

1. 在分化的第14天，通过染色细胞中的脂肪细胞成熟标志物，FABP4和脂联素来检查分化效率。
2. 取出培养基并用DPBS洗涤细胞。
3. 使用 4% 多聚甲醛 （PFA） - 200 μL 将细胞固定到 24 孔板的孔中 - 并在室温下孵育 15 分钟。
4. 丢弃PFA，使用含有0.5%吐温（TBST）的三缓冲盐水洗涤，并将其置于室温下的摇床上15分钟。重复该过程两次。
5. 用含有0.5%Triton X-100（PBST）的磷酸盐缓冲盐水透化固定细胞，并将其置于室温振荡器上15-20分钟。
6. 弃去PBST并加入封闭缓冲液（PBST中的5%-6%牛血清白蛋白（BSA））-500μL用于6孔板的孔和250μL用于12孔板的孔 - 并在室温下在振荡器上孵育40-60分钟。
7. 在2%-3%BSA中稀释针对FABP4，脂联素的一抗，浓度为1:500（参见 材料表）。仅当在不同的动物中饲养时，才将这些抗体加在一起，并将板放在4°C的摇床上过夜。
8. 去除一抗并用TBST洗涤细胞三次（每次15分钟），并将其置于室温下的摇床上。
9. 在PBST中制备Alexa Fluor二抗（1:500）。将二抗组合中的细胞（根据一抗产生的物种）在室温下孵育60分钟，并用铝箔覆盖板以保护其免受光照。
10. 丢弃二抗，用TBST洗涤三次，然后将板放在摇床上。
11. 要染色细胞核，加入 1 μg/mL 的 Hoechst 33342-200 μL 以获得在 PBS 中稀释的 24 孔板的孔，并在室温下孵育 5 分钟。
12. 弃去赫斯特溶液，向细胞中加入PBS-500 μL，以获得24孔板的孔。保持平板免受光照，直到使用倒置荧光显微镜观察。

6. 使用尼罗河红分选脂肪细胞

1. 通过在DMSO中加入1mg / mL尼罗河红储备溶液来制备尼罗河红工作溶液，并储存在-20°C。 在使用前，解冻尼罗河红原液并在DPBS中复溶，以达到300 nM工作溶液浓度。
2. 在脂肪细胞分化的第14天或之后，从细胞中丢弃培养基并使用DPBS洗涤。
3. 在6孔板的孔中加入尼罗红工作溶液-1mL，并在37°C下孵育15分钟。
4. 取出尼罗红溶液，在6孔板的孔中加入胰蛋白酶-EDTA -500μL，并在37°C孵育4分钟。
5. 使用含有 5% FBS 的 DMEM 在 15 mL 锥形管中收集细胞。以750 x g 离心4分钟。
6. 取出上清液并在DPBS-1 mL中重悬1 x 10⁶ 细胞。以750 x g 离心4分钟。
7. 取出上清液并在DPBS-1 mL中重悬1 x 10⁶ 细胞。使用 FACS 分选仪使用 FL1 通道分离尼罗河红阳性细胞。
8. 在脂肪细胞分化培养基中重新培养分选的细胞或收集分选的细胞以进行RNA和蛋白质分离。
9. 从分选的细胞中提取RNA，并对脂肪细胞分化标志物（包括 FABP4，PPARG和 C / EBPA）进行相对定量分析。与未分选的细胞相比，尼罗河红阳性细胞的基因表达显着上调至少两倍。

结果

间充质分化过程中细胞的示意图和形态:iPSC 分化为 MSC 涉及跨越 EB 形成、MSC 分化和 MSC 扩增的不同发育阶段（图 1）。在这些发育阶段，细胞由于受到不同的刺激化学物质而获得各种形态。在开始分化时，细胞被铺在悬浮液中，并且预期是圆形的，具有明确的细胞边界，同时直径为小到中等尺寸（图2）。在分化的初始阶段选择悬浮培养细胞使其与自然?...

讨论

该协议至关重要，因为它能够提供高产量和高效率的MSC。这种大规模生产MSCs是通过将iPSCs衍生的EB与10μM的RA^14，15瞬时孵育来实现的。用 10 μM RA 瞬时处理将 MSC 产量提高了 11.2 至 1542 倍¹⁴，^15，该方案适用于 iPSC 和 hPSC。在此剂量和治疗持续时间下，RA通过直接或间接调节参与细胞增殖，凋亡以及细胞间和ECM细?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adiponectin	Abcam	ab22554	Adipocyte maturation marker
anti-CD105	BD Pharmingen	560839	MSC differentiation marker
anti-CD14	BD Pharmingen	561712	MSC differentiation marker
anti-CD19	BD Pharmingen	555415	MSC differentiation marker
anti-CD34	BD Pharmingen	555824	MSC differentiation marker
anti-CD44	abcam	ab93758	MSC differentiation marker
anti-CD45	BD Pharmingen	560975	MSC differentiation marker
anti-CD73	BD Pharmingen	550256	MSC differentiation marker
anti-CD90	BD Pharmingen	555596	MSC differentiation marker
bFGF	R&D	233-FP	MSC culture media supplement
C/EBPA	Abcam	ab40761	Adipocyte maturation marker
Dexamethasone	Torics	1126	Adipocyte differentiation media supplement
FABP4	Abcam	ab93945	Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serum	ThermoFisher	10082147	MSC culture media supplement
Glutamax	ThermoFisher	35050-061	MSC culture media supplement
IBMX	Sigma Aldrich	I5879	Adipocyte differentiation media supplement
Indomethacin	Sigma Aldrich	I7378	Adipocyte differentiation media supplement
Insulin	Sigma Aldrich	91077C	Adipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEM	ThermoFisher	12660012	Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEM	ThermoFisher	11885084	MSC culturing media
Matrigel	Corning	354230	Coating matrix
MEM-alpha	ThermoFisher	12561056	Adipocyte differentiation media
Nilered	Sigma Aldrich	19123	Sorting marker for adipocyte
Penicillin	ThermoFisher	15140122	MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered saline	ThermoFisher	14190144	wash buffer
Pierce™ 20X TBS Buffer	Thermo Fisher	28358	wash buffer
PPARG	Cell Signaling Technology	2443	Adipocyte maturation marker
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	Dissociation reagent
Retinoic acid	Sigma Aldrich	R2625	MSC differentiation media supplement
Rock inhibitor	Tocris	1254/10	hPSC culture media supplement
Roziglitazone	Sigma Aldrich	R2408	Adipocyte differentiation media supplement
StemFlex	ThermoFisher	A334901	hPSC culture media
Triton	Thermo Fisher	28314	Permebealization reagent
Trypsin	ThermoFisher	25200072	Dissociation reagent
Tween 20	Sigma Aldrich	P7942	Wash buffer