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Resumo

O protocolo permite a geração de uma população de adipócitos puros a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). O ácido retinóico é usado para diferenciar iPSCs em células-tronco mesenquimais (CTMs) que são usadas para produzir adipócitos. Em seguida, uma abordagem de classificação baseada na coloração vermelha do Nilo é usada para obter adipócitos puros.

Resumo

Avanços recentes na tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) têm permitido a geração de diferentes tipos celulares, incluindo adipócitos. Entretanto, os métodos de diferenciação atuais têm baixa eficiência e não produzem uma população homogênea de adipócitos. Aqui, contornamos esse problema usando um método baseado em trans-retinóicos para produzir células-tronco mesenquimais (CTMs) em alto rendimento. Ao regular as vias que governam a proliferação, sobrevivência e adesão celular, nossa estratégia de diferenciação permite a geração eficiente de corpos embrionários (EBs) que se diferenciam em uma população pura de CTMs multipotentes. O elevado número de CTMs geradas por este método fornece uma fonte ideal para a geração de adipócitos. No entanto, a heterogeneidade da amostra resultante da diferenciação dos adipócitos permanece um desafio. Portanto, usamos um método à base de vermelho do Nilo para purificar adipócitos maduros portadores de lipídios usando FACS. Essa estratégia de classificação nos permitiu estabelecer uma maneira confiável de modelar distúrbios metabólicos associados aos adipócitos usando um pool de adipócitos com heterogeneidade amostral reduzida e funcionalidade celular aprimorada.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (CTMs) atuam como um recurso transitório efetivo para a produção de células de origem mesodérmica, como adipócitos, osteócitos e condrócitos, que poderiam ser posteriormente utilizadas para modelar suas respectivas doenças genéticas. No entanto, abordagens anteriores baseavam-se na obtenção dessas CTMs a partir de tecidos adultos 1, o que impunha o desafio de obtê-las em grande número dos doadores e a limitação de mantê-las funcionalmente viáveis em condições subótimas de cultivo in vitro 1,2. Esses obstáculos têm gerado uma grande demanda de se ter um protocolo para geração de CTMs in vitro. Células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs) podem ser usadas como uma fonte valiosa de CTMs, exibindo características deCTMs 3,4,5. As CTMs derivadas de iPSCs podem ser utilizadas como opção terapêutica em diversas doenças. Além disso, a capacidade das CTMs derivadas de iPSCs de gerar adipócitos as torna um valioso modelo humano in vitro para estudar adipogênese humana, obesidade e distúrbios associados a adipócitos.

Os protocolos atuais de diferenciação de adipócitos podem ser classificados em dois grupos, com um envolvendo diferenciação de adipócitos usando coquetéis químicos ou à base de proteínas, resultando em um rendimento de 30%-60%6,7,8,9, enquanto o outro envolvendo manipulação genética para indução robusta de fatores-chave de transcrição que governam o desenvolvimento de adipócitos para dar um rendimento de 80%-90%10, 11º. No entanto, a manipulação genética não recapitula o processo natural de diferenciação dos adipócitos e, muitas vezes, mascara os paradigmas sutis que chegam durante a adipogênese, tornando-a ineficaz para fins de modelagem da doença12,13. Portanto, apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros quimicamente derivados de imaturos marcando fluorescentemente adipócitos portadores de lipídios usando vermelho do Nilo.

Apresentamos aqui um protocolo envolvendo a incubação transitória de corpos embrionários (EBs) derivados de iPSCs com ácido all-trans retinóico para produzir um grande número de CTMs de rápida proliferação, que poderiam ser posteriormente utilizadas para gerar adipócitos14. Também apresentamos uma maneira de classificar adipócitos maduros derivados quimicamente do pool de diferenciação heterogênea marcando fluorescentemente suas gotículas lipídicas usando um corante lipofílico; Vermelho do Nilo. Isso permitiria a geração de uma população pura de adipócitos maduros com funcionalidade aprimorada para modelar com precisão os distúrbios metabólicos associados aos adipócitos.

Protocolo

O estudo foi aprovado pelo comitê de ética em pesquisa institucional apropriado e realizado de acordo com os padrões éticos estabelecidos na Declaração de Helsinque de 1964 e suas alterações posteriores ou padrões éticos comparáveis. O protocolo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) do HMC (nº 16260/16) e QBRI (nº 2016-003). Este trabalho também é otimizado para hESCs como H1 e H9. Amostras de sangue foram obtidas de indivíduos sadios com pleno consentimento informado. As iPSCs são geradas a partir de células mononucleares do sangue periférico (CMSP) de indivíduos saudáveis.

1. Cultura e manutenção de iPSCs

  1. Preparar placas revestidas com matriz de membrana basal reconstituindo a matriz de revestimento em knockout-DMEM na proporção de 1:80 e armazenar a 4 °C.
  2. Preparar meios de cultura iPSCs adicionando 50 mL de 10x meio de suplemento de células-tronco a 500 mL de meio basal de células-tronco, juntamente com 5 mL de 100x penicilina-estreptomicina (P/S) e armazenar a 4 °C para uso a curto prazo ou a -20 °C para uso a longo prazo.
  3. Forre as placas com matriz de revestimento - 1 mL para uma placa de 6 poços, 500 μL para uma placa de 12 poços, 250 μL para uma placa de 24 poços - e incube a placa a 37 °C por 1-2 h.
  4. Remova uma alíquota de meios de cultura iPSCs e pré-aqueça à temperatura ambiente antes de usar.
  5. Descongelar um frasco para injetáveis de iPSCs (CTEs ou iPSCs) em banho-maria a 37 °C e transferir para um tubo cônico de 15 mL contendo 2-3 mL de meio de cultura.
  6. Centrifugar o tubo a 120 x g durante 4 minutos à temperatura ambiente (RT-23 °C).
  7. Retirar o sobrenadante e adicionar 2 mL de meio de cultura fresco suplementado com 10 μM de inibidor de ROCK (Y-27632). Plaquear as células em um poço de uma placa de 6 poços revestida com matriz e colocar a placa a 37 °C.
  8. Após 24 h, retirar o meio e substituí-lo por meios de cultura frescos.
  9. Troque o meio todos os dias até que as células atinjam 80%-90% de confluência.
  10. Ao atingir a confluência, passe as células seguindo os passos descritos abaixo.
    1. Retire o meio e lave as células com solução salina tamponada com fosfato (DPBS) de Dulbecco.
    2. Adicionar reagente de dissociação iPSCs (ver Tabela de Materiais)-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços, 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços - e incubar por 1 min a 37 °C.
    3. Remover o reagente de dissociação e incubar as células secas por 1 min a 37 °C.
    4. Coletar as células usando meio de cultura - 1 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços - em um tubo cônico de 15 mL e centrífuga a 120 x g por 4 min.
    5. Ressuspender as células em meio de cultura - 2 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 500 μL para um poço de uma placa de 24 poços suplementado com inibidor de ROCK de 10 μM e plaqueá-las em placas revestidas com matriz fresca a 40% de confluência.

2. Diferenciação de iPSC em CTMs

  1. Preparar meios de diferenciação de CTM adicionando 15% de soro fetal bovino (SFB) e 1% P/S a DMEM + piruvato de baixa glicose e armazenar a 4 °C.
  2. Ao atingir 80% de confluência, utilizar iPSCs para formação do corpo embrionário (BE) seguindo os passos descritos abaixo.
    1. Lavar as células com DPBS e incubá-las com meio de dissociação/EDTA-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços, 250 μL para um poço de uma placa de 24 poços.
    2. Incubar a 37 °C durante 1 min, aspirar o reagente de dissociação e manter as células a 37 °C durante mais 1 min. Para iniciar a diferenciação MSC, ~10-12 x 106 células são necessárias.
    3. Coletar as células em um tubo cônico de 15 mL usando meios de cultura. Certifique-se de ser muito suave durante a coleta para evitar que as células fiquem únicas e permitir a formação de EB. Centrifugar as células a 120 x g durante 4 min.
    4. Ressuspender as células em 3 mL de meio de diferenciação de CTM contendo 10 μM de inibidor de ROCK.
    5. Misture e distribua 0,5 mL/poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.
      NOTA: O uso de placa de fixação ultrabaixa incentivaria a agregação celular em EBs em vez de sua fixação na superfície.
    6. Colocar a placa na incubadora a 37 °C.
  3. Após 24 h, induzir as EBs obtidas com tratamento com ácido retinóico (AR) seguindo os passos descritos abaixo.
    1. Adicionar 10 μM de RA a 3 mL de meio de diferenciação de CTM. Coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.
    2. Remover o sobrenadante das EBs e adicionar meio de diferenciação MSC suplementado com 10 μM RA.
    3. Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.
    4. Colocar a placa na incubadora a 37 °C. Não perturbe os EBs pelas próximas 48 h.
    5. Após 48 h, coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.
    6. Remover o sobrenadante das EBs e adicionar meios de diferenciação MSC suplementados com 0,1 μM de AR.
    7. Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço na mesma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços.
    8. Colocar a placa na incubadora a 37 °C. Não perturbe os EBs pelas próximas 48 h.
  4. Remova o RA adicionado às células seguindo as etapas descritas abaixo.
    1. Após 48 h do último tratamento da AR, coletar os EBs e deixá-los descansar por 15 min.
    2. Remover o sobrenadante e adicionar DMEM meio de baixa glicose sem citocinas.
    3. Ressuspenda suavemente e distribua 0,5 mL/poço em uma placa de fixação ultrabaixa de 24 poços. Colocar a placa na incubadora a 37 °C.
  5. Plaquete os EBs derivados de iPSCs seguindo as etapas descritas abaixo.
    1. Após 48 h da etapa anterior (etapa 2.4), coletar as EBs em um tubo de 15 mL e deixá-las descansar por 15 min.
    2. Remover o sobrenadante e ressuspender em 2 mL de meio de diferenciação de CTM fresco.
    3. Transfira para dois poços de uma placa de 6 poços revestida com matriz de membrana basal.
    4. Troque a mídia a cada dois dias por mais 5 dias.
    5. Após 5 dias, remover o meio gasto e substituí-lo por meio de diferenciação de CTM fresco contendo 2,5 ng/mL de fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF).
  6. Passe pelos EBs plaqueados quando atingirem 80%-90% de confluência, seguindo os passos descritos abaixo.
    1. Lave as células com DPBS, adicione tripsina-EDTA-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços e incube as células a 37 °C por 3 min.
    2. Coletar as células usando meios de diferenciação de CTM em um tubo cônico de 15 mL e girar a 750 x g por 4 min.
    3. Ressuspender em meio de diferenciação de CTM com 2,5 ng/mL de bFGF e plaquear as células em placas revestidas com matriz de membrana basal na proporção de 1:3.
    4. Repita a passagem quando as células atingirem 70%-80% de confluência. Espera-se que ganhe 3-6 milhões de células por 2-3 passagens.

3. Análise por citometria de fluxo de CTMs derivadas de iPSCs

NOTA: Ao passar por 2-3 passagens, as células devem ser acessadas para a eficiência da diferenciação das CTM. A diferenciação será considerada bem-sucedida se as células expressarem marcadores de diferenciação CTM - CD44, CD73, CD90 e CD105 com mais de 90% de eficiência, e não expressarem níveis elevados de marcadores hematopoéticos - CD14, CD19, CD34 e CD45. A eficiência desses marcadores pode ser acessada seguindo os passos abaixo.

  1. Passe as células usando as etapas descritas acima (passo 2.6) e obtenha 1 x 105 células em um poço de uma placa de 96 poços com fundo em v.
  2. Centrifugar a placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C.
  3. Ressuspender 1 x 105 células em 100 μL de DPBS frio com 1 μL de anticorpo conjugado (Ab) (ver Tabela de Materiais) e incubar a 4 °C por 30-40 min, evitando a exposição à luz.
  4. Ressuspender mais 1 x 105 células em 100 μL de DPBS frio com o respectivo controle isotípico do Ab conjugado na concentração de 1:100 ) e incubar a 4 °C por 30-40 min evitando a exposição à luz.
  5. Após a incubação, centrifugar a placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante agitando a placa sobre a pia.
  6. Ressuspender as células em 100 μL de DPBS frio.
  7. Centrifugar as células a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Descarte o sobrenadante.
  8. Ressuspender as células em 200 μL de DPBS fria e coletar em tubos de microcentrífuga escuros e frios de 1,5 mL e mantê-los no gelo até serem analisados por classificação celular ativada por fluorescência (FACS).
  9. Para a análise FACS, distribua as células usando dispersão lateral (SSC-A) versus dispersão direta (FSC-A) para excluir os detritos. Além disso, distribua as células fechadas usando altura espalhada para frente (FSC-H) versus área dispersa para frente (FSC-A) para distinguir singlets de duplos da população de células vivas.
    NOTA: As células foram fechadas em relação ao deslocamento do controle isotípico para cada marcador, e um mínimo de 10.000 eventos fechados de cada amostra corada foi usado para análise.

4. Diferenciação das CTMs em adipócitos

  1. Preparar o meio basal de diferenciação de adipócitos adicionando 10% de reposição sérica knockout (KOSR), 1% de glutamina, 1% P/S, 4,5 ng/μL de glicose ao meio essencial mínimo (MEM)-alfa e armazenar a 4 °C.
  2. Permitir que as CTMs atinjam acima de 90% de confluência. Continue cultivando-os por mais 48 h para permitir que eles passem por um período de parada de crescimento.
  3. Preparar o meio de diferenciação completa dos adipócitos adicionando 100 μg/mL de 3-Isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 0,2 U/mL de insulina, 100 μM de indometacina e 10 μM de rosiglitazona ao meio basal.
  4. Remova o meio de diferenciação MSC e lave as células usando DPBS.
  5. Adicionar o meio completo de diferenciação de adipócitos - 2 mL para um poço de uma placa de 6 poços e 1 mL para um poço de uma placa de 12 poços - e incubar as células a 37 °C. Troque a mídia de diferenciação completa a cada dois dias por 14 dias.

5. Avaliação da eficiência de diferenciação de adipócitos

  1. No 14º dia de diferenciação, verificar a eficiência da diferenciação pela coloração das células para marcadores de maturação de adipócitos, FABP4 e adiponectina.
  2. Retire o meio e lave as células com DPBS.
  3. Fixar as células com paraformaldeído (PFA) a 4% - 200 μL em um poço de placa de 24 poços - e incubar à temperatura ambiente por 15 min.
  4. Eliminar o PFA e lavar com solução salina tris-tamponada com tween 0,5% (TBST) e colocá-lo em um agitador à temperatura ambiente por 15 min. Repita o processo duas vezes.
  5. Permeabilizar as células fixas com solução salina tamponada com fosfato com Triton X-100 a 0,5% (PBST) e colocá-las em um agitador à temperatura ambiente por 15-20 min.
  6. Descarte o PBST e adicione o tampão de bloqueio (5%-6% de albumina de soro bovino (BSA) em PBST)-500 μL para um poço de uma placa de 6 poços e 250 μL para um poço de uma placa de 12 poços - e incube à temperatura ambiente no agitador por 40-60 min.
  7. Diluir os anticorpos primários contra FABP4, adiponectina em 2%-3% BSA, a uma concentração de 1:500 (ver Tabela de Materiais). Adicione estes anticorpos apenas se criados em animais diferentes e coloque a placa no agitador a 4 °C, durante a noite.
  8. Remova os anticorpos primários e lave as células três vezes com TBST (15 min cada) e coloque-as em um agitador à temperatura ambiente.
  9. Preparar anticorpos secundários Alexa Fluor em PBST (1:500). Incubar as células nas combinações de anticorpos secundários (de acordo com a espécie em que o anticorpo primário é elevado) por 60 minutos à temperatura ambiente e cobrir a placa com papel alumínio para protegê-la da luz.
  10. Descarte os anticorpos secundários, lave com TBST três vezes e coloque a placa no agitador.
  11. Para corar os núcleos, adicionar 1 μg/mL de Hoechst 33342-200 μL para um poço de uma placa de 24 poços diluída em PBS e incubar por 5 min à temperatura ambiente.
  12. Descarte a solução de Hoechst e adicione PBS-500 μL para um poço de uma placa de 24 poços às células. Mantenha as placas cobertas de luz até serem visualizadas em microscópio de fluorescência invertido.

6. Classificação de adipócitos usando vermelho do Nilo

  1. Preparar a solução de trabalho vermelha do Nilo adicionando 1 mg/ml de solução-mãe vermelha do Nilo em DMSO e conservar a -20 °C. Logo antes do uso, descongele o estoque vermelho do Nilo e reconstitua em DPBS para atingir a concentração de 300 nM da solução de trabalho.
  2. No ou após o 14º dia de diferenciação dos adipócitos, descarte o meio das células e lave com DPBS.
  3. Adicionar a solução de trabalho vermelha do Nilo -1 mL em um poço de uma placa de 6 poços - e incubar a 37 °C por 15 min.
  4. Remover a solução vermelha do Nilo e adicionar tripsina-EDTA -500 μL em um poço de uma placa de 6 poços - e incubar a 37 °C por 4 min.
  5. Coletar as células usando DMEM contendo FBS a 5% em um tubo cônico de 15 mL. Centrifugar a 750 x g por 4 min.
  6. Retirar o sobrenadante e ressuspender em DPBS-1 mL para 1 x 106 células. Centrifugar a 750 x g por 4 min.
  7. Retirar o sobrenadante e ressuspender em DPBS-1 mL para 1 x 106 células. Use um classificador FACS para isolar as células vermelhas positivas do Nilo usando o canal FL1.
  8. Recultivar as células selecionadas em meios de diferenciação de adipócitos ou coletar as células selecionadas para isolamento de RNA e proteínas.
  9. Extrair o RNA das células selecionadas e realizar análise quantitativa relativa dos marcadores de diferenciação de adipócitos, incluindo FABP4, PPARG e C/EBPA. As células vermelho-positivas do Nilo mostram um aumento significativo na expressão gênica de pelo menos duas vezes em comparação com as células não classificadas.

Resultados

Esquema e morfologia das células durante a diferenciação mesenquimal: A diferenciação de iPSCs em CTMs envolve vários estágios de desenvolvimento abrangendo a formação de EB, diferenciação de CTM e expansão de CTM (Figura 1). Durante esses estágios de desenvolvimento, as células adquirem várias morfologias devido aos diferentes produtos químicos estimulatórios a que são submetidas. Ao iniciar a diferenciação, as células são plaqueadas em suspensão e espera-se que sejam...

Discussão

Este protocolo tem importância primordial devido à sua capacidade de fornecer CTMs em alto rendimento e eficiência. Essa produção em massa de CTMs em escala foi possível pela incubação transitória de EBs derivadas de iPSCs com 10 μM de AR14,15. O tratamento transitório com 10 μM de AR aumentou o rendimento das CTM em 11,2 a 1542 vezes14,15, sendo esse protocolo aplicável tanto em iPSCs quanto...

Divulgações

Os autores declaram não ter interesses concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi financiado por uma bolsa do Qatar National Research Fund (QNRF) (Grant No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi foi apoiada pela bolsa GSRA do Qatar National Research Fund (QNRF).

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
AdiponectinAbcamab22554Adipocyte maturation marker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC differentiation marker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC differentiation marker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC differentiation marker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC differentiation marker
anti-CD44abcamab93758MSC differentiation marker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC differentiation marker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC differentiation marker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC differentiation marker
bFGFR&D233-FPMSC culture media supplement
C/EBPAAbcamab40761Adipocyte maturation marker
DexamethasoneTorics1126Adipocyte differentiation media supplement
FABP4Abcamab93945Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serumThermoFisher10082147MSC culture media supplement
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC culture media supplement
IBMXSigma AldrichI5879Adipocyte differentiation media supplement
IndomethacinSigma AldrichI7378Adipocyte differentiation media supplement
InsulinSigma Aldrich91077CAdipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEMThermoFisher11885084MSC culturing media
MatrigelCorning354230Coating matrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipocyte differentiation media
NileredSigma Aldrich19123Sorting marker for adipocyte
PenicillinThermoFisher15140122MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered salineThermoFisher14190144wash buffer
Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358wash buffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipocyte maturation marker
ReLeSRStem Cell Technologies5872Dissociation reagent
Retinoic acidSigma AldrichR2625MSC differentiation media supplement
Rock inhibitorTocris1254/10hPSC culture media supplement
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Adipocyte differentiation media supplement
StemFlexThermoFisherA334901hPSC culture media
TritonThermo Fisher28314Permebealization reagent
TrypsinThermoFisher25200072Dissociation reagent
Tween 20Sigma AldrichP7942Wash buffer

Referências

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