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要約

このプロトコルにより、人工多能性幹細胞(iPSC)から純粋な脂肪細胞集団を作製することができます。レチノイン酸は、iPS細胞を脂肪細胞の産生に使用される間葉系幹細胞(MSC)に分化させるために使用されます。次に、ナイルレッド染色に基づくソーティングアプローチを使用して、純粋な脂肪細胞を取得します。

要約

人工多能性幹細胞(iPSC)技術の最近の進歩により、脂肪細胞を含むさまざまな種類の細胞の生成が可能になりました。しかしながら、現在の分化方法は効率が低く、脂肪細胞の均質な集団を産生しない。ここでは、オールトランスレチノインベースの方法を使用して間葉系幹細胞(MSC)を高収率で製造することにより、この問題を回避します。細胞の増殖、生存、接着を支配する経路を調節することにより、私たちの分化戦略は、多能性MSCの純粋な集団に分化する胚体(EB)の効率的な生成を可能にします。この方法によって生成される多数のMSCは、脂肪細胞を生成するための理想的な供給源を提供します。しかしながら、脂肪細胞の分化に起因するサンプルの不均一性は依然として課題である。そこで、FACSを用いた脂質含有成熟脂肪細胞の精製にはナイルレッドベースの法を用いた。このソーティング戦略により、サンプルの不均一性を低減し、細胞機能を強化した脂肪細胞のプールを使用して、脂肪細胞関連の代謝障害をモデル化する信頼性の高い方法を確立することができました。

概要

間葉系幹細胞(MSC)は、脂肪細胞、骨細胞、軟骨細胞などの中胚葉起源の細胞を産生するための効果的な一時的なリソースとして機能し、それぞれの遺伝性疾患のモデリングにさらに使用できます。しかし、以前のアプローチでは、これらのMSCを成体組織から得ることに依存しており1、ドナーから大量に入手するという課題と、最適ではないin vitro培養条件で機能的に生存し続けるという限界がありました1,2。これらの障害は、in vitroでMSCを生成するためのプロトコルを有するという大きな要求を生み出している。ヒト人工多能性幹細胞(iPSC)は、MSCの特徴を示すMSCの貴重な供給源として使用することができます3,4,5。iPS細胞由来の間葉系幹細胞は、いくつかの疾患の治療選択肢として使用できます。また、iPS細胞由来のMSCは脂肪細胞を生成する能力があるため、ヒトの脂肪生成、肥満、および脂肪細胞関連疾患を研究するための貴重なin vitroヒトモデルになります。

脂肪細胞の現在の分化プロトコルは2つのグループに分類でき、1つは化学的またはタンパク質ベースのカクテルを使用した脂肪細胞の分化を含み、結果として得られる収量は30%-60%6,7,8,9であり、もう1つは脂肪細胞の発生を支配する主要な転写因子の堅牢な誘導のための遺伝子操作を含み、80%-90%の収量をもたらします10。11.しかし、遺伝子操作は脂肪細胞分化の自然な過程を再現せず、脂肪生成中に到着する微妙なパラダイムを隠すことが多く、疾患モデリングの目的には効果がありません12,13。そこで、ナイルレッドを用いて脂質を含む脂肪細胞に蛍光タグを付けることで、化学的に由来した成熟脂肪細胞と未成熟脂肪細胞を選別する方法を提示します。

ここでは、iPS細胞由来の胚様体(EB)をオールトランス レチノイン酸と一過性インキュベートして、脂肪細胞の生成にさらに使用できる多数の急速に増殖するMSCを生成するプロトコルを紹介します14。また、親油性色素を使用して脂肪滴に蛍光タグを付けることにより、化学的に誘導された成熟脂肪細胞を不均一な分化プールから選別する方法も紹介します。ナイルレッド。これにより、脂肪細胞関連代謝障害を正確にモデル化するための機能が強化された成熟脂肪細胞の純粋な集団の生成が可能になります。

プロトコル

この研究は、適切な機関研究倫理委員会によって承認され、1964年のヘルシンキ宣言およびその後の改正または同等の倫理基準に定められた倫理基準に従って実施されています。このプロトコルは、HMC(番号16260/16)およびQBRI(番号2016-003)の治験審査委員会(IRB)によって承認されました。この作業は、H1やH9などのhESCにも最適化されています。血液サンプルは、完全なインフォームドコンセントで健康な個人から取得されました。iPS細胞は、健常人の末梢血単核球(PBMC)から作製されます。

1. iPS細胞の培養と維持

  1. ノックアウトDMEMでコーティングマトリックスを1:80の割合で再構成して基底膜マトリックスコーティングプレートを調製し、4°Cで保存します。
  2. 500 mLの幹細胞基礎培地に50 mLの10x幹細胞サプリメント培地と5 mLの100xペニシリン-ストレプトマイシン(P / S)を加えてiPS細胞培養培地を調製し、短期の場合は4°C、長期使用の場合は-20°Cで保存します。
  3. プレートをコーティングマトリックス(6ウェルプレートの場合は1 mL、12ウェルプレートの場合は500 μL、24ウェルプレートの場合は250 μL)で裏打ちし、プレートを37°Cで1〜2時間インキュベートします。
  4. iPS細胞培養培地のアリコートを取り出し、室温で予熱してから使用してください。
  5. iPSC(ESCまたはiPSC)のバイアルを37°Cの水浴で解凍し、2〜3 mLの培養培地を含む15 mLのコニカルチューブに移します。
  6. チューブを120 x g で室温(RT-23°C)で4分間遠心分離します。
  7. 上清を除去し、10 μM ROCK阻害剤(Y-27632)を添加した新鮮な培地2 mLを加えます。細胞をマトリックスコーティングされた6ウェルプレートの1ウェルにプレートし、プレートを37°Cで配置します。
  8. 24時間後、培地を取り出し、新鮮な培地と交換します。
  9. 細胞が80%〜90%のコンフルエントに達するまで、毎日培地を交換してください。
  10. コンフルエントに達したら、以下に概説する手順に従って細胞を継代する。
    1. 培地を取り出し、ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水(DPBS)で細胞を洗浄します。
    2. iPS細胞解離試薬( 材料表参照)-6ウェルプレートのウェルに500 μL、24ウェルプレートのウェルに250 μLを加え、37°Cで1分間インキュベートします。
    3. 解離試薬を除去し、細胞を37°Cで1分間インキュベートします。
    4. 培養培地(6ウェルプレートのウェルには1 mL、24ウェルプレートのウェルには250 μL)を使用して細胞を回収し、15 mLコニカルチューブに入れ、120 x g で4分間遠心分離します。
    5. 細胞を培養培地(6ウェルプレートのウェルには2 mL)、10 μM ROCK阻害剤を添加した24ウェルプレートのウェルには500 μLを再懸濁し、40%コンフルエントで新しいマトリックスコーティングプレートにプレートします。

2. iPS細胞から間葉系幹細胞への分化

  1. 低グルコースDMEM+ピルビン酸に15%ウシ胎児血清(FBS)および1%P/Sを添加してMSC分化培地を調製し、4°Cで保存します。
  2. コンフルエント性が80%に達したら、以下に概説する手順に従って、iPS細胞を使用して胚様体(EB)形成を行います。
    1. 細胞をDPBSで洗浄し、解離培地/EDTA-500 μL(6ウェルプレートのウェル)と250 μL(24ウェルプレートのウェル)でインキュベートします。
    2. 37°Cで1分間インキュベートし、解離試薬を吸引し、細胞を37°Cでさらに1分間保持します。MSC分化を開始するには、~10-12 x 106 細胞が必要です。
    3. 培地を使用して15 mLのコニカルチューブに細胞を回収します。細胞が単一になるのを防ぎ、EB形成を可能にするために、収集中は非常に穏やかであることを確認してください。細胞を120 x g で4分間遠心分離します。
    4. 10 μM ROCK阻害剤を含む3 mLのMSC分化培地に細胞を再懸濁します。
    5. 0.5 mL/ウェルを24ウェル超低アタッチメントプレートで混合して分配します。
      注:超低アタッチメントプレートを使用すると、表面への付着ではなく、EBへの細胞凝集が促進されます。
    6. プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。
  3. 24時間後、以下に概説する手順に従って、高レチノイン酸(RA)治療で達成されたEBを誘導します。
    1. 10 μM RA を 3 mL の MSC 分化培地に添加します。EBを15 mLチューブに集め、15分間落ち着かせます。
    2. EBから上清を除去し、10 μM RAを添加したMSC分化培地を追加します。
    3. 穏やかに再懸濁し、同じ24ウェル超低アタッチメントプレートに0.5 mL/ウェルを分配します。
    4. プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。 次の48時間はEBを邪魔しないでください。
    5. 48時間後、EBを15 mLチューブに集め、15分間落ち着かせます。
    6. EBから上清を除去し、0.1 μM RAを添加したMSC分化培地を追加します。
    7. 穏やかに再懸濁し、同じ24ウェル超低アタッチメントプレートに0.5 mL/ウェルを分配します。
    8. プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。 次の48時間はEBを邪魔しないでください。
  4. 以下に概説する手順に従って、セルに追加されたRAを削除します。
    1. 最後のRA治療の48時間後、EBを収集し、15分間落ち着かせます。
    2. 上清を除去し、サイトカインを含まないDMEM低グルコース培地を添加する。
    3. 穏やかに再懸濁し、0.5 mL/ウェルを24ウェル超低アタッチメントプレートに分配します。プレートを37°Cのインキュベーターに入れます。
  5. iPS細胞由来EBを以下に概説する手順に従ってプレートします。
    1. 前のステップ(ステップ2.4)から48時間後、EBを15 mLチューブに集め、15分間落ち着かせます。
    2. 上清を除去し、2 mLの新鮮なMSC分化培地に再懸濁します。
    3. 基底膜マトリックスコート6ウェルプレートの2つのウェルに移す。
    4. さらに5日間、一日おきにメディアを交換してください。
    5. 5日後、使用済み培地を取り除き、2.5 ng/mLの塩基性線維芽細胞増殖因子(bFGF)を含む新鮮なMSC分化培地と交換します。
  6. 以下に概説する手順に従って、メッキされたEBが80%〜90%のコンフルエントに達したら通過させます。
    1. 細胞をDPBSで洗浄し、トリプシン-EDTA-500 μLを6ウェルプレートのウェルに添加し、細胞を37°Cで3分間インキュベートします。
    2. 15 mL コニカルチューブ内の MSC 分化培地を使用して細胞を回収し、750 x g で 4 分間回転させます。
    3. 2.5 ng/mLのbFGFを含むMSC分化培地に再懸濁し、基底膜マトリックスコーティングプレート上に細胞を1:3の比率でプレートします。
    4. 細胞が70%〜80%のコンフルエントに達したら継代を繰り返します。2〜3回の継代で3〜600万個の細胞を獲得すると予想されています。

3. iPS細胞由来間葉系幹細胞のフローサイトメトリー解析

注:2〜3回の継代を受けたら、MSC分化の効率のために細胞にアクセスする必要があります。細胞がMSC分化マーカー-CD44、CD73、CD90、およびCD105を90%を超える効率で発現し、高レベルの造血マーカー-CD14、CD19、CD34、およびCD45を発現しない場合、分化は成功したと見なされます。これらのマーカーの効率には、以下の手順に従ってアクセスできます。

  1. 上記で概説したステップ(ステップ2.6)を使用して細胞を継代し、V底96ウェルプレートの1ウェルで1 x 105 細胞を達成します。
  2. プレートを375 x g で4°Cで4分間遠心分離します。
  3. 1 x 105 細胞を1 μLの結合抗体(Ab)を含む100 μLの冷DPBSに再懸濁し( 材料の表を参照)、光への暴露を防ぐために4°Cで30〜40分間インキュベートします。
  4. 別の1 x 105 細胞を100 μLの冷DPBSに再懸濁し、抱合型Abのそれぞれのアイソタイプコントロールを1:100の濃度で再懸濁し、4°Cで30〜40分間インキュベートして、光への曝露を防ぎます。
  5. インキュベーション後、プレートを375 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 シンクの上でプレートを振って上清を捨てます。
  6. 細胞を100 μLの冷たいDPBSに再懸濁します。
  7. 細胞を375 x g で4°Cで4分間遠心分離します。 上清を捨てる。
  8. 細胞を200 μLの冷DPBSに再懸濁し、暗くて冷たい1.5 mLマイクロ遠心チューブに集め、蛍光活性化セルソーティング(FACS)で分析されるまで氷上に保ちます。
  9. FACS解析では、側方散乱(SSC-A)と前方散乱(FSC-A)を使用して細胞を分散させ、破片を排除します。さらに、前方散乱高さ(FSC-H)と前方散乱領域(FSC-A)を使用してゲート細胞を分配し、生細胞集団からダブレットから一重項を区別します。
    注:細胞は、すべてのマーカーのアイソタイプコントロールのシフトに対してゲートされ、すべての染色サンプルから少なくとも10,000のゲートイベントが分析に使用されました。

4. 間葉系幹細胞の脂肪細胞への分化

  1. 最小必須培地(MEM)-αに10%ノックアウト血清置換(KOSR)、1%グルタミン、1%P/S、4.5 ng/μLのグルコースを添加して脂肪細胞分化基礎培地を調製し、4°Cで保存します。
  2. MSCが90%以上のコンフルエンシーに達するのを待ちます。成長停止期間を経るために、さらに48時間培養を続けます。
  3. 100 μg/mLの3-イソブチル-1-メチルキサンチン(IBMX)、1 μMのデキサメタゾン、0.2 U/mLのインスリン、100 μMのインドメタシン、および10 μMのロシグリタゾンを基礎培地に添加することにより、完全な脂肪細胞分化培地を調製します。
  4. MSC分化培地を除去し、DPBSを用いて細胞を洗浄します。
  5. 6ウェルプレートのウェルには完全脂肪細胞分化培地(2 mL)、12ウェルプレートのウェルには1 mLを加え、細胞を37°Cでインキュベートします。 14日間、一日おきに完全な分化培地を交換してください。

5. 脂肪細胞の分化効率の評価

  1. 分化14日目に、脂肪細胞成熟マーカー、FABP4、およびアディポネクチンについて細胞を染色することにより、分化効率を確認します。
  2. 培地を取り出し、細胞をDPBSで洗浄します。
  3. 4%パラホルムアルデヒド(PFA)(200 μL)を使用して細胞を24ウェルプレートのウェルに固定し、室温で15分間インキュベートします。
  4. PFAを廃棄し、0.5%トゥイーン(TBST)を含むトリス緩衝生理食塩水を使用して洗浄し、室温で15分間シェーカーに置きます。このプロセスを2回繰り返します。
  5. 固定した細胞を0.5%Triton X-100(PBST)を含むリン酸緩衝生理食塩水で透過処理し、室温で15〜20分間シェーカー上に置きます。
  6. PBSTを廃棄し、ブロッキングバッファー(PBST中の5%-6%ウシ血清アルブミン(BSA))-6ウェルプレートのウェルには500 μL、12ウェルプレートのウェルには250 μLを加え、シェーカー上で室温で40〜60分間インキュベートします。
  7. FABP4に対する一次抗体、アディポネクチンを2%〜3%BSAで1:500の濃度で希釈します( 材料表を参照)。異なる動物で飼育した場合にのみこれらの抗体を一緒に追加し、プレートを4°Cのシェーカーに一晩置きます。
  8. 一次抗体を除去し、細胞をTBSTで3回洗浄し(各15分)、室温でシェーカー上に置きます。
  9. アレクサ蛍光二次抗体をPBSTで調製します(1:500)。二次抗体の組み合わせ(一次抗体が産生される種に応じて)で細胞を室温で60分間インキュベートし、プレートをアルミホイルで覆って光から保護します。
  10. 二次抗体を廃棄し、TBSTで3回洗浄し、プレートをシェーカーに置きます。
  11. 核を染色するには、PBSで希釈した24ウェルプレートのウェルに1 μg/mLのHoechst 33342-200 μLを加え、室温で5分間インキュベートします。
  12. ヘキスト溶液を廃棄し、24ウェルプレートのウェルにPBS-500 μLを細胞に加えます。倒立蛍光顕微鏡で可視化するまで、プレートを光から覆ってください。

6. ナイルレッドを用いた脂肪細胞の選別

  1. DMSOに1 mg/mLのナイルレッドストック溶液を加えてナイルレッド作業溶液を調製し、-20°Cで保存します。 使用直前に、ナイルレッドストックを解凍し、DPBSで再構成して、300 nMの作業溶液濃度を達成します。
  2. 脂肪細胞分化の14日目以降に、細胞から培地を廃棄し、DPBSを用いて洗浄する。
  3. ナイルレッドの作業溶液-1 mLを6ウェルプレートのウェルに加え、37°Cで15分間インキュベートします。
  4. ナイルレッド溶液を除去し、トリプシン-EDTA -500 μLを6ウェルプレートのウェルに加え、37°Cで4分間インキュベートします。
  5. 15 mL コニカルチューブ内の 5% FBS を含む DMEM を使用して細胞を回収します。750 x g で4分間遠心分離します。
  6. 上清を除去し、DPBS-1 mL に 1 x 106 細胞分間再懸濁します。750 x g で4分間遠心分離します。
  7. 上清を除去し、DPBS-1 mL に 1 x 106 細胞分間再懸濁します。FACSソーターを使用して、FL1チャネルを使用してナイル赤陽性細胞を単離します。
  8. 選別した細胞を脂肪細胞分化培地で再培養するか、選別した細胞を集めてRNAやタンパク質を単離します。
  9. 選別した細胞からRNAを抽出し、FABP4、PPARG、C/EBPAなどの脂肪細胞分化マーカーの相対定量解析を行います。ナイル赤陽性細胞は、選別されていない細胞と比較して、少なくとも2倍の遺伝子発現の有意なアップレギュレーションを示す。

結果

間葉系分化における細胞の概略と形態:iPS細胞から間葉系幹細胞への分化には、EB形成、MSC分化、MSC増殖にまたがるさまざまな発生段階があります(図1)。発生のこれらの段階で、細胞は、それらが受ける異なる刺激化学物質のために様々な形態を獲得する。分化を開始すると、細胞は懸濁液に播種され、直径が小から中のサイズでありながら、明確な細胞境界を持つ円形?...

ディスカッション

このプロトコルは、MSCを高い収率と効率で提供できるため、最も重要です。このMSCの大量生産は、iPS細胞由来EBと10 μMのRA14,15との一過性インキュベーションによって可能になりました。10 μMのRAによる一過性治療は、MSC収量を11.2〜1542倍に増加させ14,15、このプロトコルはiPS細胞とhPSCの両方に適用できま?...

開示事項

著者は、競合する利益がないことを宣言します。

謝辞

この作業は、カタール国立研究基金(QNRF)からの助成金によって資金提供されました(助成金番号NPRP10-1221-160041)。マリアム・アガディは、カタール国立研究基金(QNRF)からのGSRA奨学金の支援を受けました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
AdiponectinAbcamab22554Adipocyte maturation marker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC differentiation marker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC differentiation marker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC differentiation marker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC differentiation marker
anti-CD44abcamab93758MSC differentiation marker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC differentiation marker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC differentiation marker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC differentiation marker
bFGFR&D233-FPMSC culture media supplement
C/EBPAAbcamab40761Adipocyte maturation marker
DexamethasoneTorics1126Adipocyte differentiation media supplement
FABP4Abcamab93945Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serumThermoFisher10082147MSC culture media supplement
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC culture media supplement
IBMXSigma AldrichI5879Adipocyte differentiation media supplement
IndomethacinSigma AldrichI7378Adipocyte differentiation media supplement
InsulinSigma Aldrich91077CAdipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEMThermoFisher11885084MSC culturing media
MatrigelCorning354230Coating matrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipocyte differentiation media
NileredSigma Aldrich19123Sorting marker for adipocyte
PenicillinThermoFisher15140122MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered salineThermoFisher14190144wash buffer
Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358wash buffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipocyte maturation marker
ReLeSRStem Cell Technologies5872Dissociation reagent
Retinoic acidSigma AldrichR2625MSC differentiation media supplement
Rock inhibitorTocris1254/10hPSC culture media supplement
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Adipocyte differentiation media supplement
StemFlexThermoFisherA334901hPSC culture media
TritonThermo Fisher28314Permebealization reagent
TrypsinThermoFisher25200072Dissociation reagent
Tween 20Sigma AldrichP7942Wash buffer

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