JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול מאפשר יצירת אוכלוסיית אדיפוציט טהורה מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs). חומצה רטינואית משמשת להתמיינות iPSCs לתאי גזע מזנכימליים (MSCs) המשמשים לייצור אדיפוציטים. לאחר מכן, גישת מיון המבוססת על צביעה אדומה של הנילוס משמשת להשגת אדיפוציטים טהורים.

Abstract

ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיית תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) אפשרה יצירה של סוגי תאים שונים, כולל אדיפוציטים. עם זאת, שיטות ההבחנה הנוכחיות הן בעלות יעילות נמוכה ואינן מייצרות אוכלוסייה הומוגנית של אדיפוציטים. כאן, אנו עוקפים בעיה זו באמצעות שיטה מבוססת all-trans רטינואית לייצור תאי גזע מזנכימליים (MSC) בתפוקה גבוהה. על ידי ויסות מסלולים השולטים בהתפשטות, הישרדות והיצמדות תאים, אסטרטגיית ההתמיינות שלנו מאפשרת יצירה יעילה של גופים עובריים (EBs) המתמיינים לאוכלוסייה טהורה של MSCs רב-עוצמה. המספר הגבוה של MSCs שנוצרו על ידי שיטה זו מספק מקור אידיאלי ליצירת אדיפוציטים. עם זאת, הטרוגניות הדגימה הנובעת מהתמיינות אדיפוציטים נותרה אתגר. לכן, השתמשנו בשיטה מבוססת אדום הנילוס לטיהור אדיפוציטים בוגרים נושאי שומנים באמצעות FACS. אסטרטגיית מיון זו אפשרה לנו לבסס דרך אמינה למדל הפרעות מטבוליות הקשורות לאדיפוציט באמצעות מאגר של אדיפוציטים עם הטרוגניות דגימה מופחתת ופונקציונליות תאים משופרת.

Introduction

תאי גזע מזנכימליים (MSCs) פועלים כמשאב חולף יעיל לייצור תאים ממוצא מזודרמלי כמו אדיפוציטים, אוסטיאוציטים וכונדרוציטים, אשר יכולים לשמש עוד יותר למידול ההפרעות הגנטיות שלהם. עם זאת, גישות קודמות הסתמכו על השגת MSCs אלה מרקמות בוגרות 1, אשר הטילו את האתגר של השגתם במספרים גבוהים מהתורמים, ואת המגבלה של שמירה על יכולת התפקוד שלהם בתנאי תרבית חוץ גופית תת-אופטימליים 1,2. מכשולים אלה יצרו דרישה גדולה של פרוטוקול ליצירת MSCs במבחנה. תאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם (iPSCs) יכולים לשמש כמקור רב ערך של MSCs, המציגים מאפייני MSC 3,4,5. MSCs הנגזרים מ- iPSCs יכולים לשמש כאופציה טיפולית במספר מחלות. כמו כן, היכולת של MSCs שמקורם ב- iPSCs לייצר אדיפוציטים, הופכת אותם למודל אנושי בעל ערך במבחנה לחקר אדיפוגנזה אנושית, השמנת יתר והפרעות הקשורות לאדיפוציטים.

ניתן לסווג את פרוטוקולי ההתמיינות הנוכחיים של אדיפוציטים לשתי קבוצות, כאשר האחת כוללת התמיינות של אדיפוציטים באמצעות קוקטיילים כימיים או מבוססי חלבון המניבה תשואה של 30%-60%6,7,8,9, ואילו השנייה כוללת מניפולציה גנטית לאינדוקציה חזקה של גורמי שעתוק מרכזיים השולטים בהתפתחות האדיפוציטים כדי לתת תשואה של 80%-90%10, 11. עם זאת, מניפולציה גנטית אינה משחזרת את התהליך הטבעי של התמיינות אדיפוציטים, ולעתים קרובות מסווה את הפרדיגמות העדינות המגיעות במהלך אדיפוגנזה, מה שהופך אותה ללא יעילה למטרות מידול מחלות12,13. לכן, אנו מציגים דרך למיין אדיפוציטים בוגרים שמקורם כימי מאדיפוציטים לא בוגרים על ידי תיוג פלואורסצנטי של אדיפוציטים נושאי שומנים באמצעות אדום הנילוס.

כאן אנו מציגים פרוטוקול הכולל דגירה חולפת של גופים עובריים שמקורם ב- iPSCs (EBs) עם חומצה רטינואית all-trans כדי לייצר מספר גבוה של MSCs המתרבים במהירות, אשר יכולים לשמש עוד יותר לייצור אדיפוציטים14. אנו גם מציגים דרך למיין אדיפוציטים בוגרים שמקורם כימי ממאגר ההתמיינות ההטרוגנית על ידי תיוג פלואורסצנטי של טיפות השומנים שלהם באמצעות צבע ליפופילי; אדום הנילוס. זה יאפשר יצירת אוכלוסייה טהורה של אדיפוציטים בוגרים עם פונקציונליות משופרת כדי למדל במדויק הפרעות מטבוליות הקשורות לאדיפוציטים.

Protocol

המחקר אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית המתאימה ובוצע בהתאם לסטנדרטים האתיים כפי שנקבעו בהצהרת הלסינקי משנת 1964 ותיקוניה המאוחרים יותר או סטנדרטים אתיים דומים. הפרוטוקול אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של HMC (מס '16260/16) ו- QBRI (מס '2016-003). עבודה זו ממוטבת גם עבור תאי גזע עובריים (HESC) כגון H1 ו-H9. דגימות דם נלקחו מאנשים בריאים בהסכמה מדעת מלאה. תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים נוצרים מתאי דם חד-גרעיניים היקפיים (PBMCs) של אנשים בריאים.

1. טיפוח ותחזוקה של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים

  1. הכינו לוחות מטריצת ממברנת מרתף על ידי בנייה מחדש של מטריצת ציפוי בנוקאאוט-DMEM ביחס של 1:80 ואחסנו ב -4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן מדיה תרבית iPSCs על ידי הוספת 50 מ"ל של 10x מדיה תוספת תאי גזע ל 500 מ"ל של מדיה בסיסית של תאי גזע, יחד עם 5 מ"ל של 100x פניצילין-סטרפטומיצין (P / S) ולאחסן ב 4 ° C לטווח קצר או ב -20 ° C לשימוש לטווח ארוך.
  3. רפדו את הלוחות במטריצת ציפוי - 1 מ"ל לצלחת 6 בארות, 500 מיקרוליטר לצלחת 12 בארות, 250 מיקרוליטר לצלחת 24 בארות - ודגרו על הצלחת ב 37 מעלות צלזיוס למשך 1-2 שעות.
  4. יש להסיר אליציטוט של מצעי תרבית iPSCs ולחמם מראש בטמפרטורת החדר לפני השימוש.
  5. הפשירו בקבוקון של iPSCs (ESCs או iPSCs) באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס והעבירו לצינור חרוטי של 15 מ"ל המכיל 2-3 מ"ל של מדיה תרבותית.
  6. צנטריפוגה את הצינור ב 120 x גרם במשך 4 דקות בטמפרטורת החדר (RT-23 ° C).
  7. הסר את supernatant ולהוסיף 2 מ"ל של מדיה תרבותית טרייה בתוספת מעכב ROCK 10 μM (Y-27632). לוחים את התאים בבאר אחת של צלחת 6 בארות מצופת מטריצה ומניחים את הצלחת בטמפרטורה של 37°C.
  8. לאחר 24 שעות, הסר את המדיה והחלף אותה במדיה תרבותית רעננה.
  9. שנה את המדיה כל יום עד שהתאים מגיעים למפגש של 80%-90%.
  10. עם ההגעה למפגש, עברו תאים על ידי ביצוע השלבים המתוארים להלן.
    1. הסר את המדיה ושטוף את התאים עם מלח חוצץ פוספט של Dulbecco (DPBS).
    2. הוסף מגיב דיסוציאציה iPSCs (ראה טבלת חומרים)-500 μL עבור באר של צלחת 6 בארות, 250 μL עבור באר של צלחת 24 בארות - ודגור במשך דקה אחת ב 37 ° C.
    3. הסר את מגיב הדיסוציאציה ודגר על התאים יבשים במשך דקה אחת ב 37 מעלות צלזיוס.
    4. לאסוף את התאים באמצעות מדיה תרבית - 1 מ"ל עבור באר של צלחת 6 בארות ו 250 μL עבור באר של צלחת 24 באר - בתוך צינור חרוטי 15 מ"ל וצנטריפוגה ב 120 x גרם במשך 4 דקות.
    5. תאי השהיה מחדש בתרבית מדיה-2 מ"ל עבור באר של צלחת 6 בארות ו-500 מיקרוליטר עבור באר של צלחת 24 בארות בתוספת מעכב ROCK של 10 מיקרומטר וצלחת אותם על לוחות מצופים מטריצה טרייה במפגש של 40%.

2. הבחנה של iPSC לתוך MSCs

  1. הכן אמצעי התמיינות MSC על ידי הוספת 15% סרום בקר עוברי (FBS) ו- 1% P/S ל- DMEM + פירובט עם גלוקוז נמוך ואחסן ב- 4 ° C.
  2. עם ההגעה למפגש של 80%, יש להשתמש בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים ליצירת גוף עוברי (EB) בהתאם לשלבים המפורטים להלן.
    1. לשטוף את התאים עם DPBS ולדגור אותם עם מדיום דיסוציאציה / EDTA-500 μL עבור באר של צלחת 6 בארות, 250 μL עבור באר של צלחת 24 באר.
    2. לדגור ב 37 ° C במשך 1 דקות, לשאוף את מגיב דיסוציאציה ולשמור את התאים ב 37 ° C למשך 1 דקות נוספות. כדי להתחיל התמיינות MSC, ~ 10-12 x 106 תאים נדרשים.
    3. לאסוף את התאים בצינור חרוטי 15 מ"ל באמצעות מדיה תרבית. הקפידו להיות עדינים מאוד בזמן האיסוף כדי למנוע מהתאים להיות בודדים ולאפשר היווצרות EB. צנטריפוגה את התאים ב 120 x גרם במשך 4 דקות.
    4. השהה מחדש את התאים ב- 3 מ"ל של מדיית התמיינות MSC המכילה מעכב ROCK של 10 מיקרומטר.
    5. מערבבים ומפיצים 0.5 מ"ל/באר בצלחת חיבור אולטרה-נמוכה של 24 בארות.
      הערה: שימוש בלוח חיבור נמוך במיוחד יעודד צבירת תאים לתוך EBs במקום החיבור שלהם על פני השטח.
    6. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
  3. לאחר 24 שעות, לגרום EBs שהושגו עם טיפול חומצה רטינואית גבוהה (RA) על ידי ביצוע השלבים המפורטים להלן.
    1. הוסף 10 μM RA ל- 3 מ"ל של מדיית בידול MSC. אספו EBs בצינור של 15 מ"ל ואפשרו להם להתיישב למשך 15 דקות.
    2. הסר את supernatant מ EBs ולהוסיף מדיה בידול MSC בתוספת 10 μM RA.
    3. יש להשהות בעדינות ולפזר 0.5 מ"ל/באר באותה פלטת חיבור נמוכה במיוחד עם 24 בארות.
    4. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. אל תפריעו ל-EBs במשך 48 השעות הבאות.
    5. לאחר 48 שעות, לאסוף EBs בצינור 15 מ"ל ולאפשר להם להתיישב במשך 15 דקות.
    6. הסר את supernatant מ EBs ולהוסיף מדיה בידול MSC בתוספת 0.1 μM RA.
    7. יש להשהות בעדינות ולפזר 0.5 מ"ל/באר באותה פלטת חיבור נמוכה במיוחד עם 24 בארות.
    8. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס. אל תפריעו ל-EBs במשך 48 השעות הבאות.
  4. הסר את RA שנוסף לתאים על-ידי ביצוע השלבים המתוארים להלן.
    1. לאחר 48 שעות של טיפול RA האחרון, לאסוף את EBs ולאפשר להם להתיישב במשך 15 דקות.
    2. הסר את supernatant ולהוסיף DMEM גלוקוז נמוך מדיה ללא ציטוקינים.
    3. יש להשהות בעדינות ולפזר 0.5 מ"ל/באר בצלחת חיבור נמוכה במיוחד בעלת 24 בארות. מניחים את הצלחת באינקובטור ב 37 מעלות צלזיוס.
  5. צלחות את ה- EBs הנגזרים מ- iPSCs על-ידי ביצוע השלבים המפורטים להלן.
    1. לאחר 48 שעות מהשלב הקודם (שלב 2.4), לאסוף את EBs בצינור 15 מ"ל ולאפשר להם להתיישב במשך 15 דקות.
    2. הסר supernatant והשהה מחדש ב- 2 מ"ל של מדיית בידול MSC טרייה.
    3. מעבירים לשתי בארות של פלטת 6 בארות מצופה ממברנת מרתף.
    4. שנה את המדיה כל יומיים למשך 5 ימים נוספים.
    5. לאחר 5 ימים, הסר את המדיה המשומשת והחלף אותה במדיית התמיינות MSC טרייה המכילה 2.5 ננוגרם/מ"ל של גורם גדילה פיברובלסט בסיסי (bFGF).
  6. עברו את ה-EBs המצופים כאשר הם מגיעים למפגש של 80%-90%, על ידי ביצוע השלבים המפורטים להלן.
    1. לשטוף את התאים עם DPBS, להוסיף טריפסין-EDTA-500 μL עבור באר של צלחת 6 באר - ולדגור את התאים ב 37 ° C במשך 3 דקות.
    2. אסוף את התאים באמצעות מדיית התמיינות MSC בצינור חרוטי של 15 מ"ל וסובב ב 750 x גרם במשך 4 דקות.
    3. השהיה מחדש במדיית התמיינות MSC עם 2.5 ng/mL של bFGF ולוחית את התאים על לוחות ממברנת מרתף מצופים מטריצה ביחס של 1:3.
    4. חזור על המעבר כאשר התאים מגיעים למפגש של 70%-80%. הוא צפוי לצבור 3-6 מיליון תאים על ידי 2-3 מעברים.

3. ניתוח ציטומטריית זרימה של MSCs שמקורם ב- iPSCs

הערה: לאחר שעוברים 2-3 מעברים, יש לגשת לתאים ליעילות התמיינות MSC. התמיינות תיחשב מוצלחת אם התאים מבטאים סמני התמיינות MSC - CD44, CD73, CD90 ו- CD105 ביעילות של יותר מ -90%, ואינם מבטאים רמות גבוהות של סמנים המטופויטיים - CD14, CD19, CD34 ו- CD45. ניתן לגשת ליעילות של סמנים אלה על ידי ביצוע השלבים הבאים.

  1. עברו את התאים באמצעות השלבים המתוארים לעיל (שלב 2.6) והשיגו 1 x 105 תאים בבאר אחת של לוח V תחתון 96 בארות.
  2. צנטריפוגה את הצלחת ב 375 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C.
  3. יש להשהות מחדש 1 x 105 תאים ב-100 מיקרוליטר של DPBS קר עם 1 μL של נוגדן מצומד (Ab) (ראה טבלת חומרים) ולדגור ב-4°C למשך 30-40 דקות תוך מניעת חשיפה לאור.
  4. להשהות עוד 1 x 105 תאים ב 100 μL של DPBS קר עם בקרת איזוטיפ בהתאמה של Ab מצומד בריכוז של 1:100 ) ולדגור ב 4 ° C במשך 30-40 דקות מניעת חשיפה לאור.
  5. לאחר הדגירה, צנטריפוגה את הצלחת ב 375 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט על ידי ניעור הצלחת מעל הכיור.
  6. להשעות מחדש את התאים ב 100 μL של DPBS קר.
  7. צנטריפוגה את התאים ב 375 x גרם במשך 4 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנטנט.
  8. להשהות מחדש את התאים ב 200 μL של DPBS קר ולאסוף צינורות מיקרוצנטריפוגות חשוכים וקרים 1.5 מ"ל ולשמור אותם על קרח עד לניתוח על ידי מיון תאים מופעל פלואורסצנטי (FACS).
  9. עבור ניתוח FACS, התפזר את התאים באמצעות פיזור צדדי (SSC-A) לעומת פיזור קדימה (FSC-A) כדי לא לכלול את הפסולת. יתר על כן, פזרו את התאים המגודרים באמצעות גובה מפוזר קדימה (FSC-H) לעומת שטח מפוזר קדימה (FSC-A) כדי להבחין בין סינגלים לכפילים מאוכלוסיית התאים החיים.
    הערה: התאים היו מגודרים ביחס לשינוי בקרת האיזוטיפ עבור כל סמן, ומינימום של 10,000 אירועים מגודרים מכל דגימה מוכתמת שימשו לניתוח.

4. הבחנה של MSCs לתוך אדיפוציטים

  1. הכינו את חומרי העזר הבסיסיים להתמיינות אדיפוציט על ידי הוספת 10% תחליף סרום נוקאאוט (KOSR), 1% גלוטמין, 1% P/S, 4.5 ננוגרם/מיקרוליטר גלוקוז למדיה חיונית מינימלית (MEM)-אלפא ואחסנו בטמפרטורה של 4°C.
  2. אפשר ל-MSCs להגיע למפגש של מעל 90%. המשיכו לגדל אותם במשך 48 שעות נוספות כדי לאפשר להם לעבור תקופה של עצירת גדילה.
  3. הכן אמצעי התמיינות אדיפוציט מלא על ידי הוספת 100 מיקרוגרם/מ"ל של 3-איזובוטיל-1-מתיל-קסנטין (IBMX), 1 מיקרומטר של דקסמתזון, 0.2 U/מ"ל אינסולין, 100 מיקרומטר של אינדומתצין ו-10 מיקרומטר של רוזיגליטזון למדיה הבסיסית.
  4. הסר מדיית התמיינות של MSC ושטוף את התאים באמצעות DPBS.
  5. הוסף אמצעי התמיינות אדיפוציט מלא - 2 מ"ל לבאר של צלחת 6 בארות ו -1 מ"ל לבאר של צלחת 12 בארות - ודגר על התאים ב -37 מעלות צלזיוס. שנה את מדיית הבידול המלאה כל יומיים למשך 14 יום.

5. הערכת יעילות ההבחנה של אדיפוציטים

  1. ביום ה-14 להתמיינות, בדקו את יעילות ההתמיינות על ידי צביעת תאים לסמני הבשלת אדיפוציטים, FABP4 ואדיפונקטין.
  2. הסר את המדיה ושטוף את התאים עם DPBS.
  3. תקן את התאים באמצעות 4% paraformaldehyde (PFA) - 200 μL לבאר של צלחת 24 באר - ודגור בטמפרטורת החדר במשך 15 דקות.
  4. יש להשליך את ה-PFA ולשטוף באמצעות מלח חוצץ בתריס עם 0.5% טווין (TBST) ולהניח אותו על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 15 דקות. חזור על התהליך פעמיים.
  5. חדרו את התאים הקבועים במי מלח חוצצי פוספט עם 0.5% Triton X-100 (PBST) והניחו אותו על שייקר בטמפרטורת החדר למשך 15-20 דקות.
  6. יש להשליך את ה-PBST ולהוסיף את המאגר החוסם (אלבומין בסרום בקר 5%-6% (BSA) ב-PBST) - 500 מיקרוליטר לבאר של צלחת בעלת 6 בארות ו-250 מיקרוליטר לבאר של צלחת בת 12 בארות - ולדגור בטמפרטורת החדר על השייקר למשך 40-60 דקות.
  7. לדלל את הנוגדנים הראשוניים נגד FABP4, אדיפונקטין ב 2%-3% BSA, בריכוז של 1:500 (ראה טבלת חומרים). הוסיפו את הנוגדנים הללו יחד רק אם גדלו בבעלי חיים שונים והניחו את הצלחת על השייקר בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס, למשך הלילה.
  8. הסירו את הנוגדנים הראשוניים ושטפו את התאים שלוש פעמים עם TBST (15 דקות כל אחד) והניחו אותם על שייקר בטמפרטורת החדר.
  9. הכן נוגדנים משניים של Alexa Fluor ב- PBST (1:500). דוגרים על התאים בשילובי הנוגדנים המשניים (לפי המינים שבהם מגדלים את הנוגדן הראשוני) במשך 60 דקות בטמפרטורת החדר ומכסים את הצלחת ברדיד אלומיניום כדי להגן עליה מפני אור.
  10. השליכו את הנוגדנים המשניים, שטפו עם TBST שלוש פעמים והניחו את הצלחת על השייקר.
  11. כדי להכתים את הגרעינים, יש להוסיף 1 מיקרוגרם/מ"ל של Hoechst 33342-200 μL לבאר של צלחת 24 בארות מדוללת ב-PBS ולדגור במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.
  12. השליכו את תמיסת Hoechst והוסיפו PBS-500 μL לבאר של צלחת 24 בארות לתאים. שמור על הלוחות מכוסים מאור עד להדמיה באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.

6. מיון אדיפוציטים באמצעות אדום הנילוס

  1. הכן פתרון עבודה אדום נילוס על ידי הוספת 1 מ"ג / מ"ל תמיסת מלאי אדום הנילוס ב DMSO ולאחסן ב -20 ° C. ממש לפני השימוש, יש להפשיר את הזן האדום של הנילוס וליצור אותו מחדש ב-DPBS כדי להגיע לריכוז תמיסת עבודה של 300 ננומטר.
  2. ביום ה-14 של התמיינות האדיפוציט או אחריו, יש להשליך את המדיה מהתאים ולשטוף באמצעות DPBS.
  3. מוסיפים את תמיסת העבודה האדומה של הנילוס -1 מ"ל בבאר של צלחת 6 בארות - ודגרים ב 37 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
  4. מוציאים את התמיסה האדומה מהנילוס ומוסיפים טריפסין-EDTA -500 μL לבאר של צלחת בעלת 6 בארות ודגרים בטמפרטורה של 37°C למשך 4 דקות.
  5. אסוף את התאים באמצעות DMEM המכיל 5% FBS בצינור חרוטי של 15 מ"ל. צנטריפוגה ב 750 x גרם במשך 4 דקות.
  6. הסר את supernatant ו resuspend ב DPBS-1 מ"ל עבור 1 x 106 תאים. צנטריפוגה ב 750 x גרם במשך 4 דקות.
  7. הסר את supernatant ו resuspend ב DPBS-1 מ"ל עבור 1 x 106 תאים. השתמש בממיין FACS כדי לבודד את התאים האדומים האדומים של הנילוס באמצעות ערוץ FL1.
  8. תרבית מחדש את התאים הממוינים באמצעי התמיינות אדיפוציטים או לאסוף את התאים הממוינים לבידוד RNA וחלבונים.
  9. לחלץ RNA מהתאים הממוינים ולבצע ניתוח כמותי יחסי של סמני התמיינות אדיפוציטים, כולל FABP4, PPARG ו - C/EBPA. התאים האדומים-חיוביים של הנילוס מראים עלייה משמעותית בביטוי הגנים של לפחות שני קפלים בהשוואה לתאים לא ממוינים.

תוצאות

סכמות ומורפולוגיה של תאים במהלך התמיינות מזנכימלית: התמיינות של תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים לתאי MSC כרוכה בשלבי התפתחות שונים המשתרעים על פני היווצרות EB, התמיינות MSC והתרחבות MSC (איור 1). במהלך שלבי התפתחות אלה, תאים רוכשים מורפולוגיה שונה בשל כימיקלים מעוררים שונים שהם חש?...

Discussion

פרוטוקול זה הוא בעל חשיבות עליונה בשל יכולתו לספק MSCs בתפוקה גבוהה וביעילות. ייצור בקנה מידה המוני זה של MSCs התאפשר על ידי דגירה ארעית של EBs הנגזרים מ- iPSCs עם 10 מיקרומטר של RA14,15. טיפול חולף עם 10 מיקרומטר של RA שיפר את תפוקת MSC פי 11.2 עד 1542 פי14,15,

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין להם אינטרסים מתחרים.

Acknowledgements

עבודה זו מומנה על ידי מענק מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF) (מענק מס' NPRP10-1221-160041). מרים אגאדי נתמכה על ידי מלגת GSRA מקרן המחקר הלאומית של קטאר (QNRF).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AdiponectinAbcamab22554Adipocyte maturation marker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC differentiation marker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC differentiation marker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC differentiation marker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC differentiation marker
anti-CD44abcamab93758MSC differentiation marker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC differentiation marker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC differentiation marker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC differentiation marker
bFGFR&D233-FPMSC culture media supplement
C/EBPAAbcamab40761Adipocyte maturation marker
DexamethasoneTorics1126Adipocyte differentiation media supplement
FABP4Abcamab93945Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serumThermoFisher10082147MSC culture media supplement
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC culture media supplement
IBMXSigma AldrichI5879Adipocyte differentiation media supplement
IndomethacinSigma AldrichI7378Adipocyte differentiation media supplement
InsulinSigma Aldrich91077CAdipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEMThermoFisher11885084MSC culturing media
MatrigelCorning354230Coating matrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipocyte differentiation media
NileredSigma Aldrich19123Sorting marker for adipocyte
PenicillinThermoFisher15140122MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered salineThermoFisher14190144wash buffer
Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358wash buffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipocyte maturation marker
ReLeSRStem Cell Technologies5872Dissociation reagent
Retinoic acidSigma AldrichR2625MSC differentiation media supplement
Rock inhibitorTocris1254/10hPSC culture media supplement
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Adipocyte differentiation media supplement
StemFlexThermoFisherA334901hPSC culture media
TritonThermo Fisher28314Permebealization reagent
TrypsinThermoFisher25200072Dissociation reagent
Tween 20Sigma AldrichP7942Wash buffer

References

  1. Hass, R., Kasper, C., Bohm, S., Jacobs, R. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Communication and Signaling: CCS. 9, 12 (2011).
  2. Wagner, W., et al. Aging and replicative senescence have related effects on human stem and progenitor cells. PLoS One. 4 (6), 5846 (2009).
  3. Brown, P. T., Squire, M. W., Li, W. J. Characterization and evaluation of mesenchymal stem cells derived from human embryonic stem cells and bone marrow. Cell and Tissue Research. 358 (1), 149-164 (2014).
  4. Trivedi, P., Hematti, P. Derivation and immunological characterization of mesenchymal stromal cells from human embryonic stem cells. Experimental Hematology. 36 (3), 350-359 (2008).
  5. Barberi, T., Willis, L. M., Socci, N. D., Studer, L. Derivation of multipotent mesenchymal precursors from human embryonic stem cells. PLoS Medicine. 2 (6), 161 (2005).
  6. Xiong, C., et al. Derivation of adipocytes from human embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 14 (6), 671-675 (2005).
  7. Cuaranta-Monroy, I., et al. Highly efficient differentiation of embryonic stem cells into adipocytes by ascorbic acid. Stem Cell Research. 13 (1), 88-97 (2014).
  8. van Harmelen, V., et al. Differential lipolytic regulation in human embryonic stem cell-derived adipocytes. Obesity (Silver Spring). 15 (4), 846-852 (2007).
  9. Noguchi, M., et al. In vitro characterization and engraftment of adipocytes derived from human induced pluripotent stem cells and embryonic stem cells. Stem Cells and Development. 22 (21), 2895-2905 (2013).
  10. Ahfeldt, T., et al. Programming human pluripotent stem cells into white and brown adipocytes. Nature Cell Biology. 14 (2), 209-219 (2012).
  11. Lee, Y. K., Cowan, C. A. Differentiation of white and brown adipocytes from human pluripotent stem cells. Methods in Enzymology. 538, 35-47 (2014).
  12. Abdelalim, E. M. Modeling different types of diabetes using human pluripotent stem cells. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (6), 2459-2483 (2021).
  13. Abdelalim, E. M., Bonnefond, A., Bennaceur-Griscelli, A., Froguel, P. Pluripotent stem cells as a potential tool for disease modelling and cell therapy in diabetes. Stem Cell Reviews and Reports. 10 (3), 327-337 (2014).
  14. Karam, M., Younis, I., Elareer, N. R., Nasser, S., Abdelalim, E. M. Scalable Generation of mesenchymal stem cells and adipocytes from human pluripotent stem cells. Cells. 9 (3), (2020).
  15. Karam, M., Abdelalim, E. M. Robust and highly efficient protocol for differentiation of human pluripotent stem cells into mesenchymal stem cells. Methods in Molecular Biology. , (2020).
  16. Li, L., Bennett, S. A., Wang, L. Role of E-cadherin and other cell adhesion molecules in survival and differentiation of human pluripotent stem cells. Cell Adhesion & Migration. 6 (1), 59-70 (2012).
  17. Lai, L., Bohnsack, B. L., Niederreither, K., Hirschi, K. K. Retinoic acid regulates endothelial cell proliferation during vasculogenesis. Development. 130 (26), 6465-6474 (2003).
  18. Chanchevalap, S., Nandan, M. O., Merlin, D., Yang, V. W. All-trans retinoic acid inhibits proliferation of intestinal epithelial cells by inhibiting expression of the gene encoding Kruppel-like factor 5. FEBS Letters. 578 (1-2), 99-105 (2004).
  19. di Masi, A., et al. Retinoic acid receptors: from molecular mechanisms to cancer therapy. Molecular Aspects of Medicine. 41, 1 (2015).
  20. Simandi, Z., Balint, B. L., Poliska, S., Ruhl, R., Nagy, L. Activation of retinoic acid receptor signaling coordinates lineage commitment of spontaneously differentiating mouse embryonic stem cells in embryoid bodies. FEBS Letters. 584 (14), 3123-3130 (2010).
  21. De Angelis, M. T., Parrotta, E. I., Santamaria, G., Cuda, G. Short-term retinoic acid treatment sustains pluripotency and suppresses differentiation of human induced pluripotent stem cells. Cell Death & Disease. 9 (1), 6 (2018).
  22. Li, L., Dong, L., Wang, Y., Zhang, X., Yan, J. Lats1/2-mediated alteration of hippo signaling pathway regulates the fate of bone marrow-derived mesenchymal stem cells. BioMed Research International. 2018, 4387932 (2018).
  23. Moldes, M., et al. Peroxisome-proliferator-activated receptor gamma suppresses Wnt/beta-catenin signalling during adipogenesis. The Biochemical Journal. 376, 607-613 (2003).
  24. Ross, S. E., et al. Inhibition of adipogenesis by Wnt signaling. Science. 289 (5481), 950-953 (2000).
  25. Wang, Y. K., Chen, C. S. Cell adhesion and mechanical stimulation in the regulation of mesenchymal stem cell differentiation. Journal of Cellular and Molecular Medicine. 17 (7), 823-832 (2013).
  26. Mohsen-Kanson, T., et al. Differentiation of human induced pluripotent stem cells into brown and white adipocytes: role of Pax3. Stem Cells. 32 (6), 1459-1467 (2014).
  27. Billon, N., et al. The generation of adipocytes by the neural crest. Development. 134 (12), 2283-2292 (2007).
  28. Li, N., Kelsh, R. N., Croucher, P., Roehl, H. H. Regulation of neural crest cell fate by the retinoic acid and Pparg signalling pathways. Development. 137 (3), 389-394 (2010).
  29. Ussar, S., et al. ASC-1, PAT2, and P2RX5 are cell surface markers for white, beige, and brown adipocytes. Science Translational Medicine. 6 (247), (2014).
  30. Festy, F., et al. Surface protein expression between human adipose tissue-derived stromal cells and mature adipocytes. Histochemistry and Cell Biology. 124 (2), 113-121 (2005).
  31. Cai, L., Wang, Z., Ji, A., Meyer, J. M., vander Westhuyzen, D. R. Scavenger receptor CD36 expression contributes to adipose tissue inflammation and cell death in diet-induced obesity. PLoS One. 7 (5), 36785 (2012).
  32. Mesuret, G., et al. A neuronal role of the Alanine-Serine-Cysteine-1 transporter (SLC7A10, Asc-1) for glycine inhibitory transmission and respiratory pattern. Scientific Reports. 8 (1), 8536 (2018).
  33. Silverstein, R. L., Febbraio, M. CD36, a scavenger receptor involved in immunity, metabolism, angiogenesis, and behavior. Science Signaling. 2 (72), (2009).
  34. Brooimans, R. A., van Wieringen, P. A., van Es, L. A., Daha, M. R. Relative roles of decay-accelerating factor, membrane cofactor protein, and CD59 in the protection of human endothelial cells against complement-mediated lysis. European Journal of Immunology. 22 (12), 3135-3140 (1992).
  35. Davies, A., et al. CD59, an LY-6-like protein expressed in human lymphoid cells, regulates the action of the complement membrane attack complex on homologous cells. The Journal of Experimental Medicine. 170 (3), 637-654 (1989).
  36. Lapid, K., Graff, J. M. Form(ul)ation of adipocytes by lipids. Adipocyte. 6 (3), 176-186 (2017).
  37. Aldridge, A., et al. Assay validation for the assessment of adipogenesis of multipotential stromal cells--a direct comparison of four different methods. Cytotherapy. 15 (1), 89-101 (2013).
  38. Schaedlich, K., Knelangen, J. M., Navarrete Santos, A., Fischer, B., Navarrete Santos, A. A simple method to sort ESC-derived adipocytes. Cytometry A. 77 (10), 990-995 (2010).
  39. Costa, L. A., et al. Functional heterogeneity of mesenchymal stem cells from natural niches to culture conditions: implications for further clinical uses. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 78 (2), 447-467 (2021).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE180

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved