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  • Materiales
  • Referencias
  • Reimpresiones y Permisos

Resumen

El protocolo permite la generación de una población de adipocitos puros a partir de células madre pluripotentes inducidas (iPSCs). El ácido retinoico se utiliza para diferenciar las iPSC en células madre mesenquimales (MSC) que se utilizan para producir adipocitos. Luego, se utiliza un enfoque de clasificación basado en la tinción de rojo del Nilo para obtener adipocitos puros.

Resumen

Los avances recientes en la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) han permitido la generación de diferentes tipos de células, incluidos los adipocitos. Sin embargo, los métodos de diferenciación actuales tienen baja eficiencia y no producen una población homogénea de adipocitos. Aquí, evitamos este problema mediante el uso de un método basado en retinoico totalmente trans para producir células madre mesenquimales (MSC) en alto rendimiento. Al regular las vías que gobiernan la proliferación, supervivencia y adhesión celular, nuestra estrategia de diferenciación permite la generación eficiente de cuerpos embrionarios (EB) que se diferencian en una población pura de MSC multipotentes. El alto número de MSCs generadas por este método proporciona una fuente ideal para generar adipocitos. Sin embargo, la heterogeneidad de la muestra resultante de la diferenciación de los adipocitos sigue siendo un desafío. Por lo tanto, utilizamos un método basado en rojo del Nilo para purificar los adipocitos maduros que contienen lípidos mediante FACS. Esta estrategia de clasificación nos permitió establecer una forma confiable de modelar los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos utilizando un grupo de adipocitos con heterogeneidad reducida de la muestra y funcionalidad celular mejorada.

Introducción

Las células madre mesenquimales (MSC) actúan como un recurso transitorio eficaz para producir células de origen mesodérmico como adipocitos, osteocitos y condrocitos, que podrían usarse para modelar sus respectivos trastornos genéticos. Sin embargo, los enfoques anteriores se basaron en la obtención de estas MSC a partir de tejidos adultos 1, lo que impuso el desafío de obtenerlas en grandes cantidades de los donantes, y la limitación de mantenerlas funcionalmente viables en condiciones de cultivo in vitro subóptimas 1,2. Estos obstáculos han producido una gran demanda de contar con un protocolo para generar MSCs in vitro. Las células madre pluripotentes inducidas humanas (iPSCs) pueden ser utilizadas como una valiosa fuente de MSCs, exhibiendo características MSC 3,4,5. Las MSC derivadas de iPSCs se pueden utilizar como una opción terapéutica en varias enfermedades. Además, la capacidad de las MSC derivadas de iPSCs para generar adipocitos, las convierte en un valioso modelo humano in vitro para estudiar la adipogénesis humana, la obesidad y los trastornos asociados a los adipocitos.

Los protocolos actuales de diferenciación de los adipocitos se pueden clasificar en dos grupos, uno que implica la diferenciación de los adipocitos utilizando cócteles químicos o basados en proteínas que dan un rendimiento resultante de 30%-60%6,7,8,9, mientras que el otro implica la manipulación genética para la inducción robusta de factores de transcripción clave que rigen el desarrollo de los adipocitos para dar un rendimiento del 80%-90%10, 11. Sin embargo, la manipulación genética no recapitula el proceso natural de diferenciación de los adipocitos, y a menudo enmascara los paradigmas sutiles que llegan durante la adipogénesis, haciéndola ineficaz para fines de modelado de enfermedades12,13. Por lo tanto, presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente de los inmaduros marcando fluorescentemente los adipocitos que contienen lípidos utilizando rojo del Nilo.

Aquí presentamos un protocolo que involucra la incubación transitoria de cuerpos embrioides (EB) derivados de iPSCs con ácido todo-trans retinoico para producir un alto número de MSCs de rápida proliferación, que podrían ser utilizados para generar adipocitos14. También presentamos una forma de clasificar los adipocitos maduros derivados químicamente del grupo de diferenciación heterogénea marcando fluorescentemente sus gotas de lípidos utilizando un colorante lipofílico; Rojo del Nilo. Esto permitiría la generación de una población pura de adipocitos maduros con funcionalidad mejorada para modelar con precisión los trastornos metabólicos asociados a los adipocitos.

Protocolo

El estudio ha sido aprobado por el comité ético de investigación institucional apropiado y realizado siguiendo los estándares éticos establecidos en la Declaración de Helsinki de 1964 y sus enmiendas posteriores o estándares éticos comparables. El protocolo fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional (IRB) de HMC (no. 16260/16) y QBRI (no. 2016-003). Este trabajo también está optimizado para hESCs como H1 y H9. Se obtuvieron muestras de sangre de individuos sanos con pleno consentimiento informado. Las iPSCs se generan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMCs) de individuos sanos.

1. Cultivo y mantenimiento de iPSCs

  1. Preparar las placas recubiertas de matriz de membrana basal reconstituyendo la matriz de recubrimiento en DMEM knockout en una proporción de 1:80 y almacenar a 4 °C.
  2. Prepare medios de cultivo iPSCs agregando 50 ml de 10x medios de suplemento de células madre a 500 ml de medios basales de células madre, junto con 5 ml de 100x penicilina-estreptomicina (P/S) y guárdelos a 4 °C para uso a corto plazo o a -20 °C para uso a largo plazo.
  3. Forrar las placas con matriz de recubrimiento (1 ml para una placa de 6 pocillos, 500 μL para una placa de 12 pocillos, 250 μL para una placa de 24 pocillos) e incubar la placa a 37 °C durante 1-2 h.
  4. Retire una alícuota de medios de cultivo iPSCs y precaliente a temperatura ambiente antes de usar.
  5. Descongele un vial de iPSCs (ESCs o iPSCs) en un baño maría a 37 °C y transfiéralo a un tubo cónico de 15 mL que contenga 2-3 mL de medios de cultivo.
  6. Centrifugar el tubo a 120 x g durante 4 min a temperatura ambiente (RT-23 °C).
  7. Retire el sobrenadante y agregue 2 ml de medios de cultivo frescos suplementados con un inhibidor ROCK de 10 μM (Y-27632). Colocar las células en un pocillo de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz y colocar la placa a 37 °C.
  8. Después de 24 h, retire el medio y reemplácelo con medios de cultivo frescos.
  9. Cambie los medios todos los días hasta que las células alcancen el 80% -90% de confluencia.
  10. Al llegar a la confluencia, pase las celdas siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Retire el medio y lave las células con solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco.
    2. Añadir reactivo de disociación iPSCs (ver Tabla de materiales) -500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos, 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos e incubar durante 1 min a 37 °C.
    3. Retirar el reactivo de disociación e incubar las células secas durante 1 min a 37 °C.
    4. Recolectar las células usando medios de cultivo -1 ml para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos- en un tubo cónico de 15 ml y centrifugar a 120 x g durante 4 min.
    5. Resuspender células en medios de cultivo-2 mL para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 500 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos suplementada con un inhibidor ROCK de 10 μM y placarlas en placas recubiertas de matriz fresca al 40% de confluencia.

2. Diferenciación de iPSC en MSCs

  1. Preparar medios de diferenciación MSC añadiendo 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% P/S a DMEM + piruvato bajo en glucosa y almacenar a 4 °C.
  2. Al alcanzar el 80% de confluencia, use iPSC para la formación del cuerpo embrioide (EB) siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Lave las células con DPBS e incubarlas con medio de disociación/EDTA-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos, 250 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos.
    2. Incubar a 37 °C durante 1 min, aspirar el reactivo de disociación y mantener las células a 37 °C durante 1 min adicional. Para iniciar la diferenciación MSC, se requieren ~10-12 x 106 celdas.
    3. Recolectar las células en un tubo cónico de 15 ml utilizando medios de cultivo. Asegúrese de ser muy suave durante la recolección para evitar que las células se vuelvan solteras y permitir la formación de EB. Centrifugar las células a 120 x g durante 4 min.
    4. Resuspender las células en 3 ml de medios de diferenciación MSC que contengan 10 μM inhibidor de ROCK.
    5. Mezcle y distribuya 0,5 ml/pocillo en una placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
      NOTA: El uso de una placa de fijación ultra baja fomentaría la agregación celular en EB en lugar de su fijación en la superficie.
    6. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C.
  3. Después de 24 h, inducir los EB alcanzados con un tratamiento con ácido retinoico (AR) alto siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Añadir 10 μM RA a 3 ml de medios de diferenciación MSC. Recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos asentarse durante 15 minutos.
    2. Retire el sobrenadante de los EB y agregue medios de diferenciación MSC suplementados con 10 μM RA.
    3. Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
    4. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C. No molestar a los EB durante las próximas 48 h.
    5. Después de 48 h, recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos asentarse durante 15 minutos.
    6. Retire el sobrenadante de los EB y agregue medios de diferenciación MSC suplementados con 0.1 μM RA.
    7. Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en la misma placa de fijación ultra baja de 24 pocillos.
    8. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C. No molestar a los EB durante las próximas 48 h.
  4. Elimine el RA agregado a las celdas siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Después de 48 h del último tratamiento de AR, recoger los EB y dejar que se asienten durante 15 min.
    2. Retire el sobrenadante y agregue DMEM medios de glucosa baja sin citoquinas.
    3. Resuspenda suavemente y distribuya 0,5 ml/pocillo en una placa de fijación ultrabaja de 24 pocillos. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C.
  5. Coloque los EB derivados de iPSC siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Después de 48 h del paso anterior (paso 2.4), recoja los EB en un tubo de 15 ml y déjelos reposar durante 15 minutos.
    2. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender en 2 ml de medios de diferenciación MSC frescos.
    3. Transferencia a dos pocillos de una placa de 6 pocillos recubierta de matriz de membrana basal.
    4. Cambie los medios cada dos días durante 5 días adicionales.
    5. Después de 5 días, retire el medio gastado y reemplácelo con un nuevo medio de diferenciación MSC que contenga 2,5 ng/ml de factor de crecimiento de fibroblastos básico (bFGF).
  6. Pase los EB plateados cuando alcancen la confluencia del 80% -90%, siguiendo los pasos que se describen a continuación.
    1. Lavar las células con DPBS, añadir tripsina -EDTA-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos e incubar las células a 37 °C durante 3 min.
    2. Recolectar las células usando medios de diferenciación MSC en un tubo cónico de 15 ml y girar a 750 x g durante 4 min.
    3. Resuspender en medios de diferenciación MSC con 2,5 ng/ml de bFGF y placar las células en placas recubiertas con matriz de membrana basal en una proporción de 1:3.
    4. Repita el pasaje cuando las células alcancen el 70%-80% de confluencia. Se espera que gane 3-6 millones de células por 2-3 pasajes.

3. Análisis por citometría de flujo de MSCs derivadas de iPSCs

NOTA: Al someterse a 2-3 pasajes, se debe acceder a las celdas para la eficiencia de la diferenciación de MSC. La diferenciación se considerará exitosa si las células expresan marcadores de diferenciación MSC: CD44, CD73, CD90 y CD105 con una eficiencia superior al 90%, y no expresan altos niveles de marcadores hematopoyéticos: CD14, CD19, CD34 y CD45. Se puede acceder a la eficiencia de estos marcadores siguiendo los pasos a continuación.

  1. Pase las celdas siguiendo los pasos descritos anteriormente (paso 2.6) y obtenga 1 x 105 celdas en un pocillo de una placa de 96 pocillos con fondo en V.
  2. Centrifugar la placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C.
  3. Resuspender 1 x 105 células en 100 μL de DPBS frío con 1 μL de anticuerpo conjugado (Ab) (ver Tabla de materiales) e incubar a 4 °C durante 30-40 min evitando la exposición a la luz.
  4. Resuspender otras 1 x 105 células en 100 μL de DPBS frío con el respectivo control de isotipo del Ab conjugado a una concentración de 1:100 ) e incubar a 4 °C durante 30-40 min evitando la exposición a la luz.
  5. Después de la incubación, centrifugar la placa a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante agitando el plato sobre el fregadero.
  6. Resuspender las células en 100 μL de DPBS frío.
  7. Centrifugar las células a 375 x g durante 4 min a 4 °C. Deseche el sobrenadante.
  8. Resuspender las células en 200 μL de DPBS frío y recoger en tubos de microcentrífuga oscuros y fríos de 1,5 ml y mantenerlos en hielo hasta que se analicen mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS).
  9. Para el análisis de FACS, distribuya las celdas utilizando dispersión lateral (SSC-A) versus dispersión directa (FSC-A) para excluir los desechos. Además, distribuya las celdas cerradas utilizando la altura dispersa hacia adelante (FSC-H) frente al área dispersa hacia adelante (FSC-A) para distinguir los singletes de los dobletes de la población de células vivas.
    NOTA: Las células se cerraron en relación con el cambio de control de isotipo para cada marcador, y se utilizó un mínimo de 10,000 eventos cerrados de cada muestra teñida para el análisis.

4. Diferenciación de MSCs en adipocitos

  1. Preparar los medios basales de diferenciación de adipocitos añadiendo un 10% de reemplazo sérico knockout (KOSR), 1% de glutamina, 1% de P/S, 4,5 ng/μL de glucosa a un medio esencial mínimo (MEM)-alfa y almacenar a 4 °C.
  2. Permitir que las MSC alcancen una confluencia superior al 90%. Continúe cultivándolos durante otras 48 horas para permitir que se sometan a un período de detención del crecimiento.
  3. Prepare medios completos de diferenciación de adipocitos agregando 100 μg/ml de 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX), 1 μM de dexametasona, 0,2 U/ml de insulina, 100 μM de indometacina y 10 μM de rosiglitazona a los medios basales.
  4. Retire los medios de diferenciación MSC y lave las células con DPBS.
  5. Añadir medios completos de diferenciación de adipocitos -2 ml para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 1 ml para un pocillo de una placa de 12 pocillos- e incubar las células a 37 °C. Cambie los medios de diferenciación completa cada dos días durante 14 días.

5. Evaluación de la eficiencia de diferenciación de los adipocitos

  1. En el día 14 de diferenciación, verifique la eficiencia de la diferenciación teñiendo las células para marcadores de maduración de adipocitos, FABP4 y adiponectina.
  2. Retire el medio y lave las células con DPBS.
  3. Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) - 200 μL a un pocillo de una placa de 24 pocillos - e incubar a temperatura ambiente durante 15 min.
  4. Deseche el PFA y lávelo con solución salina tamponada con tris con tween al 0,5% (TBST) y colóquelo en una coctelera a temperatura ambiente durante 15 min. Repita el proceso dos veces.
  5. Permeabilice las células fijas con solución salina tamponada con fosfato con Triton X-100 (PBST) al 0,5% y colóquela en un agitador a temperatura ambiente durante 15-20 min.
  6. Desechar el PBST y añadir el tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina (BSA) al 5% -6% en PBST)-500 μL para un pocillo de una placa de 6 pocillos y 250 μL para un pocillo de una placa de 12 pocillos- e incubar a temperatura ambiente en el agitador durante 40-60 min.
  7. Diluir los anticuerpos primarios contra FABP4, adiponectina en 2% -3% BSA, a una concentración de 1:500 (ver Tabla de materiales). Añadir estos anticuerpos juntos sólo si se crían en diferentes animales y colocar la placa en el agitador a 4 °C, durante la noche.
  8. Retire los anticuerpos primarios y lave las células tres veces con TBST (15 minutos cada una) y colóquelo en un agitador a temperatura ambiente.
  9. Prepare anticuerpos secundarios de Alexa Fluor en PBST (1:500). Incubar las células en las combinaciones de anticuerpos secundarios (según la especie en la que se eleva el anticuerpo primario) durante 60 minutos a temperatura ambiente y cubrir la placa con papel de aluminio para protegerla de la luz.
  10. Deseche los anticuerpos secundarios, lávese con TBST tres veces y coloque la placa en el agitador.
  11. Para teñir los núcleos, añadir 1 μg/ml de Hoechst 33342-200 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos diluida en PBS e incubar durante 5 min a temperatura ambiente.
  12. Deseche la solución de Hoechst y agregue PBS-500 μL para un pocillo de una placa de 24 pocillos a las células. Mantenga las placas cubiertas de luz hasta que se visualicen con un microscopio de fluorescencia invertida.

6. Clasificación de adipocitos usando rojo del Nilo

  1. Preparar la solución de trabajo de rojo del Nilo añadiendo 1 mg/ml de solución madre roja del Nilo en DMSO y almacenar a -20 °C. Justo antes de su uso, descongele la cepa roja del Nilo y reconstituya en DPBS para alcanzar una concentración de solución de trabajo de 300 nM.
  2. En o después del día 14 de diferenciación de adipocitos, deseche los medios de las células y lave con DPBS.
  3. Añadir la solución de trabajo rojo del Nilo -1 ml en un pocillo de una placa de 6 pocillos- e incubar a 37 °C durante 15 min.
  4. Retirar la solución roja del Nilo y añadir tripsina-EDTA -500 μL en un pocillo de una placa de 6 pocillos- e incubar a 37 °C durante 4 min.
  5. Recoja las células usando DMEM que contiene 5% de FBS en un tubo cónico de 15 ml. Centrifugadora a 750 x g durante 4 min.
  6. Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en DPBS-1 ml para 1 x 106 células. Centrifugadora a 750 x g durante 4 min.
  7. Retire el sobrenadante y vuelva a suspenderlo en DPBS-1 ml para 1 x 106 células. Utilice un clasificador FACS para aislar los glóbulos rojos positivos del Nilo utilizando el canal FL1.
  8. Vuelva a cultivar las células clasificadas en medios de diferenciación de adipocitos o recolecte las células clasificadas para el aislamiento de ARN y proteínas.
  9. Extraiga ARN de las células clasificadas y realice un análisis cuantitativo relativo de los marcadores de diferenciación de adipocitos, incluidos FABP4, PPARG y C / EBPA. Las células rojas positivas del Nilo muestran una regulación positiva significativa en la expresión génica de al menos dos pliegues en comparación con las células no clasificadas.

Resultados

Esquema y morfología de las células durante la diferenciación mesenquimal: La diferenciación de iPSCs en MSCs implica varias etapas de desarrollo que abarcan la formación de EB, la diferenciación de MSC y la expansión de MSC (Figura 1). Durante estas etapas de desarrollo, las células adquieren una morfología diversa debido a los diferentes productos químicos estimulantes a los que están sometidas. Al iniciar la diferenciación, las células están en suspensión y se espera que se...

Discusión

Este protocolo tiene una importancia primordial debido a su capacidad para proporcionar MSC en alto rendimiento y eficiencia. Esta producción a gran escala de MSC fue posible gracias a la incubación transitoria de EB derivadas de iPSCs con 10 μM de RA14,15. El tratamiento transitorio con 10 μM de AR mejoró el rendimiento de MSC de 11,2 a 1542 veces14,15, siendo este protocolo aplicable tanto en iPSCs...

Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue financiado por una subvención del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF) (Subvención No. NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi fue apoyada por la beca GSRA del Fondo Nacional de Investigación de Qatar (QNRF).

Materiales

NameCompanyCatalog NumberComments
AdiponectinAbcamab22554Adipocyte maturation marker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC differentiation marker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC differentiation marker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC differentiation marker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC differentiation marker
anti-CD44abcamab93758MSC differentiation marker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC differentiation marker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC differentiation marker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC differentiation marker
bFGFR&D233-FPMSC culture media supplement
C/EBPAAbcamab40761Adipocyte maturation marker
DexamethasoneTorics1126Adipocyte differentiation media supplement
FABP4Abcamab93945Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serumThermoFisher10082147MSC culture media supplement
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC culture media supplement
IBMXSigma AldrichI5879Adipocyte differentiation media supplement
IndomethacinSigma AldrichI7378Adipocyte differentiation media supplement
InsulinSigma Aldrich91077CAdipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEMThermoFisher11885084MSC culturing media
MatrigelCorning354230Coating matrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipocyte differentiation media
NileredSigma Aldrich19123Sorting marker for adipocyte
PenicillinThermoFisher15140122MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered salineThermoFisher14190144wash buffer
Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358wash buffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipocyte maturation marker
ReLeSRStem Cell Technologies5872Dissociation reagent
Retinoic acidSigma AldrichR2625MSC differentiation media supplement
Rock inhibitorTocris1254/10hPSC culture media supplement
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Adipocyte differentiation media supplement
StemFlexThermoFisherA334901hPSC culture media
TritonThermo Fisher28314Permebealization reagent
TrypsinThermoFisher25200072Dissociation reagent
Tween 20Sigma AldrichP7942Wash buffer

Referencias

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