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  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
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  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Le protocole permet la génération d’une population adipocytaire pure à partir de cellules souches pluripotentes induites (CSPi). L’acide rétinoïque est utilisé pour différencier les CSPi en cellules souches mésenchymateuses (CSM) qui sont utilisées pour produire des adipocytes. Ensuite, une approche de tri basée sur la coloration rouge du Nil est utilisée pour obtenir des adipocytes purs.

Résumé

Les progrès récents de la technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) ont permis la génération de différents types de cellules, y compris les adipocytes. Cependant, les méthodes de différenciation actuelles ont une faible efficacité et ne produisent pas une population homogène d’adipocytes. Ici, nous contournons ce problème en utilisant une méthode entièrement trans basée sur les rétinoïques pour produire des cellules souches mésenchymateuses (CSM) à haut rendement. En régulant les voies régissant la prolifération, la survie et l’adhésion cellulaires, notre stratégie de différenciation permet la génération efficace de corps embryonnaires (EB) qui se différencient en une population pure de CSM multipotentes. Le nombre élevé de CSM générées par cette méthode constitue une source idéale pour la génération d’adipocytes. Cependant, l’hétérogénéité des échantillons résultant de la différenciation des adipocytes reste un défi. Par conséquent, nous avons utilisé une méthode à base de rouge du Nil pour purifier les adipocytes matures lipidiques à l’aide de FACS. Cette stratégie de tri nous a permis d’établir un moyen fiable de modéliser les troubles métaboliques associés aux adipocytes à l’aide d’un pool d’adipocytes avec une hétérogénéité d’échantillon réduite et une fonctionnalité cellulaire améliorée.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM) agissent comme une ressource transitoire efficace pour produire des cellules d’origine mésodermique comme les adipocytes, les ostéocytes et les chondrocytes, qui pourraient être utilisées pour modéliser leurs troubles génétiques respectifs. Cependant, les approches précédentes reposaient sur l’obtention de ces CSM à partir de tissus adultes 1, ce qui imposait le défi de les obtenir en grand nombre auprès des donneurs et la limitation de leur viabilité fonctionnelle dans des conditions de culture in vitro sous-optimales 1,2. Ces obstacles ont produit une grande demande d’avoir un protocole pour générer des CSM in vitro. Les cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPi) peuvent être utilisées comme source précieuse de CSM, présentant les caractéristiquesdes CSM 3,4,5. Les CSM dérivées des CSPi peuvent être utilisées comme option thérapeutique dans plusieurs maladies. En outre, la capacité des CSM dérivées des CSPi à générer des adipocytes en fait un modèle humain in vitro précieux pour étudier l’adipogenèse humaine, l’obésité et les troubles associés aux adipocytes.

Les protocoles actuels de différenciation des adipocytes peuvent être classés en deux groupes, l’un impliquant la différenciation des adipocytes à l’aide de cocktails chimiques ou à base de protéines donnant un rendement résultant de 30%-60%6,7,8,9, tandis que l’autre impliquant une manipulation génétique pour une induction robuste de facteurs de transcription clés régissant le développement des adipocytes pour donner un rendement de 80%-90%10, 11. Cependant, la manipulation génétique ne récapitule pas le processus naturel de différenciation des adipocytes et masque souvent les paradigmes subtils arrivant au cours de l’adipogenèse, ce qui la rend inefficace à des fins de modélisation de la maladie12,13. Par conséquent, nous présentons un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement des adipocytes immatures en marquant par fluorescence les adipocytes lipidiques à l’aide de rouge du Nil.

Nous présentons ici un protocole impliquant l’incubation transitoire de corps embryoïdes (EB) dérivés de CSPi avec de l’acide rétinoïque tout-trans pour produire un grand nombre de CSM à prolifération rapide, qui pourraient être utilisés pour générer des adipocytes14. Nous présentons également un moyen de trier les adipocytes matures dérivés chimiquement du pool de différenciation hétérogène en marquant par fluorescence leurs gouttelettes lipidiques à l’aide d’un colorant lipophile; Nil rouge. Cela permettrait la génération d’une population pure d’adipocytes matures avec une fonctionnalité améliorée pour modéliser avec précision les troubles métaboliques associés aux adipocytes.

Protocole

L’étude a été approuvée par le comité d’éthique de la recherche de l’établissement approprié et réalisée conformément aux normes éthiques énoncées dans la Déclaration d’Helsinki de 1964 et ses amendements ultérieurs ou à des normes éthiques comparables. Le protocole a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du HMC (n° 16260/16) et de l’ICRQ (n° 2016-003). Ce travail est également optimisé pour les CSEh tels que H1 et H9. Des échantillons de sang ont été prélevés sur des personnes en bonne santé avec leur plein consentement éclairé. Les CSPi sont générées à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) d’individus en bonne santé.

1. Culture et maintien des CSPi

  1. Préparer les plaques revêtues de matrice de membrane basale en reconstituant la matrice de revêtement dans du DMEM knockout dans un rapport de 1:80 et stocker à 4 °C.
  2. Préparer les milieux de culture des CSPi en ajoutant 50 mL de milieux de supplément de cellules souches 10x à 500 mL de milieux basaux de cellules souches, ainsi que 5 mL de 100x pénicilline-streptomycine (P/S) et conserver à 4 °C pour une utilisation à court terme ou à -20 °C pour une utilisation à long terme.
  3. Tapisser les plaques d’une matrice de revêtement de 1 mL pour une plaque à 6 puits, de 500 μL pour une plaque de 12 puits, de 250 μL pour une plaque de 24 puits et d’incuber la plaque à 37 °C pendant 1-2 h.
  4. Retirer une partie aliquote du milieu de culture des CSPi et préchauffer à température ambiante avant utilisation.
  5. Décongeler un flacon de CSPi (CSE ou CSPi) dans un bain-marie à 37 °C et transférer dans un tube conique de 15 mL contenant 2 à 3 mL de milieu de culture.
  6. Centrifuger le tube à 120 x g pendant 4 min à température ambiante (RT-23 °C).
  7. Retirer le surnageant et ajouter 2 mL de milieu de culture frais additionné d’inhibiteur de ROCK de 10 μM (Y-27632). Plaquer les cellules dans un puits d’une plaque à 6 puits revêtue de matrice et placer la plaque à 37 °C.
  8. Après 24 h, retirez le support et remplacez-le par un milieu de culture frais.
  9. Changez le média tous les jours jusqu’à ce que les cellules atteignent 80% à 90% de confluence.
  10. Lorsque vous atteignez la confluence, passez les cellules en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Retirez le média et lavez les cellules avec la solution saline tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco.
    2. Ajouter le réactif de dissociation des CSPi (voir le tableau des matériaux) - 500 μL pour un puits d’une plaque de 6 puits, 250 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits - et incuber pendant 1 min à 37 °C.
    3. Retirer le réactif de dissociation et incuber les cellules à sec pendant 1 min à 37 °C.
    4. Recueillir les cellules à l’aide d’un milieu de culture - 1 mL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 250 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits - dans un tube conique de 15 ml et centrifuger à 120 x g pendant 4 min.
    5. Resuspendre les cellules dans un milieu de culture - 2 mL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 500 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits - complété par un inhibiteur de ROCK de 10 μM et les plaquer sur des plaques fraîches revêtues de matrice à 40% de confluence.

2. Différenciation des CSPi en CSM

  1. Préparer le milieu de différenciation MSC en ajoutant 15% de sérum bovin fœtal (FBS) et 1% P/S à faible taux de glucose DMEM + pyruvate et conserver à 4 °C.
  2. Lorsque vous atteignez 80% de confluence, utilisez des CSPi pour la formation de corps embryoïdes (EB) en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Lavez les cellules avec DPBS et incuber avec un milieu de dissociation/EDTA-500 μL pour un puits d’une plaque à 6 puits, 250 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits.
    2. Incuber à 37 °C pendant 1 min, aspirer le réactif de dissociation et maintenir les cellules à 37 °C pendant 1 min supplémentaire. Pour commencer la différenciation MSC, ~10-12 x 106 cellules sont nécessaires.
    3. Recueillir les cellules dans un tube conique de 15 ml à l’aide de milieux de culture. Assurez-vous d’être très doux lors de la collecte pour éviter que les cellules ne deviennent uniques et permettre la formation d’EB. Centrifuger les cellules à 120 x g pendant 4 min.
    4. Resuspendre les cellules dans 3 mL de milieu de différenciation MSC contenant 10 μM d’inhibiteur de ROCK.
    5. Mélanger et répartir 0,5 mL/puits dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits.
      REMARQUE: L’utilisation d’une plaque de fixation ultra-basse encouragerait l’agrégation des cellules en EB plutôt que leur fixation à la surface.
    6. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C.
  3. Après 24 h, induire les EB atteints avec un traitement à haute teneur en acide rétinoïque (PR) en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Ajouter 10 μM RA à 3 mL de milieu de différenciation MSC. Recueillir les EB dans un tube de 15 ml et les laisser se déposer pendant 15 min.
    2. Retirer le surnageant des EB et ajouter un milieu de différenciation MSC complété par 10 μM RA.
    3. Remettre en suspension délicatement et répartir 0,5 mL/puits dans la même plaque de fixation ultra-basse de 24 puits.
    4. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C. Ne pas déranger les EB pendant les 48 heures suivantes.
    5. Après 48 h, recueillir les EB dans un tube de 15 ml et les laisser reposer pendant 15 min.
    6. Retirer le surnageant des EB et ajouter un milieu de différenciation MSC complété par 0,1 μM RA.
    7. Remettre en suspension délicatement et répartir 0,5 mL/puits dans la même plaque de fixation ultra-basse de 24 puits.
    8. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C. Ne pas déranger les EB pendant les 48 heures suivantes.
  4. Supprimez l’AR ajouté aux cellules en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Après 48 h du dernier traitement contre la PR, recueillir les EB et les laisser s’installer pendant 15 min.
    2. Retirez le surnageant et ajoutez un milieu DMEM à faible teneur en glucose sans cytokines.
    3. Remettez doucement en suspension et répartissez 0,5 mL/puits dans une plaque de fixation ultra-basse de 24 puits. Placer la plaque dans l’incubateur à 37 °C.
  5. Plaquez les EB dérivés des CSPi en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Après 48 h de l’étape précédente (étape 2.4), recueillir les EB dans un tube de 15 mL et les laisser reposer pendant 15 min.
    2. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans 2 mL de milieu de différenciation MSC frais.
    3. Transfert dans deux puits d’une plaque à 6 puits revêtue d’une membrane basale à matrice.
    4. Changez le support tous les deux jours pendant 5 jours supplémentaires.
    5. Après 5 jours, retirez le milieu usé et remplacez-le par un nouveau milieu de différenciation MSC contenant 2,5 ng/mL de facteur de croissance des fibroblastes basiques (FGFb).
  6. Passez les EB plaqués lorsqu’ils atteignent 80% - 90% de confluence, en suivant les étapes décrites ci-dessous.
    1. Laver les cellules avec du DPBS, ajouter de la trypsine-EDTA-500 μL pour un puits d’une plaque à 6 puits et incuber les cellules à 37 °C pendant 3 min.
    2. Recueillir les cellules à l’aide d’un milieu de différenciation MSC dans un tube conique de 15 ml et faire tourner à 750 x g pendant 4 min.
    3. Resuspendre dans un milieu de différenciation MSC avec 2,5 ng/mL de FGFb et plaquer les cellules sur des plaques revêtues de matrice membranaire basale dans un rapport de 1:3.
    4. Répétez le passage lorsque les cellules atteignent 70%-80% de confluence. On s’attend à ce qu’il gagne 3 à 6 millions de cellules par 2 à 3 passages.

3. Analyse par cytométrie en flux des CSM dérivées des CSPi

REMARQUE: Lors de 2-3 passages, les cellules doivent être accessibles pour l’efficacité de la différenciation MSC. La différenciation sera considérée comme réussie si les cellules expriment les marqueurs de différenciation MSC - CD44, CD73, CD90 et CD105 avec une efficacité supérieure à 90% et n’expriment pas des niveaux élevés de marqueurs hématopoïétiques - CD14, CD19, CD34 et CD45. L’efficacité de ces marqueurs est accessible en suivant les étapes ci-dessous.

  1. Passez les cellules en suivant les étapes décrites ci-dessus (étape 2.6) et atteignez 1 x 105 cellules dans un puits d’une plaque de 96 puits à fond en V.
  2. Centrifuger la plaque à 375 x g pendant 4 min à 4 °C.
  3. Resuspendre 1 x 105 cellules dans 100 μL de DPBS froid avec 1 μL d’anticorps conjugué (Ab) (voir le tableau des matériaux) et incuber à 4 °C pendant 30-40 min en évitant l’exposition à la lumière.
  4. Resuspendre 1 x 105 autres cellules dans 100 μL de DPBS froid avec le contrôle isotype respectif de l’Ab conjugué à une concentration de 1:100 ) et incuber à 4 °C pendant 30-40 min en évitant l’exposition à la lumière.
  5. Après incubation, centrifuger la plaque à 375 x g pendant 4 min à 4 °C. Jetez le surnageant en secouant la plaque au-dessus de l’évier.
  6. Remettez les cellules en suspension dans 100 μL de DPBS froid.
  7. Centrifuger les cellules à 375 x g pendant 4 min à 4 °C. Jetez le surnageant.
  8. Remettez les cellules en suspension dans 200 μL de DPBS froid et recueillez-les dans des tubes microcentrifugeuses froids et sombres de 1,5 mL et maintenez-les sur la glace jusqu’à ce qu’elles soient analysées par tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
  9. Pour l’analyse FACS, répartir les cellules en utilisant la dispersion latérale (SSC-A) plutôt que la dispersion vers l’avant (FSC-A) pour exclure les débris. De plus, répartir les cellules fermées en utilisant la hauteur diffusée vers l’avant (FSC-H) par rapport à la zone dispersée vers l’avant (FSC-A) pour distinguer les singulets des doublets de la population de cellules vivantes.
    REMARQUE : Les cellules ont été fermées par rapport au décalage du contrôle de l’isotype pour chaque marqueur, et un minimum de 10 000 événements contrôlés de chaque échantillon coloré a été utilisé pour l’analyse.

4. Différenciation des CSM en adipocytes

  1. Préparer le milieu de base de différenciation des adipocytes en ajoutant 10 % de sérum knockout de remplacement (KOSR), 1 % de glutamine, 1 % P/S, 4,5 ng/μL de glucose au milieu essentiel (MEM)-alpha minimal et conserver à 4 °C.
  2. Permettre aux CSM d’atteindre une confluence supérieure à 90 %. Continuez à les cultiver pendant encore 48 heures pour leur permettre de subir une période d’arrêt de croissance.
  3. Préparer des milieux de différenciation adipocytaire complets en ajoutant 100 μg/mL de 3-isobutyl-1-méthylxanthine (IBMX), 1 μM de dexaméthasone, 0,2 U/mL d’insuline, 100 μM d’indométacine et 10 μM de rosiglitazone au milieu basal.
  4. Retirez le milieu de différenciation MSC et lavez les cellules à l’aide de DPBS.
  5. Ajouter un milieu de différenciation adipocytaire complet - 2 mL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 1 mL pour un puits d’une plaque de 12 puits - et incuber les cellules à 37 °C. Changez de support de différenciation complet tous les deux jours pendant 14 jours.

5. Évaluation de l’efficacité de différenciation des adipocytes

  1. Au jour 14 de la différenciation, vérifier l’efficacité de la différenciation en colorant les cellules pour les marqueurs de maturation adipocytes, FABP4 et adiponectine.
  2. Retirez le support et lavez les cellules avec DPBS.
  3. Fixez les cellules à l’aide de 4% de paraformaldéhyde (PFA) - 200 μL dans un puits d’une plaque de 24 puits - et incuber à température ambiante pendant 15 min.
  4. Jeter le PFA et laver avec une solution saline tamponnée au tris avec 0,5% de tween (TBST) et le placer sur un agitateur à température ambiante pendant 15 min. Répétez le processus deux fois.
  5. Perméabiliser les cellules fixes avec une solution saline tamponnée au phosphate avec 0,5% de Triton X-100 (PBST) et la placer sur un agitateur à température ambiante pendant 15-20 min.
  6. Jeter le PBST et ajouter le tampon de blocage (5%-6% d’albumine sérique bovine (BSA) dans PBST)-500 μL pour un puits d’une plaque de 6 puits et 250 μL pour un puits d’une plaque de 12 puits - et incuber à température ambiante sur le shaker pendant 40-60 min.
  7. Diluer les anticorps primaires contre FABP4, l’adiponectine, dans 2 % à 3 % de BSA, à une concentration de 1:500 (voir le tableau des matériaux). Ajoutez ces anticorps ensemble uniquement s’ils sont élevés chez différents animaux et placez la plaque sur l’agitateur à 4 °C, pendant une nuit.
  8. Retirer les anticorps primaires et laver les cellules trois fois avec du TBST (15 min chacune) et les placer sur un agitateur à température ambiante.
  9. Préparer les anticorps secondaires Alexa Fluor dans PBST (1:500). Incuber les cellules dans les combinaisons d’anticorps secondaires (selon l’espèce dans laquelle l’anticorps primaire est élevé) pendant 60 minutes à température ambiante et couvrir la plaque avec du papier d’aluminium pour la protéger de la lumière.
  10. Jetez les anticorps secondaires, lavez avec TBST trois fois et placez la plaque sur le shaker.
  11. Pour colorer les noyaux, ajouter 1 μg/mL de Hoechst 33342-200 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits dilué dans du PBS et incuber pendant 5 min à température ambiante.
  12. Jeter la solution de Hoechst et ajouter du PBS-500 μL pour un puits d’une plaque de 24 puits aux cellules. Gardez les plaques couvertes de lumière jusqu’à ce qu’elles soient visualisées à l’aide d’un microscope à fluorescence inversée.

6. Tri des adipocytes à l’aide du rouge du Nil

  1. Préparer la solution de travail rouge du Nil en ajoutant 1 mg/mL de solution mère rouge du Nil dans du DMSO et conserver à -20 °C. Juste avant utilisation, décongeler le stock de rouge du Nil et reconstituer dans le DPBS pour atteindre une concentration de solution de travail de 300 nM.
  2. À partir du jour 14 de la différenciation des adipocytes, jeter le média des cellules et laver à l’aide de DPBS.
  3. Ajouter la solution de travail rouge du Nil -1 mL dans un puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 15 min.
  4. Retirer la solution de rouge du Nil et ajouter la trypsine-EDTA -500 μL dans un puits d’une plaque de 6 puits et incuber à 37 °C pendant 4 min.
  5. Recueillir les cellules à l’aide de DMEM contenant 5% de FBS dans un tube conique de 15 mL. Centrifuger à 750 x g pendant 4 min.
  6. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans DPBS-1 mL pendant 1 x 106 cellules. Centrifuger à 750 x g pendant 4 min.
  7. Retirer le surnageant et remettre en suspension dans DPBS-1 mL pendant 1 x 106 cellules. Utilisez un trieur FACS pour isoler les cellules rouges positives du Nil à l’aide du canal FL1.
  8. Re-culture des cellules triées dans des milieux de différenciation adipocytaire ou collecte des cellules triées pour l’isolement de l’ARN et des protéines.
  9. Extraire l’ARN des cellules triées et effectuer une analyse quantitative relative des marqueurs de différenciation des adipocytes, y compris FABP4, PPARG et C / EBPA. Les cellules rouges positives du Nil montrent une régulation positive significative dans l’expression génique d’au moins deux fois par rapport aux cellules non triées.

Résultats

Schéma et morphologie des cellules au cours de la différenciation mésenchymateuse : La différenciation des CSPi en CSM implique différents stades de développement allant de la formation de l’EB, de la différenciation des CSM et de l’expansion des CSM (Figure 1). Au cours de ces stades de développement, les cellules acquièrent une morphologie variée en raison des différents produits chimiques stimulants auxquels elles sont soumises. Lors du début de la différenciation, les ce...

Discussion

Ce protocole revêt une importance primordiale en raison de sa capacité à fournir des CSM à haut rendement et efficacité. Cette production à grande échelle de CSM a été rendue possible par l’incubation transitoire de SE dérivés de CSPi avec 10 μM de RA14,15. Le traitement transitoire avec 10 μM de PR a augmenté le rendement des CSM de 11,2 à 1542 fois14,15, ce protocole étant applicable ?...

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

Ce travail a été financé par une subvention du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF) (subvention n° NPRP10-1221-160041). Maryam Aghadi a bénéficié d’une bourse GSRA du Fonds national de recherche du Qatar (QNRF).

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
AdiponectinAbcamab22554Adipocyte maturation marker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC differentiation marker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC differentiation marker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC differentiation marker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC differentiation marker
anti-CD44abcamab93758MSC differentiation marker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC differentiation marker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC differentiation marker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC differentiation marker
bFGFR&D233-FPMSC culture media supplement
C/EBPAAbcamab40761Adipocyte maturation marker
DexamethasoneTorics1126Adipocyte differentiation media supplement
FABP4Abcamab93945Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serumThermoFisher10082147MSC culture media supplement
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC culture media supplement
IBMXSigma AldrichI5879Adipocyte differentiation media supplement
IndomethacinSigma AldrichI7378Adipocyte differentiation media supplement
InsulinSigma Aldrich91077CAdipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEMThermoFisher11885084MSC culturing media
MatrigelCorning354230Coating matrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipocyte differentiation media
NileredSigma Aldrich19123Sorting marker for adipocyte
PenicillinThermoFisher15140122MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered salineThermoFisher14190144wash buffer
Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358wash buffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipocyte maturation marker
ReLeSRStem Cell Technologies5872Dissociation reagent
Retinoic acidSigma AldrichR2625MSC differentiation media supplement
Rock inhibitorTocris1254/10hPSC culture media supplement
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Adipocyte differentiation media supplement
StemFlexThermoFisherA334901hPSC culture media
TritonThermo Fisher28314Permebealization reagent
TrypsinThermoFisher25200072Dissociation reagent
Tween 20Sigma AldrichP7942Wash buffer

Références

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