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요약

이 프로토콜은 유도 만능 줄기 세포(iPSC)로부터 순수한 지방세포 집단의 생성을 허용합니다. 레티노산은 iPSC를 지방세포 생성에 사용되는 중간엽 줄기세포(MSC)로 분화시키는 데 사용됩니다. 그런 다음 나일 레드 염색을 기반으로 한 분류 접근법을 사용하여 순수한 지방 세포를 얻습니다.

초록

유도만능줄기세포(iPSC) 기술의 최근 발전으로 지방세포를 비롯한 다양한 세포 유형의 생성이 가능해졌습니다. 그러나, 현재의 분화 방법은 효율이 낮고, 지방세포의 균질한 집단을 생성하지 않는다. 여기에서 우리는 높은 수율로 중간엽 줄기 세포(MSC)를 생산하기 위해 all-trans retinoic 기반 방법을 사용하여 이 문제를 우회합니다. 세포 증식, 생존 및 부착을 제어하는 경로를 조절함으로써 당사의 분화 전략은 다능성 중간엽의 순수한 집단으로 분화하는 배아체(EB)의 효율적인 생성을 가능하게 합니다. 이 방법에 의해 생성된 많은 수의 중간엽 줄기세포는 지방세포를 생성하기 위한 이상적인 공급원을 제공합니다. 그러나 지방 세포 분화로 인한 샘플 이질성은 여전히 과제로 남아 있습니다. 따라서 우리는 FACS를 사용하여 지질 함유 성숙 지방 세포를 정제하기 위해 Nile red 기반 방법을 사용했습니다. 이 분류 전략을 통해 샘플 이질성이 감소하고 세포 기능이 향상된 지방 세포 풀을 사용하여 지방 세포 관련 대사 장애를 모델링하는 신뢰할 수 있는 방법을 확립할 수 있었습니다.

서문

중간엽 줄기 세포(MSC)는 지방 세포, 골 세포 및 연골 세포와 같은 중배엽 기원 세포를 생산하기 위한 효과적인 일시적 자원 역할을 하며, 이는 각각의 유전 질환을 모델링하는 데 추가로 사용될 수 있습니다. 그러나, 이전의 접근법은 성인 조직으로부터 이러한 중간엽 줄기세포를 얻는 것에 의존했다1, 이는 기증자로부터 많은 수의 중간엽 줄기세포를 얻는 데 어려움을 겪었고, 차선의 체외 배양 조건1,2에서 기능적으로 생존할 수 있도록 유지하는 데 한계가 있었다. 이러한 장애물은 시험관 내에서 MSC를 생성하기 위한 프로토콜을 갖는 것에 대한 큰 수요를 낳았습니다. 인간 유도 만능 줄기 세포(iPSC)는 MSC 특성 3,4,5를 나타내는 MSC의 귀중한 공급원으로 사용될 수 있습니다. iPSC 유래 중간엽 줄기세포는 여러 질병에서 치료 옵션으로 사용할 수 있습니다. 또한 iPSC 유래 중간엽 줄기세포가 지방세포를 생성하는 능력은 인간 지방생성, 비만 및 지방세포 관련 장애를 연구하는 데 유용한 시험관 내 인간 모델이 됩니다.

지방세포의 현재 분화 프로토콜은 두 그룹으로 분류할 수 있는데, 하나는 화학적 또는 단백질 기반 칵테일을 사용하여 지방세포를 분화하여 30%-60%6,7,8,9의 결과 수율을 제공하는 반면, 다른 하나는 80%-90%10의 수율을 제공하기 위해 지방세포 발달을 지배하는 주요 전사 인자의 강력한 유도를 위한 유전자 조작을 포함합니다. 11. 그러나 유전자 조작은 지방세포 분화의 자연적 과정을 요약하지 않으며, 종종 지방 생성 중에 도달하는 미묘한 패러다임을 가려서 질병 모델링 목적에는 효과적이지 않습니다12,13. 따라서 우리는 나일 레드를 사용하여 지질 함유 지방 세포를 형광으로 태그하여 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 미성숙 지방세포에서 분류하는 방법을 제시합니다.

여기에서 우리는 지방 세포 생성에 추가로 사용될 수 있는 많은 수의 빠르게 증식하는 중간엽을 생성하기 위해 iPSC 유래 배아체(EB)를 all-trans retinoic acid와 함께 일시적으로 배양하는 프로토콜을 제시합니다14. 우리는 또한 친유성 염료를 사용하여 지질 방울에 형광 태그를 지정하여 이질적인 분화 풀에서 화학적으로 파생된 성숙한 지방 세포를 분류하는 방법을 제시합니다. 나일 레드. 이를 통해 지방 세포 관련 대사 장애를 정확하게 모델링할 수 있는 향상된 기능을 가진 성숙한 지방 세포의 순수한 집단을 생성할 수 있습니다.

프로토콜

이 연구는 적절한 기관 연구 윤리위원회의 승인을 받았으며 1964 년 헬싱키 선언 및 이후 개정 또는 유사한 윤리 기준에 명시된 윤리 기준에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜은 HMC(No. 16260/16) 및 QBRI(No. 2016-003)의 IRB(Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다. 이 작업은 H1 및 H9와 같은 hESC에도 최적화되어 있습니다. 충분한 정보에 입각한 동의를 받은 건강한 개인으로부터 혈액 샘플을 채취했습니다. iPSC는 건강한 개인의 말초 혈액 단핵 세포(PBMC)에서 생성됩니다.

1. iPSC 배양 및 유지

  1. 코팅 매트릭스를 knockout-DMEM에서 1:80의 비율로 재구성하여 기저막 매트릭스 코팅 플레이트를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
  2. 500mL의 줄기세포 기저 배지에 50mL의 10배 줄기세포 보충 배지와 5mL의 100x 페니실린-스트렙토마이신(P/S)을 추가하여 iPSC 배양액을 준비하고 단기간의 경우 4°C에서, 장기간 사용의 경우 -20°C에서 보관합니다.
  3. 플레이트를 코팅 매트릭스-1 mL 6-웰 플레이트에 대해, 500 μL에 12-웰 플레이트에, 250 μL에 24-웰 플레이트-플레이트를 37°C에서 1-2시간 동안 인큐베이션한다.
  4. iPSC 배양 배지의 분취량을 제거하고 사용하기 전에 실온에서 예열합니다.
  5. iPSC(ESC 또는 iPSC) 바이알을 37°C 수조에서 해동하고 2-3mL의 배양 배지가 들어 있는 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다.
  6. 튜브를 실온(RT-23°C)에서 4분 동안 120 x g 로 원심분리합니다.
  7. 상층액을 제거하고 10μM ROCK 억제제(Y-27632)가 보충된 2mL의 신선한 배양 배지를 추가합니다. 매트릭스가 코팅된 6-웰 플레이트의 하나의 웰에 세포를 플레이트하고, 플레이트를 37°C에서 위치시킨다.
  8. 24시간 후 배지를 제거하고 신선한 배양 배지로 교체합니다.
  9. 세포가 80%-90% 밀도에 도달할 때까지 매일 배지를 교체하십시오.
  10. 합류도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 세포를 계대합니다.
    1. 배지를 제거하고 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 세포를 세척합니다.
    2. 6-웰 플레이트의 웰에 대해 500 μL, 24-웰 플레이트의 웰에 대해 250 μL--37°C에서 1분 동안 인큐베이션하는 iPSCs 해리 시약 ( 재료 표 참조)을 첨가한다.
    3. 해리 시약을 제거하고 37°C에서 1분 동안 건조된 세포를 배양한다.
    4. 15 mL 원뿔형 튜브에 6-웰 플레이트의 웰에 대해 1 mL 및 24-웰 플레이트의 웰에 대해 250 μL-배양 배지를 사용하여 세포를 수집하고, 120 x g 에서 4분 동안 원심분리한다.
    5. 10μM ROCK 억제제가 보충된 24웰 플레이트의 웰에 대해 6웰 플레이트의 웰에 대해 2mL의 배양 배지에 세포를 재현탁하고 40% 밀도로 새로운 매트릭스 코팅 플레이트에 플레이트합니다.

2. iPSC를 MSC로 차별화

  1. 저포도당 DMEM + 피루브산에 15% 소 태아 혈청(FBS)과 1% P/S를 첨가하여 MSC 분화 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
  2. 80% 밀도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 배아체(EB) 형성에 iPSC를 사용합니다.
    1. 세포를 DPBS로 세척하고 6웰 플레이트의 웰에 대해 해리 배지/EDTA-500μL, 24웰 플레이트의 웰에 대해 250μL로 배양합니다.
    2. 37°C에서 1분 동안 인큐베이션하고, 해리 시약을 흡인하고, 세포를 37°C에서 추가로 1분 동안 유지합니다. MSC 분화를 시작하려면 ~10-12 x 106 개의 세포가 필요합니다.
    3. 배양 배지를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에 세포를 수집합니다. 세포가 단일화되는 것을 방지하고 EB 형성을 허용하기 위해 수집하는 동안 매우 부드럽게하십시오. 세포를 120 x g 에서 4분 동안 원심분리합니다.
    4. 세포를 10 μM ROCK 억제제를 함유하는 3 mL의 MSC 분화 배지에 재현탁시킨다.
    5. 0.5 mL/well을 24웰 초저 부착 플레이트에 혼합하여 분배합니다.
      참고: 초저 부착 플레이트를 사용하면 표면에 부착되는 것보다 EB로 세포 응집이 촉진됩니다.
    6. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
  3. 24시간 후, 아래에 설명된 단계에 따라 높은 레티노산(RA) 처리로 달성된 EB를 유도합니다.
    1. 10μM RA를 MSC 분화 배지 3mL에 추가합니다. 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화시킵니다.
    2. EBs로부터 상청액을 제거하고, 10 μM RA로 보충된 MSC 분화 배지를 첨가한다.
    3. 부드럽게 재현탁하고 동일한 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다.
    4. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다. 다음 48시간 동안 EB를 방해하지 마십시오.
    5. 48시간 후 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화시킵니다.
    6. EB에서 상청액을 제거하고 0.1μM RA가 보충된 MSC 분화 배지를 추가합니다.
    7. 부드럽게 재현탁하고 동일한 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다.
    8. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다. 다음 48시간 동안 EB를 방해하지 마십시오.
  4. 아래에 설명된 단계에 따라 셀에 추가된 RA를 제거합니다.
    1. 마지막 RA 치료 48시간 후, EB를 수집하고 15분 동안 안정되도록 합니다.
    2. 상청액을 제거하고 사이토카인이 없는 DMEM 저혈당 배지를 추가합니다.
    3. 부드럽게 재현탁하고 0.5웰 초저 부착 플레이트에 24mL/웰을 분배합니다. 플레이트를 37°C의 인큐베이터에 넣습니다.
  5. 아래에 설명된 단계에 따라 iPSC 파생 EB를 플레이트링합니다.
    1. 이전 단계(2.4단계)에서 48시간 후 15mL 튜브에 EB를 수집하고 15분 동안 안정화합니다.
    2. 상층액을 제거하고 2mL의 신선한 MSC 분화 배지에 재현탁합니다.
    3. 기저막 매트릭스 코팅된 6-웰 플레이트의 2개의 웰로 옮깁니다.
    4. 추가 5일 동안 격일로 미디어를 변경합니다.
    5. 5일 후, 사용한 배지를 제거하고 2.5ng/mL의 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 함유한 새로운 MSC 분화 배지로 교체합니다.
  6. 도금된 EB가 80%-90% 밀도에 도달하면 아래에 설명된 단계에 따라 통과시킵니다.
    1. 세포를 DPBS로 세척하고, 6-웰 플레이트의 웰에 트립신-EDTA-500 μL를 첨가하고, 세포를 37°C에서 3분 동안 인큐베이션한다.
    2. MSC 분화 배지를 사용하여 15mL 원뿔형 튜브에서 세포를 수집하고 750 x g 에서 4분 동안 회전합니다.
    3. 2.5ng/mL의 bFGF와 함께 MSC 분화 배지에 재현탁하고 세포를 기저막 매트릭스 코팅 플레이트에 1:3의 비율로 플레이트합니다.
    4. 세포가 70%-80% 밀도에 도달하면 통과를 반복합니다. 2-3 계대까지 3-600만 개의 세포를 얻을 것으로 예상됩니다.

3. iPSC 유래 중간엽 줄기세포의 유세포 분석

참고: 2-3 계대 과정을 거치면 MSC 분화의 효율성을 위해 세포에 접근해야 합니다. 세포가 MSC 분화 마커-CD44, CD73, CD90 및 CD105를 90% 이상의 효율로 발현하고 높은 수준의 조혈 마커-CD14, CD19, CD34 및 CD45를 발현하지 않는 경우 분화가 성공적인 것으로 간주됩니다. 이러한 마커의 효율성은 아래 단계에 따라 액세스할 수 있습니다.

  1. 상기 약술된 단계(단계 2.6)를 사용하여 세포를 계대배양하고, v자형 바닥 96-웰 플레이트의 하나의 웰에서 1 x 105 세포를 얻는다.
  2. 플레이트를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리합니다.
  3. 1 μL의 접합 항체(Ab)와 함께 100 μL의 차가운 DPBS에 1 x 105 세포를 재현탁하고( 재료 표 참조) 4°C에서 30-40분 동안 배양하여 빛에 노출되지 않도록 합니다.
  4. 1:100 농도에서 접합된 Ab의 각각의 이소타입 대조군과 함께 100μL의 차가운 DPBS에 또 다른 1 x 105 세포를 재현탁하고 빛에 노출되지 않도록 4°C에서 30-40분 동안 배양합니다.
  5. 인큐베이션에 이어서, 플레이트를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리한다. 싱크대 위로 접시를 흔들어 상등액을 버립니다.
  6. 차가운 DPBS 100μL에 세포를 재현탁합니다.
  7. 세포를 4°C에서 4분 동안 375 x g 로 원심분리합니다. 상청액을 버리십시오.
  8. 200μL의 차가운 DPBS에 세포를 재현탁하고 어둡고 차가운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에 수집하고 형광 활성화 세포 분류(FACS)로 분석할 때까지 얼음 위에 보관합니다.
  9. FACS 분석의 경우, 측면 산란(SSC-A) 대 전방 산란(FSC-A)을 사용하여 세포를 분산시켜 잔해를 배제합니다. 또한, 전방 산란 높이(FSC-H) 대 전방 산란 영역(FSC-A)을 사용하여 게이트 세포를 분배하여 살아있는 세포 집단에서 싱글렛과 더블렛을 구별합니다.
    참고: 모든 마커에 대한 이소타입 대조군의 이동과 관련하여 세포를 게이팅하고, 모든 염색된 샘플에서 최소 10,000개의 게이팅된 이벤트를 분석에 사용했습니다.

4. 중간엽 줄기세포의 지방세포로의 분화

  1. 10% 녹아웃 혈청 대체물(KOSR), 1% 글루타민, 1% P/S, 4.5ng/μL의 포도당을 최소 필수 배지(MEM)-알파에 첨가하여 지방세포 분화 기본 배지를 준비하고 4°C에서 보관합니다.
  2. MSC가 90% 이상의 밀도에 도달하도록 합니다. 성장 정지 기간을 겪을 수 있도록 48시간 동안 계속 배양합니다.
  3. 100μg/mL의 3-이소부틸-1-메틸크산틴(IBMX), 1μM의 덱사메타손, 0.2U/mL의 인슐린, 100μM의 인도메타신 및 10μM의 로시글리타존을 기본 배지에 추가하여 완전한 지방세포 분화 배지를 준비합니다.
  4. MSC 분화 배지를 제거하고 DPBS를 사용하여 세포를 세척합니다.
  5. 6-웰 플레이트의 웰에 2 mL 및 12-웰 플레이트의 웰에 1 mL-완전 지방세포 분화 배지를 추가하고, 세포를 37°C에서 배양한다. 14일 동안 격일로 완전한 분화 배지를 교체하십시오.

5. 지방세포의 분화 효율 평가

  1. 분화 14일째에 지방세포 성숙 마커인 FABP4와 아디포넥틴을 세포에 염색하여 분화 효율을 확인하였다.
  2. 배지를 제거하고 DPBS로 세포를 세척합니다.
  3. 200 μL의 4% 파라포름알데히드(PFA)를 사용하여 세포를 24웰 플레이트의 웰에 고정하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
  4. PFA를 버리고 0.5% 트윈(TBST)이 함유된 트리스 완충 식염수로 세척하고 실온에서 15분 동안 셰이커에 놓습니다. 이 과정을 두 번 반복합니다.
  5. 고정된 세포를 0.5% Triton X-100(PBST)이 함유된 인산염 완충 식염수로 투과시키고 실온에서 15-20분 동안 진탕기에 놓습니다.
  6. PBST를 버리고 블로킹 완충액(PBST 중 5%-6% 소 혈청 알부민(BSA))-500 μL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 250 μL를 12-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 실온에서 40-60분 동안 진탕기에서 배양합니다.
  7. FABP4에 대한 1차 항체, 아디포넥틴을 2%-3% BSA에 1:500의 농도로 희석합니다( 재료 표 참조). 다른 동물에서 자란 경우에만 이러한 항체를 함께 첨가하고 플레이트를 4°C에서 밤새 쉐이커에 놓습니다.
  8. 1차 항체를 제거하고 TBST(각각 15분)로 세포를 3회 세척한 후 실온에서 진탕기에 올려놓았다.
  9. PBST에서 Alexa Fluor 2차 항체를 준비합니다(1:500). 실온에서 60분 동안 2차 항체 조합(1차 항체가 상승하는 종에 따라)에서 세포를 배양하고 플레이트를 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호합니다.
  10. 2차 항체를 버리고 TBST로 3회 세척한 후 플레이트를 셰이커에 올려놓는다.
  11. 핵을 염색하려면 PBS에 희석한 24웰 플레이트의 웰에 1μg/mL의 Hoechst 33342-200μL를 추가하고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
  12. Hoechst 용액을 버리고 PBS-500 μL를 24-웰 플레이트의 웰에 첨가하여 세포에 첨가하였다. 도립 형광 현미경을 사용하여 시각화될 때까지 플레이트를 빛으로부터 덮으십시오.

6. 나일 레드를 이용한 지방 세포 분류

  1. DMSO에 1mg/mL Nile red 원액을 첨가하여 나일 레드 작업 용액을 준비하고 -20°C에서 보관합니다. 사용 직전에 나일강 스톡을 해동하고 DPBS에서 재구성하여 300nM 작업 용액 농도를 달성합니다.
  2. 지방세포 분화 14일째 또는 그 후, 세포로부터 배지를 버리고 DPBS를 사용하여 세척한다.
  3. 나일 레드 작업 용액-1 mL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고 37°C에서 15분 동안 인큐베이션한다.
  4. 나일 레드 용액을 제거하고, 트립신-EDTA-500 μL를 6-웰 플레이트의 웰에 첨가하고, 37°C에서 4분 동안 인큐베이션한다.
  5. 15 mL 코니컬 튜브에 5% FBS를 함유하는 DMEM을 사용하여 세포를 수집한다. 750 x g 에서 4분 동안 원심분리기.
  6. 상층액을 제거하고 1 x 106 세포에 대해 DPBS-1 mL에 재현탁합니다. 750 x g 에서 4분 동안 원심분리기.
  7. 상층액을 제거하고 1 x 106 세포에 대해 DPBS-1 mL에 재현탁합니다. FACS 분류기를 사용하여 FL1 채널을 사용하여 나일 적색 양성 세포를 분리합니다.
  8. 분류된 세포를 지방세포 분화 배지에서 재배양하거나 RNA 및 단백질 분리를 위해 분류된 세포를 수집합니다.
  9. 분류된 세포에서 RNA를 추출하고 FABP4, PPARG 및 C/EBPA를 포함한 지방세포 분화 마커의 상대적 정량 분석을 수행합니다. 나일 적색 양성 세포는 분류되지 않은 세포에 비해 적어도 2배의 유전자 발현에서 상당한 상향 조절을 보여줍니다.

결과

중간엽 분화 중 세포의 도식 및 형태: iPSC를 중간엽 줄기세포로 분화하려면 EB 형성, 중간엽 분화 및 MSC 확장에 걸친 다양한 발달 단계가 포함됩니다(그림 1). 이러한 발달 단계에서 세포는 다양한 자극 화학 물질로 인해 다양한 형태를 얻습니다. 분화가 시작되면 세포는 현탁액에 도말되며 직경이 작거나 중간 크기인 동안 정의된 세포 경계와 함께 둥글게 될 것으로 예상됩니?...

토론

이 프로토콜은 MSC에 높은 수율과 효율성을 제공할 수 있는 능력으로 인해 가장 중요합니다. 중간엽 줄기세포의 이러한 대량 생산은 10μM의 RA14,15를 사용한 iPSC 유래 EB의 일시적인 배양에 의해 가능했습니다. 10μM의 RA를 사용한 일시적인 처리는 MSC 수율을 11.2배에서 1542배까지14,15배 향상시켰으며, 이 프로토콜?...

공개

저자는 경쟁 이익이 없다고 선언합니다.

감사의 말

이 연구는 카타르 국립 연구 기금 (QNRF) (보조금 번호 NPRP10-1221-160041)의 보조금으로 자금을 지원받았습니다. 마리암 아가디는 카타르 국립 연구 기금(QNRF)의 GSRA 장학금을 지원받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
AdiponectinAbcamab22554Adipocyte maturation marker
anti-CD105BD Pharmingen560839MSC differentiation marker
anti-CD14BD Pharmingen561712MSC differentiation marker
anti-CD19BD Pharmingen555415MSC differentiation marker
anti-CD34BD Pharmingen555824MSC differentiation marker
anti-CD44abcamab93758MSC differentiation marker
anti-CD45BD Pharmingen
560975		MSC differentiation marker
anti-CD73BD Pharmingen550256MSC differentiation marker
anti-CD90BD Pharmingen555596MSC differentiation marker
bFGFR&D233-FPMSC culture media supplement
C/EBPAAbcamab40761Adipocyte maturation marker
DexamethasoneTorics1126Adipocyte differentiation media supplement
FABP4Abcamab93945Adipocyte maturation marker
Fetal bovine serumThermoFisher10082147MSC culture media supplement
GlutamaxThermoFisher35050-061MSC culture media supplement
IBMXSigma AldrichI5879Adipocyte differentiation media supplement
IndomethacinSigma AldrichI7378Adipocyte differentiation media supplement
InsulinSigma Aldrich91077CAdipocyte differentiation media supplement
Knockout DMEMThermoFisher12660012Basal media for preparing matrigel
Low glucose DMEMThermoFisher11885084MSC culturing media
MatrigelCorning354230Coating matrix
MEM-alphaThermoFisher12561056Adipocyte differentiation media
NileredSigma Aldrich19123Sorting marker for adipocyte
PenicillinThermoFisher15140122MSC/Adipocyte media supplement
Phosphate-buffered salineThermoFisher14190144wash buffer
Pierce™ 20X TBS BufferThermo Fisher28358wash buffer
PPARGCell Signaling Technology2443Adipocyte maturation marker
ReLeSRStem Cell Technologies5872Dissociation reagent
Retinoic acidSigma AldrichR2625MSC differentiation media supplement
Rock inhibitorTocris1254/10hPSC culture media supplement
RoziglitazoneSigma AldrichR2408Adipocyte differentiation media supplement
StemFlexThermoFisherA334901hPSC culture media
TritonThermo Fisher28314Permebealization reagent
TrypsinThermoFisher25200072Dissociation reagent
Tween 20Sigma AldrichP7942Wash buffer

참고문헌

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