通过脑室内注射血红蛋白模拟新生儿脑室内出血

摘要

我们提出了一种使用大鼠幼崽的新生儿脑室内出血模型，该模型模仿了人类的病理学。

摘要

新生儿脑室内出血 （IVH） 是早产的常见后果，可导致脑损伤、出血后脑积水 （PHH） 和终生神经功能缺损。虽然PHH可以通过暂时性和永久性脑脊液（CSF）分流程序（分别为心室储液器和脑室腹腔分流术）进行治疗，但没有药物策略来预防或治疗IVH诱导的脑损伤和脑积水。需要动物模型来更好地了解IVH的病理生理学并测试药物治疗。虽然有现有的新生儿IVH模型，但那些可靠地导致脑积水的模型通常受到大容量注射的必要性的限制，这可能会使病理建模复杂化或引入观察到的临床表型的变异性。

最近的临床研究表明，血红蛋白和铁蛋白会导致脑室内扩大。在这里，我们开发了一种简单的动物模型，该模型利用血液分解产物血红蛋白的小容量脑室内注射来模拟PHH的临床表型。除了可靠地诱导心室扩大和脑积水外，该模型还会导致脑室周围和白质区域的白质损伤、炎症和免疫细胞浸润。本文描述了这种临床相关的简单方法，用于使用脑室内注射模拟新生大鼠的IVH-PHH，并提出了量化注射后心室大小的方法。

引言

新生儿脑室内出血性脑室内出血起源于生发基质，生发基质是与发育中的大脑侧脑室相邻的快速细胞分裂部位。这种高度血管结构容易受到与早产相关的血流动力学不稳定的影响。在生发基质出血（GMH）-IVH中，当生发基质内脆弱的血管破裂时，血液被释放到侧脑室。在IV级IVH的情况下，脑室周围出血性梗死也可能导致脑内血液制品的释放。¹ GMH-IVH联合使用可能导致PHH，特别是在高度出血（III级和IV^级）后1。PHH 可通过放置脑室腹腔分流术进行治疗，但分流放置不能逆转 IVH 可能引起的脑损伤。尽管现代新生儿重症监护降低了 IVH^{2、 3} 的发病率，但一旦发生 IVH 引起的脑损伤或脑积水，尚无特异性治疗方法。开发IVH诱导的脑损伤和PHH的预防性治疗的一个重大限制是对IVH病理生理学的不完全理解。

最近，关键血液分解产物血红蛋白的早期脑脊液水平已被证明与高级别IVH⁴新生儿PHH的后期发展有关。此外，铁处理途径蛋白（血红蛋白、铁蛋白和胆红素）的脑脊液水平与新生儿 IVH 的心室大小有关。在一项多中心早产儿队列中也显示了这一点，其中较高的脑室脑脊液铁蛋白水平与较大的心^室大小5相关。

在这项研究中，我们开发了一个临床相关的IVH诱导的脑损伤和脑积水模型，利用血红蛋白注射到脑室，可以量化脑损伤和PHH，并测试新的治疗策略（图1）^{6， 7}。该IVH模型利用新生大鼠幼崽，在手术过程中将其置于全身麻醉下。在头皮上做一个中线切口，并使用从颅骨标志（前辰或λ）得出的坐标来瞄准侧脑室进行注射。使用输液泵缓慢注射将血红蛋白输送到心室。该协议易于使用，用途广泛，并且可以模拟导致PHH的IVH的不同成分。

研究方案

注意:所有动物方案均已获得机构的动物护理和使用委员会的批准。有关本协议中使用的所有材料、试剂、设备和软件的详细信息，请参阅 材料表 。

1.血红蛋白和脑脊液的制备

1. 通过将 500 μL aCSF 溶液添加到 1.5 mL 微管中并储存在冰上来制备无菌人工 CSF （aCSF） 溶液。
2. 通过在 1.5 mL 微管中将 75 mg 血红蛋白添加到 500 μL aCSF 中制备无菌 150 mg/mL 血红蛋白溶液并储存在冰上。

2.注射用动物的制备

1. 将加热垫转到培养基设置以保持大鼠的体温。
2. 在充满3%异氟醚的诱导室中麻醉出生后第4天（P4）大鼠。
   注意:每 15 分钟使用脚趾/尾部捏合反应确认足够的麻醉。通过目视观察组织颜色、体温和呼吸频率来监测麻醉。
3. 用5mg / kg皮下卡洛芬注射给麻醉大鼠止痛。
4. 将麻醉大鼠俯卧放在立体定向装置中，鼻子位于麻醉适配器中，恒定流量为1.5%异氟醚。
5. 收紧外耳道上的非破裂耳杆以固定头部。
   注意:如果在注射年龄睁开眼睛，请使用兽医软膏以保持眼睛湿润。
6. 清洁头部，交替使用浸泡在倍他定和70%乙醇中的无菌棉头涂抹器。
   1. 将浸有甜菜碱的涂抹器触摸头皮中心，然后将甜菜碱铺成圆圈，向外移动。
   2. 用浸泡乙醇的涂抹器重复步骤2.6.1.1。
   3. 重复步骤 2.6.1.1 和步骤 2.6.1.2 3 倍。
7. 使用无菌手术布以保护手术区域。
8. 使用无菌手术刀，在头部中心垂直切开 0.3 厘米的切口，露出颅骨的后膛。
   注意:如果从λ注射，请暴露头骨的λ而不是前膛。
9. 使用无菌棉头涂抹器擦干该区域。

3. 设置立体定向注射器

1. 将步骤1.2中制备的血红蛋白溶液吸入带有30G针头的0.3mL无菌注射器中，并将注射器放入立体定向注射器系统中。
   注意:如果产生对照条件，请将步骤1.1中制备的aCSF溶液吸入0.3 mL无菌注射器中并继续执行方案。
2. 打开立体定向注射器界面，点击 配置 按钮输入注射量和速率设置。
   1. 单击体积并将体积设置为 20，000 nL （20 μL）。
   2. 单击输注速率并将速率设置为 8，000 nL/分钟（8 μL/分钟）。
3. 通过单击"重置位置"按钮退出配置。
4. 通过单击 注入按钮冲洗 针尖，直到针尖出现一小颗血红蛋白溶液。
5. 用无菌棉尖涂抹器轻轻地将血红蛋白溶液从针尖吸出。

4. 动物注射

1. 通过调整注射器的中外侧和前后位置，在降低冲洗的注射器针头的尖端以轻轻接触前膛处的颅骨之前，将立体定向注射器系统上的 前膛 设置为 零 。
   注意:如果从 lambda 注入，请将 lambda 设置为 零。
2. 确定所选坐标。
   1. 如果从前膛注射，在这里描述 的P4大鼠 中，使用距前膛 1.5毫米侧向，0.4毫米前方和2.0毫米深。
   2. 如果从λ注射，请使用以下 P4大鼠坐标:侧向1.1毫米，前部4.6毫米，距λ深3.3毫米。
3. 将注射器针头抬高到颅骨上方 1 厘米处以清洁头皮。当注射器升起时，继续设置中外侧和前后坐标。
4. 放下注射器针头，轻轻触摸头骨。检查针是否接触颅骨。
5. 在 30 秒的周期内设置背腹坐标。
   注意:在设置背腹坐标时，针头会刺穿颅骨。必须注意确保注射器穿过颅骨而不会使颅骨变形。如果发生变形，则沿背腹坐标缓慢抽出针头，然后沿同一轨迹将针放回，从而避免颅骨变形。这使得针头能够以较小的力穿过颅骨上的孔，而不会变形。
6. 在立体定向注射器界面上，单击 "运行" 按钮开始注射。
7. 注射完成后，将注射器针头留在原位2分钟，以尽量减少溶液回流。
8. 沿背腹坐标缓慢取出注射器2分钟，直到针尖在头皮上方2厘米处。
9. 将立体定向注射器臂旋转远离手术区域。

5. 术后护理

1. 用6-0单丝缝合线关闭头皮。在0.3厘米切口的中心进行一次简单的中断缝合。
2. 将幼犬从麻醉中取出，并将其放在加热垫上的安全区域。
3. 将啮齿动物放回家笼，在其大坝的照顾下从麻醉中恢复过来。
   注意:及时返回大坝护理可降低术后早期死亡率。
4. 通过手术后每小时失去矫正反射3小时来监测动物的麻醉。
5. 每天监测动物 7 天的正常活动、食物摄入量和体重增加。监测切口部位的伤口愈合、缝合和手术部位皮毛的重新出现。
   注意:在监测期间观察到癫痫发作、中枢性抑郁或食欲下降等神经系统变化的极少数情况下，使用血管内灌注或在麻醉下颈椎脱位对动物实施安乐死。
6. 为了在缝合线闭合和伤口愈合后防止感染，请在切口部位使用局部三联抗生素。

6. 核磁共振成像采集和定量

1. 在 4.7T 或 9.4T 小动物扫描仪上进行 MRI。
2. 将加热垫转到培养基设置以保持大鼠的体温。
3. 使用3%异氟醚在腔室中诱导麻醉。
   注意:每 15 分钟使用脚趾/尾部捏合反应确认足够的麻醉。通过目视观察组织颜色、体温和呼吸频率来监测麻醉。
4. 将麻醉大鼠俯卧在MRI中，鼻子位于麻醉适配器中，恒定流量为1.5%异氟醚。
5. 通过选择 T2 加权快速自旋回波序列进行 T2 加权成像。
   1. 如果使用 4.7T MRI 扫描仪，请在 MRI 软件中输入以下参数:重复时间 = 3，000 ms，回波时间 = 27.50 ms，平均值数 = 3，视场 = 18.0 mm x 18.0 mm，矩阵 = 128 x 128，轴向切片数 = 24，厚度 = 0.50 mm。
   2. 如果使用 9.4T MRI 扫描仪，请在 MRI 软件中输入以下参数:重复时间 = 5，000 ms，回波时间 = 66.00 ms，回波间隔 = 16.50 ms，平均值数 = 2，重复次数 = 1，稀有因子 = 8，视场 = 16.0 mm x 16.0 mm，矩阵 = 256 x 256，轴向切片数 = 32，厚度 = 0.50 mm。
6. 单击 "继续" 按钮开始序列。

7. 图像处理与分析

1. 使用原生 T2 加权数据分析脑容量。使用分割软件手动描绘侧脑室⁶.单击画笔 模式 并选择 方形画笔 样式。将画笔大小调整为 1。 单击布局检查器 并选择 轴视图。单击 缩放以适合。将光标放在图像上;追踪并填充侧脑室间隙。
2. 单击工具栏中的细分|卷和统计信息以查看分段卷。

结果

通过放射学和免疫组织化学手段证实了注射的成功。通过MRI评估时，接受血红蛋白注射的动物发生中度急性脑室肿大（图2A），与注射aCSF的动物相比，注射血红蛋白后24小时和72小时的侧脑室显着更大（图2B，C）。虽然注射后38天注射血红蛋白和注射aCSF的动物在侧脑室容积方面没有显着差异（图2D），但重要的是要注意，注射后38天的血红蛋...

讨论

这种利用血红蛋白注射的IVH模型允许研究由血红蛋白特异性介导的IVH的病理学。对于补充研究，血红蛋白也可以很容易地 在体外 递送，并且不会混淆全血中存在的小胶质细胞/巨噬细胞产生的蛋白质的生化测定。

IVH-PHH的主要理论包括脑脊液循环的机械性阻塞，室管膜壁内壁纤毛的破坏，炎症，纤维化和铁毒性¹⁰。现有的IVH动物模型，例如胶原酶诱导?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL insulin syringe	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube	USA Scientific	1615-5500	Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture	ETHICON	667G
9.4T MRI	Bruker	BioSpec 94/20	Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance	CCURIS Instruments	W3200-320
Artificial CSF (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	Batch No: 72A
Betadine	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable)	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
Ethanol	Decon Laboratories	2701
Heating pad	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin	MP Biomedicals	100714	LOT NO. SR02321
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer	VETEQUIP	911103
Light for stereotactic insturment	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	MICRO21	Serial 184034 T08K
MRI software	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
Oxygen	Airgas Healthcare	UN1072	LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats	Charles River Laboratories	Strain code: 001
Stereotactic instrument	KOPF Instuments	Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator	Fischerbrand	23-400-118
Surgical blade	covetrus	#10
Topical triple antibiotic	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta