Modelagem da Hemorragia Intraventricular Neonatal Através da Injeção Intraventricular de Hemoglobina

Resumo

Apresentamos um modelo de hemorragia intraventricular neonatal utilizando filhotes de ratos que mimetiza a patologia observada em humanos.

Resumo

A hemorragia intraventricular neonatal (IVH) é uma consequência comum do parto prematuro e leva a lesão cerebral, hidrocefalia pós-hemorrágica (HPH) e déficits neurológicos ao longo da vida. Embora a PHH possa ser tratada por procedimentos de desvio temporários e permanentes do líquido cefalorraquidiano (LCR) (reservatório ventricular e shunt ventriculoperitoneal, respectivamente), não há estratégias farmacológicas para prevenir ou tratar lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia. Modelos animais são necessários para entender melhor a fisiopatologia da IVH e testar tratamentos farmacológicos. Embora existam modelos existentes de HVI neonatal, aqueles que resultam de forma confiável em hidrocefalia são frequentemente limitados pela necessidade de injeções de grande volume, o que pode complicar a modelagem da patologia ou introduzir variabilidade no fenótipo clínico observado.

Estudos clínicos recentes implicaram hemoglobina e ferritina na causa de aumento ventricular após IVH. Aqui, desenvolvemos um modelo animal simples que imita o fenótipo clínico da PHH utilizando injeções intraventriculares de pequeno volume do produto de degradação do sangue hemoglobina. Além de induzir de forma confiável o aumento ventricular e a hidrocefalia, esse modelo resulta em lesão da substância branca, inflamação e infiltração de células imunes nas regiões periventricular e da substância branca. Este trabalho descreve este método clinicamente relevante e simples para modelar a HPH-IV em ratos neonatais usando injeção intraventricular e apresenta métodos para quantificar o tamanho do ventrículo após a injeção.

Introdução

A IVH neonatal origina-se da matriz germinativa, um local de rápida divisão celular adjacente aos ventrículos laterais do cérebro em desenvolvimento. Essa estrutura altamente vascular é vulnerável à instabilidade hemodinâmica relacionada ao parto prematuro. O sangue é liberado nos ventrículos laterais na hemorragia da matriz germinativa (GMH)-IVH quando os vasos sanguíneos frágeis dentro da matriz germinativa se rompem. No caso da IV IV de grau IV, o infarto hemorrágico periventricular também pode contribuir para a liberação de hemoderivados dentro do cérebro. ¹ A combinação de GMH-IVH pode causar HPH, particularmente após hemorragia de alto grau (graus III e IV)¹. A HPH pode ser tratada com a colocação de um shunt ventriculoperitoneal, mas a colocação do shunt não reverte a lesão cerebral que pode ocorrer a partir da IVH. Embora a terapia intensiva neonatal moderna tenha reduzido as taxas de IVH², ^3, não há tratamentos específicos para a lesão cerebral ou hidrocefalia causada pela IVH uma vez que tenha ocorrido. Uma limitação significativa no desenvolvimento de tratamentos preventivos para lesão cerebral induzida por HIV e HPH é a compreensão incompleta da fisiopatologia da HIV.

Recentemente, os níveis iniciais do LCR de hemoglobina de produto chave de degradação do sangue demonstraram estar associados ao desenvolvimento posterior de PHH em neonatos com IVH de alto grau⁴. Além disso, os níveis de proteínas da via de manipulação de ferro no LCR – hemoglobina, ferritina e bilirrubina – estão associados ao tamanho do ventrículo na IVH neonatal. Isso também foi demonstrado em uma coorte multicêntrica de lactentes com HPH pré-termo, onde níveis mais elevados de ferritina no LCR ventricular foram associados a um tamanho maior do ventrículo⁵.

Neste estudo, desenvolvemos um modelo clinicamente relevante de lesão cerebral induzida por IV e hidrocefalia utilizando injeção de hemoglobina nos ventrículos cerebrais, que permite quantificar a lesão cerebral e a HPH e testar novas estratégias terapêuticas (Figura 1)^{6, 7}. Este modelo IVH utiliza filhotes de ratos neonatais, que são colocados sob anestesia geral durante o procedimento. Uma incisão na linha média é feita no couro cabeludo, e coordenadas derivadas de marcos do crânio - o bregma ou lambda - são usadas para atingir os ventrículos laterais para injeção. A injeção lenta usando uma bomba de infusão fornece hemoglobina no ventrículo. Este protocolo é fácil de usar, versátil e pode modelar diferentes componentes da IVH que resultam em PHH.

Protocolo

NOTA: Todos os protocolos de animais foram aprovados pelo Comitê de Cuidado e Uso de Animais das instituições. Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes sobre todos os materiais, reagentes, equipamentos e softwares usados neste protocolo.

1. Preparação de soluções de hemoglobina e LCR

1. Preparar uma solução estéril de LCR artificial (aCSF) adicionando 500 μL da solução de aCSF a um microtubo de 1,5 ml e conservar em gelo.
2. Preparar uma solução estéril de hemoglobina de 150 mg/mL adicionando 75 mg de hemoglobina a 500 μL de aCSF em um microtubo de 1,5 mL e armazenar no gelo.

2. Preparação do animal para injeção

1. Gire a almofada de aquecimento para a configuração média para manter a temperatura corporal do rato.
2. Anestesiar ratos pós-natais do dia 4 (P4) em uma câmara de indução preenchida com isoflurano a 3%.
   NOTA: Confirme anestesia suficiente usando a resposta dedo do pé/pinça da cauda a cada 15 minutos. Monitore a anestesia com observação visual da cor do tecido, temperatura corporal e frequência respiratória.
3. Administrar alívio da dor com uma injeção subcutânea de carprofeno de 5 mg/kg no rato anestesiado.
4. Colocar o rato anestesiado propenso no aparelho estereotáxico com o nariz posicionado no adaptador anestésico com fluxo constante de isoflurano a 1,5%.
5. Aperte as barras auriculares não rupturas no conduto auditivo externo para prender a cabeça.
   NOTA: Aplique pomada veterinária para manter os olhos hidratados se os olhos estiverem abertos na idade da injeção.
6. Limpe a cabeça, alternando com aplicadores estéreis com ponta de algodão embebidos em betadina e etanol a 70%.
   1. Toque o aplicador embebido em betadine no centro do couro cabeludo e espalhe o betadine em círculos, movendo-se para fora.
   2. Repetir o passo 2.6.1.1 com o aplicador embebido em etanol.
   3. Repita a etapa 2.6.1.1 e a etapa 2.6.1.2 3x.
7. Aplique uma cortina cirúrgica estéril para proteger o campo cirúrgico.
8. Usando um bisturi estéril, faça uma incisão de 0,3 cm verticalmente no centro da cabeça para expor o bregma do crânio.
   NOTA: Se injetar a partir do lambda, exponha o lambda do crânio em vez do bregma.
9. Use um aplicador estéril com ponta de algodão para secar a área.

3. Configuração do injetor estereotáxico

1. Retirar a solução de hemoglobina preparada no passo 1.2 para uma seringa estéril de 0,3 ml com uma agulha de 30G e colocar a seringa no sistema injetor estereotáxico.
   NOTA: Se gerar condições de controlo, retire uma solução de CSF preparada no passo 1.1 para uma seringa estéril de 0,3 ml e prossiga com o protocolo.
2. Ative a interface do injetor estereotáxico e clique no botão Configuração para inserir as configurações de volume e taxa de injeção.
   1. Clique em Volume e defina o volume em 20.000 nL (20 μL).
   2. Clique em Taxa de infusão e defina a taxa em 8.000 nL /min (8 μL/min).
3. Saia da Configuração clicando no botão Redefinir Pós.
4. Lave a ponta da agulha clicando no botão Infundir até que uma pequena gota de solução de hemoglobina surja na ponta da agulha.
5. Tire suavemente a solução de hemoglobina da ponta da agulha com um aplicador estéril com ponta de algodão.

4. Injeção animal

1. Defina o bregma como zero no sistema injetor estereotáxico ajustando as posições mediolateral e anteroposterior da seringa antes de abaixar a ponta da agulha da seringa lavada para tocar suavemente o crânio no bregma.
   NOTA: Se injetar a partir do lambda, defina lambda como zero.
2. Identifique as coordenadas de escolha.
   1. Se injetar a partir do bregma, em ratos P4 aqui descritos , use 1,5 mm lateral, 0,4 mm anterior e 2,0 mm de profundidade do bregma.
   2. Se injetar a partir do lambda, use as seguintes coordenadas para ratos P4: 1,1 mm lateral, 4,6 mm anterior e 3,3 mm de profundidade do lambda.
3. Levante a agulha da seringa 1 cm acima do crânio para limpar o couro cabeludo. Quando a seringa estiver levantada, proceda à definição das coordenadas mediolateral e anteroposterior.
4. Abaixe a agulha da seringa para tocar suavemente o crânio. Verifique se a agulha está tocando o crânio.
5. Defina a coordenada dorsoventral ao longo de um período de 30 s.
   NOTA: Ao definir a coordenada dorsoventral, a agulha perfurará o crânio. Deve-se tomar cuidado para garantir que a seringa passe pelo crânio sem deformar o crânio. A deformação do crânio é evitada retirando lentamente a agulha ao longo da coordenada dorsoventral se ocorrer deformação e, em seguida, colocando a agulha de volta ao longo da mesma trajetória. Isso permite que a agulha passe através do orifício no crânio com menos força e sem deformação.
6. Na interface do injetor estereotáxico, clique no botão Executar para iniciar a injeção.
7. Após o término da injeção, deixe a agulha da seringa no lugar por 2 minutos para minimizar o refluxo da solução.
8. Retire a seringa lentamente ao longo da coordenada dorsoventral durante 2 minutos até que a ponta da agulha esteja 2 cm acima do couro cabeludo.
9. Gire o braço injetor estereotáxico para longe do campo operatório.

5. Cuidados pós-operatórios

1. Feche o couro cabeludo com uma sutura de monofilamento 6-0. Faça uma sutura simples interrompida no centro da incisão de 0,3 cm.
2. Retire o filhote da anestesia e coloque-o em uma área segura na almofada de aquecimento.
3. Devolva o roedor à gaiola de casa para se recuperar da anestesia sob os cuidados de sua represa.
   NOTA: O retorno oportuno aos cuidados da barragem reduz a mortalidade pós-operatória precoce.
4. Monitorar os animais para anestesia por perda do reflexo de endireitamento de hora em hora após a cirurgia por 3 h.
5. Monitore os animais diariamente por 7 dias para atividade normal, ingestão de alimentos e ganho de peso. Monitore o local da incisão para cicatrização, fechamento e reaparecimento de pelos no local da cirurgia.
   NOTA: No caso raro de alterações neurológicas, como convulsões, depressão central ou diminuição do apetite, serem observadas durante o monitoramento, eutanasie o animal usando perfusão intravascular ou luxação cervical sob anestesia.
6. Para prevenir a infecção, uma vez que a sutura é fechada e a ferida está cicatrizando, aplique antibiótico triplo tópico no local da incisão.

6. Aquisição e quantificação por RM

1. Faça ressonância magnética em um scanner de pequenos animais de 4,7T ou 9,4T.
2. Gire a almofada de aquecimento para a configuração média para manter a temperatura corporal do rato.
3. Induzir anestesia em uma câmara usando isoflurano a 3%.
   NOTA: Confirme anestesia suficiente usando a resposta dedo do pé/pinça da cauda a cada 15 minutos. Monitore a anestesia com observação visual da cor do tecido, temperatura corporal e frequência respiratória.
4. Coloque o rato anestesiado propenso na RM com o nariz posicionado no adaptador anestésico com fluxo constante de isoflurano a 1,5%.
5. Realize imagens ponderadas em T2 selecionando uma sequência de eco de spin rápido ponderada em T2.
   1. Se estiver usando um scanner de RM de 4,7T, insira os seguintes parâmetros no software de RM: tempo de repetição = 3.000 ms, tempo de eco = 27,50 ms, número de médias = 3, campo de visão = 18,0 mm x 18,0 mm, matriz = 128 x 128, número de cortes axiais = 24, espessura = 0,50 mm.
   2. Se estiver usando um scanner de ressonância magnética de 9,4T, insira os seguintes parâmetros no software de RM: tempo de repetição = 5.000 ms, tempo de eco = 66,00 ms, espaçamento de eco = 16,50 ms, número de médias = 2, repetições = 1, fator raro = 8, campo de visão = 16,0 mm x 16,0 mm, matriz = 256 x 256, número de cortes axiais = 32, espessura = 0,50 mm.
6. Clique no botão Continuar para iniciar a sequência.

7. Processamento e análise de imagens

1. Use dados nativos ponderados em T2 para analisar o volume cerebral. Utilizar software de segmentação para delinear manualmente os ventrículos laterais⁶. Clique em Modo Pincel e selecione o estilo de pincel quadrado . Ajuste o tamanho do pincel para 1. Clique em Inspetor de layout e selecione modo de exibição axial. Clique em zoom para ajustar. Coloque o cursor sobre a imagem; traçar e preencher o espaço do ventrículo lateral.
2. Clique em Segmentação na barra de ferramentas | Volume e Estatísticas para exibir os volumes segmentados.

Resultados

O sucesso da injeção foi confirmado por meios radiológicos e imuno-histoquímicos. Os animais submetidos à injeção de hemoglobina desenvolveram ventriculomegalia aguda moderada quando avaliados por RM (Figura 2A), com ventrículos laterais significativamente maiores às 24 h e 72 h após a injeção de hemoglobina em comparação aos animais injetados no LCR (Figura 2B,C). Embora não tenha havido diferença significativa no volume do vent...

Discussão

Este modelo de IVH utilizando injeção de hemoglobina permite o estudo da patologia da IVH especificamente mediada pela hemoglobina. Para estudos complementares, a hemoglobina também pode ser facilmente administrada in vitro e não confunde ensaios bioquímicos para proteínas produzidas por micróglias / macrófagos que estão presentes no sangue total.

As principais teorias da HIF-IV incluem a obstrução mecânica da circulação do LCR, a ruptura dos cílios que revestem as pare...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL insulin syringe	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube	USA Scientific	1615-5500	Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture	ETHICON	667G
9.4T MRI	Bruker	BioSpec 94/20	Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance	CCURIS Instruments	W3200-320
Artificial CSF (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	Batch No: 72A
Betadine	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable)	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
Ethanol	Decon Laboratories	2701
Heating pad	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin	MP Biomedicals	100714	LOT NO. SR02321
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer	VETEQUIP	911103
Light for stereotactic insturment	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	MICRO21	Serial 184034 T08K
MRI software	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
Oxygen	Airgas Healthcare	UN1072	LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats	Charles River Laboratories	Strain code: 001
Stereotactic instrument	KOPF Instuments	Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator	Fischerbrand	23-400-118
Surgical blade	covetrus	#10
Topical triple antibiotic	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta