JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu yazıda, insanlarda görülen patolojiyi taklit eden sıçan yavrularının kullanıldığı bir yenidoğan intraventriküler kanama modeli sunulmuştur.

Özet

Yenidoğan intraventriküler kanaması (IVH) erken doğumun yaygın bir sonucudur ve beyin hasarına, posthemorajik hidrosefaliye (PHH) ve yaşam boyu nörolojik defisitlere yol açar. PHH geçici ve kalıcı beyin omurilik sıvısı (BOS) saptırma prosedürleri (sırasıyla ventriküler rezervuar ve ventriküloperitoneal şant) ile tedavi edilebilirken, IVH kaynaklı beyin hasarı ve hidrosefaliyi önlemek veya tedavi etmek için farmakolojik stratejiler yoktur. IVH'nin patofizyolojisini daha iyi anlamak ve farmakolojik tedavileri test etmek için hayvan modellerine ihtiyaç vardır. Mevcut yenidoğan IVH modelleri olsa da, güvenilir bir şekilde hidrosefali ile sonuçlananlar genellikle patolojinin modellenmesini zorlaştırabilecek veya gözlemlenen klinik fenotipte değişkenlik yaratabilecek büyük hacimli enjeksiyonların gerekliliği ile sınırlıdır.

Son klinik çalışmalar, hemoglobin ve ferritinin IVH sonrası ventrikül genişlemesine neden olduğunu göstermiştir. Burada, kan parçalanma ürünü hemoglobinin küçük hacimli intraventriküler enjeksiyonlarını kullanarak PHH'nin klinik fenotipini taklit eden basit bir hayvan modeli geliştiriyoruz. Ventriküler genişleme ve hidrosefaliyi güvenilir bir şekilde indüklemenin yanı sıra, bu model periventriküler ve beyaz cevher bölgelerinde beyaz cevher hasarı, inflamasyon ve immün hücre infiltrasyonu ile sonuçlanır. Bu yazıda, intraventriküler enjeksiyon kullanılarak yenidoğan sıçanlarda IVH-PHH modellemesi için klinik olarak alakalı, basit bir yöntem açıklanmakta ve enjeksiyon sonrası ventrikül boyutunun ölçülmesi için yöntemler sunulmaktadır.

Giriş

Yenidoğan IVH, gelişmekte olan beynin lateral ventriküllerine bitişik olan hızlı hücre bölünmesi bölgesi olan germinal matriksten kaynaklanır. Bu yüksek vasküler yapı, erken doğuma bağlı hemodinamik instabiliteye karşı savunmasızdır. Germinal matriks kanamasında (GMH)-IVH'de germinal matriks rüptürü içindeki kırılgan kan damarları olduğunda lateral ventriküllere kan salınır. Derece IV IVH durumunda, periventriküler hemorajik enfarktüs de beyindeki kan ürünlerinin salınımına katkıda bulunabilir. 1 GMH-IVH kombinasyonu, özellikle yüksek dereceli kanamadan sonra (derece III ve IV) PHH'ye neden olabilir1. PHH, ventriküloperitoneal şantın yerleştirilmesiyle tedavi edilebilir, ancak şant yerleşimi IVH'den kaynaklanabilecek beyin hasarını tersine çevirmez. Modern yenidoğan yoğun bakımı IVH2, 3 oranlarını düşürmüş olsa da, IVH'nin neden olduğu beyin hasarı veya hidrosefali için spesifik bir tedavi yoktur. IVH kaynaklı beyin hasarı ve PHH için önleyici tedavilerin geliştirilmesinde önemli bir sınırlama, IVH patofizyolojisinin tam olarak anlaşılamamasıdır.

Son zamanlarda, anahtar kan parçalanma ürünü hemoglobinin erken BOS seviyelerinin, yüksek dereceli IVH4'lü yenidoğanlarda daha sonra PHH gelişimi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, demir işleme yolu proteinlerinin BOS seviyeleri - hemoglobin, ferritin ve bilirubin - yenidoğan IVH'de ventrikül boyutu ile ilişkilidir. Bu aynı zamanda, daha yüksek ventriküler BOS ferritin düzeylerinin daha büyük ventrikül boyutu5 ile ilişkili olduğu preterm PHH'li bebeklerin çok merkezli bir kohortunda da gösterilmiştir.

Bu çalışmada, beyin hasarı ve PHH'nin nicelleştirilmesine ve yeni terapötik stratejilerin test edilmesine olanak tanıyan beyin ventriküllerine hemoglobin enjeksiyonunu kullanarak IVH kaynaklı beyin hasarı ve hidrosefalinin klinik olarak ilgili bir modelini geliştirdik (Şekil 1) 6, 7. Bu IVH modeli, prosedür süresince genel anestezi altına alınan yenidoğan sıçan yavrularını kullanır. Kafa derisinde bir orta hat insizyonu yapılır ve kafatası işaretlerinden (bregma veya lambda) türetilen koordinatlar, enjeksiyon için lateral ventrikülleri hedeflemek için kullanılır. Bir infüzyon pompası kullanılarak yapılan yavaş enjeksiyon, hemoglobini ventriküle iletir. Bu protokolün kullanımı kolaydır, çok yönlüdür ve IVH'nin PHH ile sonuçlanan farklı bileşenlerini modelleyebilir.

Protokol

NOT: Tüm hayvan protokolleri, kurumların Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır. Bu protokolde kullanılan tüm malzemeler, reaktifler, ekipman ve yazılımlar hakkında ayrıntılar için Malzeme Tablosu'na bakın.

1. Hemoglobin ve BOS çözeltilerinin hazırlanması

  1. 1,5 mL'lik bir mikrotüpe 500 μL aCSF çözeltisi ekleyerek steril bir yapay CSF (aCSF) çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.
  2. 1.5 mL'lik bir mikrotüp içinde 500 μL aCSF'ye 75 mg hemoglobin ekleyerek steril bir 150 mg / mL hemoglobin çözeltisi hazırlayın ve buz üzerinde saklayın.

2. Hayvanın enjeksiyon için hazırlanması

  1. Sıçanın vücut sıcaklığını korumak için ısıtma yastığını orta ayara getirin.
  2. Doğum sonrası gün 4 (P4) sıçanları% 3 izofluran ile dolu bir indüksiyon odasında anestezi yapın.
    NOT: Her 15 dakikada bir ayak parmağı/kuyruk sıkışması yanıtını kullanarak yeterli anesteziyi onaylayın. Doku renginin, vücut ısısının ve solunum hızının görsel gözlemi ile anesteziyi izleyin.
  3. Anestezi uygulanan sıçana 5 mg/kg deri altı karprofen enjeksiyonu ile ağrı kesici uygulayın.
  4. Anestezi uygulanan sıçanı stereotaktik aparatın içine yerleştirin ve burnu anestezi adaptöründe %1,5 izofluran sabit bir akışla konumlandırılsın.
  5. Kafayı sabitlemek için dış işitsel meatus üzerindeki yırtılmayan kulak çubuklarını sıkın.
    NOT: Enjeksiyon çağında gözler açıksa gözleri nemli tutmak için veteriner merhemi uygulayın.
  6. Betadin ve% 70 etanol içine batırılmış steril pamuk uçlu aplikatörlerle dönüşümlü olarak kafayı temizleyin.
    1. Betadin ile ıslatılmış aplikatöre kafa derisinin merkezine dokunun ve betadini dışa doğru hareket ettirerek daireler halinde yayın.
    2. Adım 2.6.1.1'i etanolle ıslatılmış aplikatör ile tekrarlayın.
    3. Adım 2.6.1.1 ve adım 2.6.1.2 3x'i yineleyin.
  7. Cerrahi alanı korumak için steril bir cerrahi örtü uygulayın.
  8. Steril bir neşter kullanarak, kafatasının bregmasını ortaya çıkarmak için başın ortasından dikey olarak 0,3 cm'lik bir kesi yapın.
    NOT: Lambdadan enjekte ediliyorsa, bregma yerine kafatasının lambdasını açığa çıkarın.
  9. Alanı kurutmak için steril pamuk uçlu bir aplikatör kullanın.

3. Stereotaktik enjektörün kurulması

  1. Adım 1.2'de hazırlanan hemoglobin çözeltisini 30G iğneli 0.3 mL'lik steril bir şırıngaya çekin ve şırıngayı stereotaktik enjektör sistemine yerleştirin.
    NOT: Kontrol koşulları oluşturuyorsanız, adım 1.1'de hazırlanan aCSF çözeltisini 0,3 mL'lik steril bir şırıngaya çekin ve protokole devam edin.
  2. Stereotaktik enjektör arayüzünü açın ve enjeksiyon ses seviyesi ve hızı ayarlarını girmek için Yapılandırma düğmesine tıklayın.
    1. Ses seviyesi'ne tıklayın ve ses seviyesini 20.000 nL'ye (20 μL) ayarlayın.
    2. İnfüzyon hızı'na tıklayın ve hızı 8.000 nL / dak (8 μL / dak) olarak ayarlayın.
  3. Pos Sıfırla düğmesine tıklayarak Yapılandırmadan çıkın.
  4. İğne ucunda küçük bir hemoglobin çözeltisi boncuğu ortaya çıkana kadar Demle düğmesine tıklayarak iğne ucunu yıkayın.
  5. Hemoglobin çözeltisini iğne ucundan steril pamuk uçlu bir aplikatör ile yavaşça fitilleyin.

4. Hayvan enjeksiyonu

  1. Bregma'daki kafatasına hafifçe dokunmak için kızarmış şırınga iğnesinin ucunu indirmeden önce şırınganın mediolateral ve anteroposterior pozisyonlarını ayarlayarak stereotaktik enjektör sisteminde bregmayı sıfır olarak ayarlayın.
    NOT: Lambda'dan enjekte ediliyorsa, lambda'yı sıfır olarak ayarlayın.
  2. Seçtiğiniz koordinatları tanımlayın.
    1. Bregmadan enjekte ediliyorsa, burada tarif edilen P4 sıçanlarında , bregmadan 1.5 mm yanal, 0.4 mm ön ve 2.0 mm derinlikte kullanın.
    2. Lambda'dan enjekte ediliyorsa, P4 sıçanları için aşağıdaki koordinatları kullanın: 1.1 mm yanal, 4.6 mm ön ve lambda'dan 3.3 mm derinlik.
  3. Kafa derisini temizlemek için şırınga iğnesini kafatasının 1 cm yukarısına kaldırın. Şırınga kaldırıldığında, mediolateral ve anteroposterior koordinatları ayarlamaya devam edin.
  4. Kafatasına hafifçe dokunmak için şırınga iğnesini indirin. İğnenin kafatasına dokunup dokunmadığını kontrol edin.
  5. Dorsoventral koordinatı 30 s'lik bir periyot boyunca ayarlayın.
    NOT: Dorsoventral koordinatı ayarlarken, iğne kafatasını delecektir. Şırınganın kafatasını deforme etmeden kafatasından geçmesini sağlamak için özen gösterilmelidir. Deformasyon meydana gelirse, iğneyi dorsoventral koordinat boyunca yavaşça çekerek, ardından iğneyi aynı yörünge boyunca geri yerleştirerek kafatası deformasyonu önlenir. Bu, iğnenin kafatasındaki delikten daha az kuvvetle ve deformasyon olmadan geçmesini sağlar.
  6. Stereotaktik enjektör arayüzünde, enjeksiyona başlamak için Çalıştır düğmesine tıklayın.
  7. Enjeksiyon bittikten sonra, çözeltinin geri akışını en aza indirmek için şırınga iğnesini 2 dakika yerinde bırakın.
  8. Şırıngayı, iğne ucu kafa derisinin 2 cm yukarısında olana kadar 2 dakika boyunca dorsoventral koordinat boyunca yavaşça çekin.
  9. Stereotaktik enjektör kolunu ameliyat alanından uzağa döndürün.

5. Postoperatif bakım

  1. Kafa derisini 6-0 monofilament dikişle kapatın. 0.3 cm'lik insizyonun merkezinde basit bir kesilmiş dikiş yapın.
  2. Yavruyu anesteziden çıkarın ve ısıtma yastığı üzerindeki güvenli bir alana yerleştirin.
  3. Barajının bakımı altındaki anesteziden kurtulmak için kemirgeni ev kafesine geri getirin.
    NOT: Barajın bakımına zamanında geri dönülmesi, ameliyat sonrası erken mortaliteyi azaltır.
  4. Ameliyat sonrası saatte 3 saat boyunca doğru refleksi kaybederek hayvanları anestezi için izleyin.
  5. Normal aktivite, yiyecek alımı ve kilo alımı için hayvanları 7 gün boyunca günlük olarak izleyin. Yara iyileşmesi, kapanması ve ameliyat yerinde kürkün yeniden ortaya çıkması için insizyon bölgesini izleyin.
    NOT: İzleme sırasında nöbetler, merkezi depresyon veya iştah azalması gibi nörolojik değişikliklerin gözlendiği nadir durumlarda, anestezi altında intravasküler perfüzyon veya servikal çıkık kullanarak hayvanı ötenazi yapın.
  6. Dikiş kapatıldıktan ve yara iyileştikten sonra enfeksiyonu önlemek için, insizyon bölgesine topikal üçlü antibiyotik uygulayın.

6. MRG edinimi ve nicelleştirme

  1. MRG'yi 4.7T veya 9.4T küçük hayvan tarayıcıda gerçekleştirin.
  2. Sıçanın vücut sıcaklığını korumak için ısıtma yastığını orta ayara getirin.
  3. % 3 izofluran kullanarak bir odada anestezi indükleyin.
    NOT: Her 15 dakikada bir ayak parmağı/kuyruk sıkışması yanıtını kullanarak yeterli anesteziyi onaylayın. Doku renginin, vücut ısısının ve solunum hızının görsel gözlemi ile anesteziyi izleyin.
  4. Anestezi uygulanan sıçanı MRG'ye yerleştirin, burun anestezi adaptöründe konumlandırılmış% 1.5 izofluran sabit bir akışla yerleştirilmiştir.
  5. T2 ağırlıklı hızlı dönüş yankı dizisi seçerek T2 ağırlıklı görüntüleme gerçekleştirin.
    1. 4.7T MRI tarayıcı kullanıyorsanız, MRI yazılımına aşağıdaki parametreleri girin: tekrarlama süresi = 3.000 ms, yankı süresi = 27.50 ms, ortalama sayısı = 3, görüş alanı = 18.0 mm x 18.0 mm, matris = 128 x 128, eksenel dilim sayısı = 24, kalınlık = 0.50 mm.
    2. 9.4T MRI tarayıcı kullanıyorsanız, MRI yazılımına aşağıdaki parametreleri girin: tekrarlama süresi = 5.000 ms, yankı süresi = 66.00 ms, yankı aralığı = 16.50 ms, ortalama sayısı = 2, tekrarlar = 1, nadir faktör = 8, görüş alanı = 16.0 mm x 16.0 mm, matris = 256 x 256, eksenel dilim sayısı = 32, kalınlık = 0.50 mm.
  6. Diziyi başlatmak için Devam düğmesine tıklayın.

7. Görüntü işleme ve analizi

  1. Beyin hacmini analiz etmek için yerel T2 ağırlıklı verileri kullanın. Lateral ventrikülleri manuel olarak tanımlamak için segmentasyon yazılımı kullanın6. Boya Fırçası Modu'na tıklayın ve kare fırça stilini seçin. Fırça boyutunu 1 olarak ayarlayın. Düzen denetçisi'ni tıklatın ve eksenel görünümü seçin. Sığdırmak için yakınlaştır'ı tıklayın. İmleci görüntünün üzerine getirin; lateral ventrikül boşluğunu izleyin ve doldurun.
  2. Araç çubuğunda Segmentasyon'a tıklayın | Bölümlere ayrılmış birimleri görüntülemek için Hacim ve İstatistikler.

Sonuçlar

Enjeksiyonun başarısı radyolojik ve immünohistokimyasal yollarla doğrulandı. Hemoglobin enjeksiyonu yapılan hayvanlar, MRG ile değerlendirildiğinde orta derecede akut ventrikülomegali geliştirdi (Şekil 2A), aCSF enjekte edilen hayvanlara kıyasla hemoglobin enjeksiyonundan 24 saat ve 72 saat sonra anlamlı derecede daha büyük lateral ventriküller ile (Şekil 2B, C). Enjeksiyondan 38 gün sonra hemoglobin enjekte edilen ve aCSF enj...

Tartışmalar

Hemoglobin enjeksiyonunu kullanan bu IVH modeli, özellikle hemoglobinin aracılık ettiği IVH patolojisinin incelenmesine izin verir. Tamamlayıcı çalışmalar için, hemoglobin in vitro olarak da kolayca verilebilir ve tam kanda bulunan mikroglia / makrofajlar tarafından yapılan proteinler için biyokimyasal tahlilleri karıştırmaz.

IVH-PHH'nin önde gelen teorileri arasında BOS dolaşımının mekanik olarak tıkanması, ependimal duvarları kaplayan kirpiklerin bozulması,...

Açıklamalar

Yazarlar çıkar çatışması olmadığını beyan ederler.

Teşekkürler

JMS, NIH / NINDS R01 NS110793 ve K12'den (Beyin Cerrahı Araştırma Kariyer Geliştirme Programı) finansman aldı. BAM, NIH / NINDS K08 NS112580-01A1, Kentucky Üniversitesi Sinirbilim Araştırma Öncelikli Alan Ödülü ve bir Hidrosefali Derneği Yenilikçi Ödülü'nden fon aldı.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
0.3 mL insulin syringeBD Microfine + Insulin Syringe230-45330.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtubeUSA Scientific1615-5500Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRIAgilent/Varian4.7T/33 cmAgilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament sutureETHICON667G
9.4T MRIBrukerBioSpec 94/20Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balanceCCURIS InstrumentsW3200-320
Artificial CSF (aCSF)Tocris Bioscience3525Batch No: 72A
BetadinePurdue Products L.P.301005-00NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable)Zoetis Inc. PI 4019448Rimadyl
EthanolDecon Laboratories2701
Heating padSunbeamE12107-819UL 612A, Z-1228-001
HemoglobinMP Biomedicals100714LOT NO. SR02321
IsofluranePiramal Critical CareNDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizerVETEQUIP911103
Light for stereotactic insturmentDolan-Jenner industriesFiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pumpWorld Precision InstrumentsMICRO21Serial 184034 T08K
MRI softwareBruker BioSpinParavision 360 3.2
OxygenAirgas HealthcareUN1072LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley ratsCharles River LaboratoriesStrain code: 001
Stereotactic instrumentKOPF InstumentsModel 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicatorFischerbrand23-400-118
Surgical bladecovetrus#10
Topical triple antibioticTriple Antibiotic OintmentNDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification softwareITK-SNAPITK-SNAP 4.0.0 beta

Referanslar

  1. Robinson, S. Neonatal posthemorrhagic hydrocephalus from prematurity: Pathophysiology and current treatment concepts: A review. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 9 (3), (2012).
  2. Hasselager, A. B., Børch, K., Pryds, O. A. Improvement in perinatal care for extremely premature infants in Denmark from. Danish Medical Journal. 63 (1), (1994).
  3. Johnston, P. G., Gillam-Krakauer, M., Fuller, M. P., Reese, J. Evidence-Based Use of Indomethacin and Ibuprofen in the Neonatal Intensive Care Unit. Clinics in Perinatology. 39 (1), (2012).
  4. Mahaney, K. B., Buddhala, C., Paturu, M., Morales, D., Limbrick, D. D., Strahle, J. M. Intraventricular Hemorrhage Clearance in Human Neonatal Cerebrospinal Fluid: Associations with Hydrocephalus. Stroke. , (2020).
  5. Strahle, J. M., et al. Longitudinal CSF Iron Pathway Proteins in Posthemorrhagic Hydrocephalus: Associations with Ventricle Size and Neurodevelopmental Outcomes. Annals of Neurology. 90 (2), (2021).
  6. Strahle, J. M., et al. Role of Hemoglobin and Iron in hydrocephalus after neonatal intraventricular hemorrhage. Neurosurgery. 75 (6), (2014).
  7. Garton, T. P., He, Y., Garton, H. J. L., Keep, R. F., Xi, G., Strahle, J. M. Hemoglobin-induced neuronal degeneration in the hippocampus after neonatal intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1635, (2016).
  8. Goulding, D. S., Caleb Vogel, ., Gensel, R., Morganti, J. C., Stromberg, J. M., Miller, A. J., A, B. Acute brain inflammation, white matter oxidative stress, and myelin deficiency in a model of neonatal intraventricular hemorrhage. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 26 (6), (2020).
  9. Strahle, J., Garton, H. J. L., Maher, C. O., Muraszko, K. M., Keep, R. F., Xi, G. Mechanisms of Hydrocephalus After Neonatal and Adult Intraventricular Hemorrhage. Translational Stroke Research. 3, (2012).
  10. Jinnai, M., et al. A Model of Germinal Matrix Hemorrhage in Preterm Rat Pups. Frontiers in Cellular Neuroscience. 14, (2020).
  11. Georgiadis, P., et al. Characterization of acute brain injuries and neurobehavioral profiles in a rabbit model of germinal matrix hemorrhage. Stroke. 39 (12), (2008).
  12. Cherian, S. S., Love, S., Silver, I. A., Porter, H. J., Whitelaw, A. G. L., Thoresen, M. Posthemorrhagic ventricular dilation in the neonate: Development and characterization of a rat model. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 62 (3), (2003).
  13. Balasubramaniam, J., Xue, M., Buist, R. J., Ivanco, T. L., Natuik, S., del Bigio, ., R, M. Persistent motor deficit following infusion of autologous blood into the periventricular region of neonatal rats. Experimental Neurology. (1), (2006).
  14. Volpe, J. J. Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances. The Lancet Neurology. 8 (1), (2009).
  15. Dobbing, J., Sands, J. Comparative aspects of the brain growth spurt. Early Human Development. 3 (1), (1979).
  16. Craig, A., et al. Quantitative analysis of perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Experimental Neurology. 181 (2), (2003).
  17. Lodygensky, G. A., Vasung, L., Sv Sizonenko, ., Hüppi, P. S. Neuroimaging of cortical development and brain connectivity in human newborns and animal models. Journal of Anatomy. 217 (4), (2010).
  18. Dean, J. M., et al. Strain-specific differences in perinatal rodent oligodendrocyte lineage progression and its correlation with human. Developmental Neuroscience. 33 (34), (2011).
  19. Engelhardt, B. Development of the blood-brain barrier. Cell and Tissue Research. 314 (1), (2003).
  20. Daneman, R., Zhou, L., Kebede, A. A., Barres, B. A. Pericytes are required for bloodĝ€"brain barrier integrity during embryogenesis. Nature. 468 (7323), (2010).
  21. Alles, Y. C. J., Greggio, S., Alles, R. M., Azevedo, P. N., Xavier, L. L., DaCosta, J. C. A novel preclinical rodent model of collagenase-induced germinal matrix/intraventricular hemorrhage. Brain Research. 1356, (2010).
  22. Christian, E. A., et al. Trends in hospitalization of preterm infants with intraventricular hemorrhage and hydrocephalus in the United States. Journal of Neurosurgery: Pediatrics. 17 (3), 2000-2010 (2016).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır