Modélisation de l’hémorragie intraventriculaire néonatale par injection intraventriculaire d’hémoglobine

Résumé

Nous présentons un modèle d’hémorragie intraventriculaire néonatale utilisant des ratons qui imite la pathologie observée chez l’homme.

Résumé

L’hémorragie intraventriculaire néonatale (hémorragie intraventriculaire) est une conséquence fréquente de la naissance prématurée et entraîne des lésions cérébrales, une hydrocéphalie posthémorragique (HPH) et des déficits neurologiques à vie. Bien que l’HPH puisse être traitée par des procédures temporaires et permanentes de dérivation du liquide céphalorachidien (LCR) (réservoir ventriculaire et shunt ventriculopéritonéal, respectivement), il n’existe aucune stratégie pharmacologique pour prévenir ou traiter les lésions cérébrales et l’hydrocéphalie induites par l’hémorragie intraveineuse. Des modèles animaux sont nécessaires pour mieux comprendre la physiopathologie de l’hémorragie intraveineuse et tester les traitements pharmacologiques. Bien qu’il existe des modèles d’hémorragie intranatale néonatale, ceux qui entraînent de manière fiable une hydrocéphalie sont souvent limités par la nécessité d’injections de grand volume, ce qui peut compliquer la modélisation de la pathologie ou introduire une variabilité dans le phénotype clinique observé.

Des études cliniques récentes ont impliqué l’hémoglobine et la ferritine dans l’hypertrophie ventriculaire après une hémorragie intraveineuse. Ici, nous développons un modèle animal simple qui imite le phénotype clinique de PHH en utilisant des injections intraventriculaires de petit volume de l’hémoglobine, produit de dégradation du sang. En plus d’induire de manière fiable l’élargissement ventriculaire et l’hydrocéphalie, ce modèle entraîne des lésions de la substance blanche, une inflammation et une infiltration de cellules immunitaires dans les régions périventriculaires et de la substance blanche. Cet article décrit cette méthode simple et cliniquement pertinente pour modéliser l’HPH-IV chez les rats néonatals par injection intraventriculaire et présente des méthodes pour quantifier la taille du ventricule après l’injection.

Introduction

L’hémorragie intranatale néonatale provient de la matrice germinale, un site de division cellulaire rapide adjacent aux ventricules latéraux du cerveau en développement. Cette structure hautement vasculaire est vulnérable à l’instabilité hémodynamique liée à une naissance prématurée. Le sang est libéré dans les ventricules latéraux lors de l’hémorragie de la matrice germinale (GMH)-IVH lorsque des vaisseaux sanguins fragiles dans la matrice germinale se rompent. Dans le cas de l’hémorragie de grade IV, l’infarctus hémorragique périventriculaire peut également contribuer à la libération de produits sanguins dans le cerveau. ¹ L’association GMH-IVH peut provoquer une HTP, en particulier après une hémorragie de haut grade (grades III et IV)¹. L’HPH peut être traitée avec la mise en place d’un shunt ventriculopéritonéal, mais la mise en place d’un shunt n’inverse pas la lésion cérébrale qui peut survenir à partir de l’hémorragie intraveineuse. Bien que les soins intensifs néonatals modernes aient réduit les taux d’HVN², 3^{, il} n’existe aucun traitement spécifique pour la lésion cérébrale ou l’hydrocéphalie causée par l’hémorragie intraveineuse une fois qu’elle s’est produite. Une limitation importante dans le développement de traitements préventifs pour les lésions cérébrales induites par l’HIV et l’HPH est la compréhension incomplète de la physiopathologie de l’HVN.

Récemment, il a été démontré que les taux précoces de LCR de l’hémoglobine, produit clé de dégradation du sang, étaient associés au développement ultérieur de l’HPH chez les nouveau-nés atteints d’HVN de haut grade⁴. De plus, les taux de LCR de protéines de la voie de traitement du fer – hémoglobine, ferritine et bilirubine – sont associés à la taille du ventricule dans l’hémorragie intranatale néonatale. Cela a également été montré dans une cohorte multicentrique de nourrissons atteints d’HPH prématurée, où des taux de ferritine ventriculaire plus élevés dans le LCR étaient associés à une taille de ventricule plus grande⁵.

Dans cette étude, nous avons développé un modèle cliniquement pertinent de lésion cérébrale et d’hydrocéphalie induite par l’hémoglobine en utilisant l’injection d’hémoglobine dans les ventricules cérébraux, ce qui permet de quantifier les lésions cérébrales et l’HPH et de tester de nouvelles stratégies thérapeutiques (Figure 1)^{6, 7}. Ce modèle d’hémorragie intraveineuse utilise des ratons nouveau-nés, qui sont placés sous anesthésie générale pendant toute la durée de la procédure. Une incision médiane est pratiquée sur le cuir chevelu et les coordonnées dérivées des repères du crâne – le bregma ou lambda – sont utilisées pour cibler les ventricules latéraux pour l’injection. L’injection lente à l’aide d’une pompe à perfusion délivre de l’hémoglobine dans le ventricule. Ce protocole est facile à utiliser, polyvalent et peut modéliser différents composants de l’HIV qui aboutissent à l’HPH.

Protocole

REMARQUE : Tous les protocoles sur les animaux ont été approuvés par le Comité de protection et d’utilisation des animaux des établissements. Consultez le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs, équipements et logiciels utilisés dans ce protocole.

1. Préparation de solutions d’hémoglobine et de LCR

1. Préparer une solution artificielle stérile de LCR (aLCR) en ajoutant 500 μL de la solution de LCRa à un microtube de 1,5 mL et conserver sur de la glace.
2. Préparer une solution stérile d’hémoglobine à 150 mg/mL en ajoutant 75 mg d’hémoglobine à 500 μL de LCRa dans un microtube de 1,5 mL et conserver sur de la glace.

2. Préparation de l’animal pour injection

1. Tournez le coussin chauffant sur le réglage moyen pour maintenir la température corporelle du rat.
2. Anesthésier les rats du jour 4 postnatal (P4) dans une chambre d’induction remplie d’isoflurane à 3 %.
   REMARQUE : Confirmez une anesthésie suffisante en utilisant la réponse de pincement des orteils et de la queue toutes les 15 minutes. Surveillez l’anesthésie avec une observation visuelle de la couleur des tissus, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire.
3. Administrer un soulagement de la douleur avec une injection sous-cutanée de carprofène de 5 mg/kg au rat anesthésié.
4. Placez le rat anesthésié couché dans l’appareil stéréotaxique avec le nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie avec un débit constant d’isoflurane à 1,5%.
5. Serrez les barres auriculaires anti-rupture sur le méat auditif externe pour sécuriser la tête.
   REMARQUE: Appliquez une pommade vétérinaire pour garder les yeux hydratés si les yeux sont ouverts au moment de l’injection.
6. Nettoyez la tête en alternant avec des applicateurs stériles à embout de coton imbibés de bétadine et d’éthanol à 70%.
   1. Touchez l’applicateur imbibé de bétadine au centre du cuir chevelu et étalez la bétadine en cercles, en vous déplaçant vers l’extérieur.
   2. Répétez l’étape 2.6.1.1 avec l’applicateur imbibé d’éthanol.
   3. Répétez l’étape 2.6.1.1 et l’étape 2.6.1.2 3x.
7. Appliquez un champ chirurgical stérile pour protéger le champ chirurgical.
8. À l’aide d’un scalpel stérile, faites une incision verticale de 0,3 cm au centre de la tête pour exposer le bregma du crâne.
   REMARQUE: Si vous injectez à partir du lambda, exposez le lambda du crâne au lieu du bregma.
9. Utilisez un applicateur stérile à embout de coton pour sécher la zone.

3. Mise en place de l’injecteur stéréotaxique

1. Prélever la solution d’hémoglobine préparée à l’étape 1.2 dans une seringue stérile de 0,3 mL à l’aide d’une aiguille 30G et placer la seringue dans le système d’injection stéréotaxique.
   REMARQUE : Si vous générez des conditions de contrôle, aspirer une solution de LCR préparée à l’étape 1.1 dans une seringue stérile de 0,3 mL et suivre le protocole.
2. Allumez l’interface de l’injecteur stéréotaxique et cliquez sur le bouton Configuration pour entrer les paramètres de volume et de débit d’injection.
   1. Cliquez sur Volume et réglez le volume à 20 000 nL (20 μL).
   2. Cliquez sur Débit de perfusion et réglez le débit à 8 000 nL/min (8 μL/min).
3. Quittez la configuration en cliquant sur le bouton Réinitialiser le PDV.
4. Rincez l’extrémité de l’aiguille en cliquant sur le bouton Infuser jusqu’à ce qu’un petit cordon de solution d’hémoglobine émerge à l’extrémité de l’aiguille.
5. Évacuez doucement la solution d’hémoglobine de l’extrémité de l’aiguille avec un applicateur stérile à embout de coton.

4. Injection animale

1. Réglez le bregma à zéro sur le système d’injection stéréotaxique en ajustant les positions médiolatérale et antéropostérieure de la seringue avant d’abaisser l’extrémité de l’aiguille de la seringue rincée pour toucher doucement le crâne au niveau du bregma.
   REMARQUE : Si vous effectuez une injection à partir du lambda, définissez lambda sur zéro.
2. Identifiez les coordonnées de votre choix.
   1. En cas d’injection à partir du bregma, chez les rats P4 décrits ici, utiliser 1,5 mm latéral, 0,4 mm antérieur et 2,0 mm de profondeur à partir de bregma.
   2. En cas d’injection à partir du lambda, utilisez les coordonnées suivantes pour les rats P4 : 1,1 mm latéral, 4,6 mm antérieur et 3,3 mm de profondeur à partir du lambda.
3. Soulevez l’aiguille de la seringue à 1 cm au-dessus du crâne pour dégager le cuir chevelu. Lorsque la seringue est soulevée, procédez au réglage des coordonnées médiolatérales et antéropostérieures.
4. Abaissez l’aiguille de la seringue pour toucher doucement le crâne. Vérifiez que l’aiguille touche le crâne.
5. Réglez la coordonnée dorso-ventrale sur une période de 30 s.
   REMARQUE: Lors du réglage de la coordonnée dorso-ventrale, l’aiguille percera le crâne. Il faut veiller à ce que la seringue traverse le crâne sans déformer le crâne. La déformation du crâne est évitée en retirant lentement l’aiguille le long de la coordonnée dorso-ventrale si une déformation se produit, puis en replaçant l’aiguille le long de la même trajectoire. Cela permet à l’aiguille de passer à travers le trou dans le crâne avec moins de force et sans déformation.
6. Sur l’interface de l’injecteur stéréotaxique, cliquez sur le bouton Exécuter pour commencer l’injection.
7. Une fois l’injection terminée, laissez l’aiguille de la seringue en place pendant 2 minutes pour minimiser le reflux de la solution.
8. Retirer lentement la seringue le long de la coordonnée dorso-ventrale pendant 2 min jusqu’à ce que l’extrémité de l’aiguille soit à 2 cm au-dessus du cuir chevelu.
9. Faites pivoter le bras de l’injecteur stéréotaxique loin du champ opératoire.

5. Soins postopératoires

1. Fermez le cuir chevelu avec une suture monofilament 6-0. Faites une simple suture interrompue au centre de l’incision de 0,3 cm.
2. Retirez le chiot de l’anesthésie et placez-le dans un endroit sûr du coussin chauffant.
3. Retourner le rongeur dans la cage de la maison pour se remettre de l’anesthésie sous la garde de sa mère.
   REMARQUE : Le retour rapide aux soins de la mère réduit la mortalité postopératoire précoce.
4. Surveiller les animaux pour l’anesthésie en perdant le réflexe de redressement toutes les heures après la chirurgie pendant 3 heures.
5. Surveillez les animaux quotidiennement pendant 7 jours pour une activité normale, un apport alimentaire et un gain de poids. Surveillez le site d’incision pour la cicatrisation, la fermeture et la réapparition de la fourrure au site de la chirurgie.
   REMARQUE : Dans les rares cas où des changements neurologiques tels que des convulsions, une dépression centrale ou une diminution de l’appétit sont observés pendant la surveillance, euthanasier l’animal en utilisant une perfusion intravasculaire ou une luxation cervicale sous anesthésie.
6. Pour prévenir l’infection une fois que la suture est fermée et que la plaie guérit, appliquez un triple antibiotique topique au site d’incision.

6. Acquisition et quantification de l’IRM

1. Effectuez une IRM sur un scanner pour petits animaux de 4,7 T ou 9,4 T.
2. Tournez le coussin chauffant sur le réglage moyen pour maintenir la température corporelle du rat.
3. Induire l’anesthésie dans une chambre en utilisant 3% d’isoflurane.
   REMARQUE : Confirmez une anesthésie suffisante en utilisant la réponse de pincement des orteils et de la queue toutes les 15 minutes. Surveillez l’anesthésie avec une observation visuelle de la couleur des tissus, de la température corporelle et de la fréquence respiratoire.
4. Placez le rat anesthésié couché dans l’IRM avec le nez positionné dans l’adaptateur d’anesthésie avec un débit constant de 1,5% d’isoflurane.
5. Effectuez une imagerie pondérée T2 en sélectionnant une séquence d’écho de rotation rapide pondérée T2.
   1. Si vous utilisez un scanner IRM 4,7T, entrez les paramètres suivants dans le logiciel IRM : temps de répétition = 3 000 ms, temps d’écho = 27,50 ms, nombre de moyennes = 3, champ de vision = 18,0 mm x 18,0 mm, matrice = 128 x 128, nombre de tranches axiales = 24, épaisseur = 0,50 mm.
   2. Si vous utilisez un scanner IRM 9,4T, entrez les paramètres suivants dans le logiciel IRM : temps de répétition = 5 000 ms, temps d’écho = 66,00 ms, espacement des échos = 16,50 ms, nombre de moyennes = 2, répétitions = 1, facteur rare = 8, champ de vision = 16,0 mm x 16,0 mm, matrice = 256 x 256, nombre de tranches axiales = 32, épaisseur = 0,50 mm.
6. Cliquez sur le bouton Continuer pour démarrer la séquence.

7. Traitement et analyse d’images

1. Utilisez des données natives pondérées en T2 pour analyser le volume cérébral. Utilisez un logiciel de segmentation pour délimiter manuellement les ventricules latéraux⁶. Cliquez sur Mode pinceau et sélectionnez le style de pinceau carré . Ajustez la taille du pinceau à 1. Cliquez sur Inspecteur de mise en page et sélectionnez Vue axiale. Cliquez sur zoom pour l’ajuster. Placez le curseur sur l’image; tracer et remplir l’espace ventricule latéral.
2. Cliquez sur Segmentation dans la barre d’outils | Volume et statistiques pour afficher les volumes segmentés.

Résultats

Le succès de l’injection a été confirmé par des moyens radiologiques et immunohistochimiques. Les animaux ayant reçu une injection d’hémoglobine ont développé une ventriculomégalie aiguë modérée lors de l’évaluation par IRM (figure 2A), avec des ventricules latéraux significativement plus grands à 24 h et 72 h après l’injection d’hémoglobine par rapport aux animaux injectés par aLCR (figure 2B,C). Bien qu’il n’y a...

Discussion

Ce modèle d’hémoglobine utilisant l’injection d’hémoglobine permet l’étude de la pathologie de l’hémoglobine intraveineuse spécifiquement médiée par l’hémoglobine. Pour les études complémentaires, l’hémoglobine peut également être facilement administrée in vitro et ne confond pas les tests biochimiques pour les protéines fabriquées par les microglies / macrophages présents dans le sang total.

Les principales théories de l’HNV-PHH comprennent l’obst...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL insulin syringe	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube	USA Scientific	1615-5500	Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture	ETHICON	667G
9.4T MRI	Bruker	BioSpec 94/20	Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance	CCURIS Instruments	W3200-320
Artificial CSF (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	Batch No: 72A
Betadine	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable)	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
Ethanol	Decon Laboratories	2701
Heating pad	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin	MP Biomedicals	100714	LOT NO. SR02321
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer	VETEQUIP	911103
Light for stereotactic insturment	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	MICRO21	Serial 184034 T08K
MRI software	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
Oxygen	Airgas Healthcare	UN1072	LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats	Charles River Laboratories	Strain code: 001
Stereotactic instrument	KOPF Instuments	Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator	Fischerbrand	23-400-118
Surgical blade	covetrus	#10
Topical triple antibiotic	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta