Modellazione dell'emorragia intraventricolare neonatale attraverso l'iniezione intraventricolare di emoglobina

Riepilogo

Presentiamo un modello di emorragia intraventricolare neonatale utilizzando cuccioli di ratto che imita la patologia osservata negli esseri umani.

Abstract

L'emorragia intraventricolare neonatale (IVH) è una conseguenza comune della nascita prematura e porta a lesioni cerebrali, idrocefalo postemorragico (PHH) e deficit neurologici per tutta la vita. Mentre la PHH può essere trattata con procedure di diversione temporanea e permanente del liquido cerebrospinale (CSF) (serbatoio ventricolare e shunt ventricolo-peritoneale, rispettivamente), non ci sono strategie farmacologiche per prevenire o trattare la lesione cerebrale indotta da IVH e l'idrocefalo. Sono necessari modelli animali per comprendere meglio la fisiopatologia della fecondazione in vitro e testare i trattamenti farmacologici. Mentre esistono modelli di IVH neonatale, quelli che provocano in modo affidabile l'idrocefalo sono spesso limitati dalla necessità di iniezioni di grandi volumi, che possono complicare la modellazione della patologia o introdurre variabilità nel fenotipo clinico osservato.

Recenti studi clinici hanno implicato l'emoglobina e la ferritina nel causare l'allargamento ventricolare dopo IVH. Qui, sviluppiamo un modello animale semplice che imita il fenotipo clinico di PHH utilizzando iniezioni intraventricolari di piccolo volume del prodotto di rottura del sangue emoglobina. Oltre a indurre in modo affidabile l'allargamento ventricolare e l'idrocefalo, questo modello provoca lesioni della sostanza bianca, infiammazione e infiltrazione delle cellule immunitarie nelle regioni periventricolari e della sostanza bianca. Questo articolo descrive questo metodo semplice e clinicamente rilevante per modellare IVH-PHH in ratti neonatali utilizzando l'iniezione intraventricolare e presenta metodi per quantificare le dimensioni del ventricolo dopo l'iniezione.

Introduzione

L'IVH neonatale ha origine dalla matrice germinale, un sito di rapida divisione cellulare adiacente ai ventricoli laterali del cervello in via di sviluppo. Questa struttura altamente vascolare è vulnerabile all'instabilità emodinamica correlata alla nascita prematura. Il sangue viene rilasciato nei ventricoli laterali nell'emorragia della matrice germinale (GMH)-IVH quando i vasi sanguigni fragili all'interno della matrice germinale si rompono. Nel caso di IVH di grado IV, l'infarto emorragico periventricolare può anche contribuire al rilascio di prodotti ematici all'interno del cervello. ¹ La combinazione di GMH-IVH può causare PHH, in particolare dopo emorragie di alto grado (gradi III e IV)¹. La PHH può essere trattata con il posizionamento di uno shunt ventricolo-peritoneale, ma il posizionamento dello shunt non inverte la lesione cerebrale che può verificarsi dall'IVH. Sebbene la moderna terapia intensiva neonatale abbia abbassato i tassi di IVH², ^3, non ci sono trattamenti specifici per la lesione cerebrale o l'idrocefalo causati da IVH una volta che si è verificato. Una limitazione significativa nello sviluppo di trattamenti preventivi per le lesioni cerebrali indotte da IVH e PHH è la comprensione incompleta della fisiopatologia IVH.

Recentemente, i primi livelli di CSF dell'emoglobina del prodotto chiave di degradazione del sangue hanno dimostrato di essere associati al successivo sviluppo di PHH nei neonati con IVH⁴ di alto grado. Inoltre, i livelli di CSF delle proteine della via di manipolazione del ferro - emoglobina, ferritina e bilirubina - sono associati alla dimensione del ventricolo nell'IVH neonatale. Ciò è stato dimostrato anche in una coorte multicentrica di neonati con PHH pretermine, dove livelli più elevati di ferritina nel liquido cerebrospinale ventricolare erano associati a una dimensione del ventricolo più grande⁵.

In questo studio, abbiamo sviluppato un modello clinicamente rilevante di danno cerebrale indotto da IVH e idrocefalo utilizzando l'iniezione di emoglobina nei ventricoli cerebrali, che consente la quantificazione della lesione cerebrale e PHH e la sperimentazione di nuove strategie terapeutiche (Figura 1) ^{6, 7}. Questo modello IVH utilizza cuccioli di ratto neonatale, che vengono posti in anestesia generale per tutta la durata della procedura. Viene praticata un'incisione della linea mediana sul cuoio capelluto e le coordinate derivate dai punti di riferimento del cranio - il bregma o lambda - vengono utilizzate per colpire i ventricoli laterali per l'iniezione. L'iniezione lenta utilizzando una pompa per infusione fornisce emoglobina nel ventricolo. Questo protocollo è facile da usare, versatile e può modellare diversi componenti di IVH che si traducono in PHH.

Protocollo

NOTA: Tutti i protocolli sugli animali sono stati approvati dal Comitato per la cura e l'uso degli animali delle istituzioni. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, i reagenti, le apparecchiature e il software utilizzati in questo protocollo.

1. Preparazione di soluzioni di emoglobina e liquor

1. Preparare una soluzione sterile di liquido cerebrospinale artificiale (aCSF) aggiungendo 500 μL della soluzione di aCSF a un microtubo da 1,5 ml e conservare su ghiaccio.
2. Preparare una soluzione sterile di emoglobina da 150 mg/ml aggiungendo 75 mg di emoglobina a 500 μL di aCSF in un microtubo da 1,5 ml e conservare su ghiaccio.

2. Preparazione dell'animale per l'iniezione

1. Ruotare la piastra riscaldante sull'impostazione media per mantenere la temperatura corporea del ratto.
2. Anestetizzare i ratti postnatali giorno 4 (P4) in una camera di induzione riempita con isoflurano al 3%.
   NOTA: Confermare un'anestesia sufficiente utilizzando la risposta punta / coda-pizzico ogni 15 minuti. Monitorare l'anestesia con l'osservazione visiva del colore dei tessuti, della temperatura corporea e della frequenza respiratoria.
3. Somministrare sollievo dal dolore con un'iniezione sottocutanea di carprofen da 5 mg/kg al ratto anestetizzato.
4. Posizionare il ratto anestetizzato incline nell'apparato stereotassico con il naso posizionato nell'adattatore per anestesia con un flusso costante di isoflurano all'1,5%.
5. Stringere le barre auricolari senza rottura sul meato uditivo esterno per fissare la testa.
   NOTA: Applicare unguento veterinario per mantenere gli occhi idratati se gli occhi sono aperti all'età dell'iniezione.
6. Pulire la testa, alternando con applicatori sterili con punta di cotone imbevuti di betadine e etanolo al 70%.
   1. Toccare l'applicatore imbevuto di betadine al centro del cuoio capelluto e distribuire il betadine in cerchi, spostandosi verso l'esterno.
   2. Ripetere il passaggio 2.6.1.1 con l'applicatore imbevuto di etanolo.
   3. Ripetere il passaggio 2.6.1.1 e il passaggio 2.6.1.2 3x.
7. Applicare un drappo chirurgico sterile per proteggere il campo chirurgico.
8. Usando un bisturi sterile, fai un'incisione di 0,3 cm verticalmente lungo il centro della testa per esporre il bregma del cranio.
   NOTA: Se si inietta dalla lambda, esporre la lambda del cranio anziché il bregma.
9. Utilizzare un applicatore sterile con punta di cotone per asciugare l'area.

3. Impostazione dell'iniettore stereotassico

1. Aspirare la soluzione di emoglobina preparata al punto 1.2 in una siringa sterile da 0,3 mL con un ago da 30 G e inserire la siringa nel sistema iniettore stereotassico.
   NOTA: Se si generano condizioni di controllo, aspirare una soluzione di CSF preparata al punto 1.1 in una siringa sterile da 0,3 mL e procedere con il protocollo.
2. Accendere l'interfaccia dell'iniettore stereotassico e fare clic sul pulsante Configurazione per inserire le impostazioni del volume e della velocità di iniezione.
   1. Fare clic su Volume e impostare il volume su 20.000 nL (20 μL).
   2. Fare clic su Velocità di infusione e impostare la velocità su 8.000 nL /min (8 μL/min).
3. Uscire dalla configurazione facendo clic sul pulsante Ripristina pos.
4. Lavare la punta dell'ago facendo clic sul pulsante Infondere fino a quando una piccola perla di soluzione di emoglobina emerge sulla punta dell'ago.
5. Estrarre delicatamente la soluzione di emoglobina dalla punta dell'ago con un applicatore sterile con punta di cotone.

4. Iniezione animale

1. Impostare il bregma come zero sul sistema iniettore stereotassico regolando le posizioni mediolaterale e anteroposteriore della siringa prima di abbassare la punta dell'ago della siringa lavata per toccare delicatamente il cranio in corrispondenza del bregma.
   NOTA: se si effettua l'iniezione dalla lambda, impostare lambda come zero.
2. Identificare le coordinate di scelta.
   1. Se si inietta dal bregma, nei ratti P4 qui descritti, utilizzare 1,5 mm lateralmente, 0,4 mm anteriormente e 2,0 mm di profondità dal bregma.
   2. Se si inietta dalla lambda, utilizzare le seguenti coordinate per i ratti P4: 1,1 mm lateralmente, 4,6 mm anteriormente e 3,3 mm di profondità dalla lambda.
3. Sollevare l'ago della siringa 1 cm sopra il cranio per liberare il cuoio capelluto. Quando la siringa è sollevata, procedere per impostare le coordinate mediolaterali e anteroposteriori.
4. Abbassare l'ago della siringa per toccare delicatamente il cranio. Controllare che l'ago tocchi il cranio.
5. Impostare la coordinata dorsoventrale su un periodo di 30 s.
   NOTA: Durante l'impostazione della coordinata dorsoventrale, l'ago forerà il cranio. Bisogna fare attenzione per assicurarsi che la siringa passi attraverso il cranio senza deformare il cranio. La deformazione del cranio viene evitata ritirando lentamente l'ago lungo la coordinata dorsoventrale se si verifica una deformazione, quindi riposizionando l'ago lungo la stessa traiettoria. Ciò consente all'ago di passare attraverso il foro nel cranio con meno forza e senza deformazioni.
6. Sull'interfaccia dell'iniettore stereotassico, fare clic sul pulsante Esegui per iniziare l'iniezione.
7. Al termine dell'iniezione, lasciare l'ago della siringa in posizione per 2 minuti per ridurre al minimo il riflusso della soluzione.
8. Prelevare lentamente la siringa lungo la coordinata dorsoventrale per 2 minuti fino a quando la punta dell'ago è 2 cm sopra il cuoio capelluto.
9. Ruotare il braccio dell'iniettore stereotassico lontano dal campo operatorio.

5. Cure postoperatorie

1. Chiudere il cuoio capelluto con una sutura monofilamento 6-0. Fai una semplice sutura interrotta al centro dell'incisione di 0,3 cm.
2. Rimuovere il cucciolo dall'anestesia e posizionarlo su un'area sicura sulla piastra elettrica.
3. Riportare il roditore nella gabbia di casa per riprendersi dall'anestesia sotto la cura della sua diga.
   NOTA: Il ritorno tempestivo alla cura della diga riduce la mortalità postoperatoria precoce.
4. Monitorare gli animali per l'anestesia con perdita del riflesso raddrizzante ogni ora dopo l'intervento chirurgico per 3 ore.
5. Monitorare gli animali ogni giorno per 7 giorni per la normale attività, l'assunzione di cibo e l'aumento di peso. Monitorare il sito di incisione per la guarigione delle ferite, la chiusura e la ricomparsa della pelliccia nel sito dell'intervento chirurgico.
   NOTA: Nel raro caso in cui si osservino cambiamenti neurologici come convulsioni, depressione centrale o diminuzione dell'appetito durante il monitoraggio, eutanasia l'animale usando perfusione intravascolare o lussazione cervicale in anestesia.
6. Per prevenire l'infezione una volta che la sutura è chiusa e la ferita sta guarendo, applicare un triplo antibiotico topico nel sito di incisione.

6. Acquisizione e quantificazione della risonanza magnetica

1. Eseguire la risonanza magnetica su uno scanner per piccoli animali 4.7T o 9.4T.
2. Ruotare la piastra riscaldante sull'impostazione media per mantenere la temperatura corporea del ratto.
3. Indurre l'anestesia in una camera utilizzando isoflurano al 3%.
   NOTA: Confermare un'anestesia sufficiente utilizzando la risposta punta / coda-pizzico ogni 15 minuti. Monitorare l'anestesia con l'osservazione visiva del colore dei tessuti, della temperatura corporea e della frequenza respiratoria.
4. Posizionare il ratto anestetizzato prono nella risonanza magnetica con il naso posizionato nell'adattatore per anestesia con un flusso costante di isoflurano all'1,5%.
5. Eseguire l'imaging pesato in T2 selezionando una sequenza di eco a rotazione rapida pesata in T2.
   1. Se si utilizza uno scanner MRI 4.7T, inserire i seguenti parametri nel software MRI: tempo di ripetizione = 3.000 ms, tempo di eco = 27,50 ms, numero di medie = 3, campo visivo = 18,0 mm x 18,0 mm, matrice = 128 x 128, numero di fette assiali = 24, spessore = 0,50 mm.
   2. Se si utilizza uno scanner MRI 9.4T, inserire i seguenti parametri nel software MRI: tempo di ripetizione = 5.000 ms, tempo di eco = 66,00 ms, spaziatura dell'eco = 16,50 ms, numero di medie = 2, ripetizioni = 1, fattore raro = 8, campo visivo = 16,0 mm x 16,0 mm, matrice = 256 x 256, numero di fette assiali = 32, spessore = 0,50 mm.
6. Fare clic sul pulsante Continua per avviare la sequenza.

7. Elaborazione e analisi delle immagini

1. Utilizzare dati nativi pesati in T2 per analizzare il volume del cervello. Utilizzare un software di segmentazione per delineare manualmente i ventricoli laterali⁶. Fare clic su Modalità pennello e selezionare lo stile del pennello quadrato . Regolare la dimensione del pennello su 1. Fate clic su Impostazioni layout (Layout inspector ) e selezionate la vista assiale. Fare clic su zoom per adattare. Posizionare il cursore sull'immagine; Traccia e riempi lo spazio del ventricolo laterale.
2. Clicca su Segmentazione nella barra degli strumenti | Volume e Statistiche per visualizzare i volumi segmentati.

Risultati

Il successo dell'iniezione è stato confermato con mezzi radiologici e immunoistochimici. Gli animali sottoposti a iniezione di emoglobina hanno sviluppato ventricolomegalia acuta moderata quando valutati tramite risonanza magnetica (Figura 2A), con ventricoli laterali significativamente più grandi a 24 ore e 72 ore dopo l'iniezione di emoglobina rispetto agli animali iniettati con aCSF (Figura 2B, C). Sebbene non vi sia stata alcuna differenza...

Discussione

Questo modello IVH che utilizza l'iniezione di emoglobina consente lo studio della patologia dell'IVH specificamente mediata dall'emoglobina. Per gli studi complementari, l'emoglobina può anche essere facilmente somministrata in vitro e non confonde i saggi biochimici per le proteine prodotte da microglia / macrofagi che sono presenti nel sangue intero.

Le principali teorie di IVH-PHH includono l'ostruzione meccanica della circolazione del liquido cerebrospinale, la rottura delle cig...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.3 mL insulin syringe	BD Microfine + Insulin Syringe	230-4533	0.3-0.5 mL synringes will work
1.5 mL microtube	USA Scientific	1615-5500	Lot No. K194642H -3 511
4.7T MRI	Agilent/Varian	4.7T/33 cm	Agilent/Varian DirectDrive 4.7-T (200-MHz) MRI system
6-0 monofilament suture	ETHICON	667G
9.4T MRI	Bruker	BioSpec 94/20	Used in this protocol without the cryoprobe
Analytical balance	CCURIS Instruments	W3200-320
Artificial CSF (aCSF)	Tocris Bioscience	3525	Batch No: 72A
Betadine	Purdue Products L.P.	301005-00	NDC 67618-150-09
Carprofen (injectable)	Zoetis Inc.	PI 4019448	Rimadyl
Ethanol	Decon Laboratories	2701
Heating pad	Sunbeam	E12107-819	UL 612A, Z-1228-001
Hemoglobin	MP Biomedicals	100714	LOT NO. SR02321
Isoflurane	Piramal Critical Care	NDC 66794-017-25
Isoflurane vaporizer	VETEQUIP	911103
Light for stereotactic insturment	Dolan-Jenner industries	Fiber-Lite MI-150
Microinjection syringe pump	World Precision Instruments	MICRO21	Serial 184034 T08K
MRI software	Bruker BioSpin	Paravision 360 3.2
Oxygen	Airgas Healthcare	UN1072	LOT NUMBER S1432080XA02
Sprague Dawley rats	Charles River Laboratories	Strain code: 001
Stereotactic instrument	KOPF Instuments	Model 900LS Lazy Susan
Sterile cotton tipped applicator	Fischerbrand	23-400-118
Surgical blade	covetrus	#10
Topical triple antibiotic	Triple Antibiotic Ointment	NDC 51672-2120-1
Ventricle volume quantification software	ITK-SNAP	ITK-SNAP 4.0.0 beta