分离大鼠脂肪组织间充质干细胞以分化为产生胰岛素的细胞

摘要

脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可能是分化为产生胰岛素的细胞（IPC）的MSCs的潜在来源。在该协议中，我们提供了用于分离和表征大鼠附睾Ad-MSCs的详细步骤，然后是用于从同一只大鼠Ad-MSC生成IPC的简单，简短的协议。

摘要

间充质干细胞（MSCs） - 特别是那些从脂肪组织（Ad-MSCs）中分离出来的干细胞 - 作为一种可再生的，丰富的干细胞来源而受到特别关注，不会引起任何伦理问题。然而，目前隔离Ad-MSC的方法并不标准化，并且采用需要特殊设备的复杂协议。我们使用一种简单，可重复的方法从Sprague-Dawley大鼠的附睾脂肪中分离出Ad-MSCs。分离的Ad-MSCs通常在分离后3天内出现，因为贴壁细胞显示成纤维细胞形态。这些细胞在分离后1周内达到80%的汇合度。之后，在第3-5代（P3-5），通过对特征性MSC分化簇（CD）表面标志物（如CD90，CD73和CD105）进行免疫表型分析，以及诱导这些细胞在成骨，脂肪和软骨成因谱系中的分化，对分离的Ad-MSCs进行全面表征。反过来，这意味着分离细胞的多能性。此外，我们通过结合高葡萄糖Dulbecco的改良鹰培养基（HG-DMEM），β-巯基乙醇，烟酰胺和exendin-4，通过简单，相对较短的方案诱导分离的Ad-MSCs向胰岛素产生细胞（IPC）谱系的分化。首先，通过测量特异性β细胞标志物（如MafA，NKX6.1，Pdx-1和Ins1）的表达水平以及生成的IPC的二噻酮染色，对IPCs进行遗传评估。其次，评估也通过葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）测定在功能上进行。总之，Ad-MSCs可以很容易地分离出来，表现出所有MSC表征标准，并且它们确实可以在实验室中为糖尿病研究提供丰富的可再生IPC来源。

引言

间充质干细胞（MSCs），也称为间充质基质细胞，是再生医学中使用最广泛的细胞类型之一^1，2。它们被归类为成体干细胞，其特征在于多系分化潜力和自我更新能力³。间充质干细胞可以从各种来源分离和获得，包括脂肪组织，骨髓，外周血，脐带组织和血液，毛囊和牙齿^4，5。

从脂肪组织中分离干细胞被认为既有吸引力又有希望，因为它们易于获取， 体外快速扩增和高产量⁶。脂肪组织来源的间充质干细胞（Ad-MSCs）可以从不同的物种中分离出来，例如人类，牛，小鼠，大鼠以及最近的山羊⁷。已经证明，Ad-MSCs现在是组织工程和基因/细胞治疗的潜在候选者，甚至可用于开发用于长期修复软组织损伤或缺陷的自体替代品^7，8。

国际细胞和基因治疗学会（ISCT）定义了MSC必须展示的三个最低标准，以进行完整的表征⁹。首先，它们必须是塑料粘附的。其次，间充质干细胞表面标志物（如 CD73、CD90 和 CD105）应表达，且缺乏造血标志物 CD45、CD34、CD14 或 CD11b、CD79α 或 CD19 以及 HLA-DR 的表达。最后，间充质细胞应表现出分化成三种间充质谱系的能力:脂肪细胞、骨细胞和软骨细胞。有趣的是，MSCs也可以分化成其他谱系，如神经元细胞，心肌细胞，肝细胞和上皮细胞^10，11。

事实上，间充质干细胞具有独特的性质，使它们能够作为潜在治疗剂应用于不同疾病的再生疗法中。间充质干细胞可以分泌可溶性因子以诱导免疫调节环境，从而提供治疗益处¹².此外，间充质干细胞可以向损伤部位和肿瘤微环境迁移以提供靶向治疗;然而，其机制尚未完全阐明¹³。此外，MSCs具有分泌外泌体的能力，外泌体是纳米级的细胞外囊泡，携带着大量非编码RNA，蛋白质和可溶性因子，最近成为MSCs在各种疾病中治疗潜力的新机制¹⁴。

更重要的是，间充质干细胞通过基因修饰^15，16或通过在体外培养基中利用各种外在诱导因子来分化成产生胰岛素的细胞（IPC）的潜力引起了显着的关注¹⁷。IPC诱导期差异很大，因为它取决于所使用的诱导方案和利用的外在因素。分化过程可持续数天至数月，需要外源性诱导因子的组合，这些因子必须在不同阶段添加和/或提取。许多用于内分泌胰腺分化的因子是生物活性化合物，已被证明可以促进胰岛素分泌β细胞的增殖或分化/新生和/或增加IPCs的胰岛素含量^{18，19，20，21}。值得注意的是，据报道，间充质干细胞还通过几种机制（包括其分泌组）以及广泛的免疫调节作用对糖尿病及其并发症具有治疗作用^22，23，24。

在该协议中，我们提出了一个详细的逐步协议，用于从大鼠附睾脂肪中分离和表征Ad-MSCs，然后是一个简单的，相对较短的协议，用于从Ad-MSC生成IPC。

研究方案

所有实验均根据批准的指南进行，所有程序均由埃及开罗英国大学药学院伦理委员会批准。Lopez和Spencer采用了Ad-MSC隔离协议，修改了¹⁵。

1. 从大鼠附睾脂肪垫中分离Ad-MSCs

1. 使用体重不超过1个月（每次隔离两次）的体重为250-300g的雄性Sprague-Dawley大鼠。麻醉动物，然后通过宫颈脱位对它们实施安乐死。用70%乙醇喷洒安乐死动物。切除腹部下部的皮肤和肌肉，然后拉出两个睾丸以暴露附睾脂肪垫。
2. 轻轻切开附睾脂肪垫，小心不要切开血管。
3. 分离附睾周围的脂肪组织，然后将其置于含有磷酸盐缓冲盐水（PBS）的培养皿中。
4. 在生物安全柜中，用镊子和手术刀将这些脂肪垫切成小块。将这些切割的脂肪组织块转移到含有10 mL无菌PBS的50 mL离心管中。
5. 每次用10毫升PBS清洗切碎的脂肪组织5次，以去除污染血液。必须仔细执行以下洗涤程序。
   1. 向组织中加入10毫升PBS，彻底混合45秒。然后，通过保持管静置5分钟以分离成两层，让组织通过重力沉降。
   2. 使用10ml注射器从摄取剂中抽吸PBS，并用新鲜的10mLPBS代替再次洗涤。
   3. 重复此洗涤步骤4-5次，直到PBS清除血液。这表明大部分（如果不是全部）血液被移除。
6. 洗涤后，将脂肪组织重悬于10mL胶原酶溶液（PBS中0.1%胶原酶1型）中。用副膜密封管，然后将其在振荡水浴（37°C，80rpm，45分钟）中孵育，直到组织几乎均匀。
   注意:避免组织的完全消化（当溶液变得完全均匀，所有组织残基/片段完全消失时），因为它会对之后的细胞培养产生不利影响。通常，消化需要30-45分钟。
7. 一旦胶原酶消化完成，涡旋管15秒，然后以300× g离心5分钟。再次涡旋管10秒，然后再次离心5分钟。然后观察三层。小心地丢弃油层，然后是水层，而不干扰基质血管分数（SVF）沉淀。
   注意:除去含有脂肪细胞的上清液和胶原酶溶液。首先，用10mL移液管去除脂肪细胞和随附的油层，以确保完全去除油滴，然后去除下面的水层。
8. 将管底部的SVF沉淀重悬于10mL无菌BSA溶液（1%白蛋白，PBS中的牛血清V级分溶液）中，然后将管以300× g离心5分钟。
9. 离心后，弃去上清液并将SVF沉淀悬浮在8.5 mL Ad-MSCs的完整培养基中（由Dulbecco的改良Eagle培养基/营养混合物F-12 [DMEM / F12]培养基组成，补充有10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺）。
10. 在37°C下5%CO^{2的25cm 2} 烧瓶中培养细胞_。 第二天，检查附着的细胞，取出悬浮的细胞，并更换培养基。之后，每隔一天更换一次媒体。
11. 每5-7天传代一次细胞，当它们使用胰蛋白酶-EDTA汇合80%-90%时。使用传代3-5之间的细胞进行本方案中描述的后续实验。 图1给出了所有隔离步骤的示意图。
    注意:通常，Trypisn-EDTA效力可能因不同的供应商而异，因此请尽量缩短胰蛋白酶消化的时间，以避免对细胞的毒性作用。

2. 使用流式细胞术分析通过免疫表型表征Ad-MSCs

1. 在第3代，使用胰蛋白酶- EDTA分裂细胞。用PBS洗涤2次，然后用血细胞计数器计数细胞。
2. 用小鼠抗大鼠CD90或CD105（间充质标志物）或CD34（造血标志物）用荧光素异硫氰酸酯（FITC）标记的单克隆抗体在4°C下在黑暗中孵育100，000个细胞20分钟。
3. 洗涤细胞并将其悬浮在500μLFACS缓冲液中。通过流式细胞术^{分析 25}.

3. 评估分离的Ad-MSCs在各种间充质谱系中的分化潜力

1. 脂肪性分化
   1. 将细胞重悬于完整的培养基中（如步骤1.9.中所述），然后在²⁴ 孔组织培养板中以3.7×10 4细胞/孔的密度培养细胞。在37°C的5%CO 2的加湿气氛中孵_育。接下来，每3天更换一次培养基，直到细胞达到几乎100%汇合，这通常需要3天。
   2. 当细胞达到所需的汇合度时，用脂肪分化培养基（由LG-DMEM培养基组成，补充有10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺与1x脂肪原性补充剂，与间充质干细胞功能鉴定试剂盒一起提供）替换增殖培养基以诱导脂肪发生。然后，每 3 天更换一次培养基（0.5 mL/孔）。小心轻柔地进行培养基更换，以免破坏脂质液泡。
   3. 21天后，通过显微镜检查脂质液泡外观和油红色染色来评估脂肪分化。
   4. 通过将30mg油红污渍溶解在10mL异丙醇中来制备油红储备溶液，然后在室温下保持至少20分钟。之后，通过将3份储备溶液与2份双蒸馏水（ddH₂O）混合来制备工作溶液，充分混合，并在室温下保持10分钟，然后用滤纸过滤。
   5. 为了记录脂肪分化，用PBS洗涤细胞2次，然后使用中性缓冲福尔马林10%（0.75ml / well）固定它们15分钟。之后，使用1mL /孔用PBS洗涤细胞2次，每次将细胞孵育5分钟。在添加油红色工作溶液之前，完全吸出PBS非常重要。
   6. 最后一次洗涤后，将油红色工作溶液加入细胞中，并在37°C下孵育60分钟。 然后，取出污渍溶液，并用PBS轻轻洗涤细胞2次。在显微镜下观察染色的脂滴。
2. 成骨分化
   1. 将7.4×10³ 细胞/孔（0.5mL培养基/孔）接种在24孔板中，并在37°C的5%CO₂ 的加湿气氛中孵育3天（如步骤1.9所述）以达到近70%汇合度。
   2. 用LG-DMEM培养基中用成骨补充剂（随试剂盒提供）诱导细胞，该培养基补充了10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺。
   3. 继续成骨诱导21天，每3天更换一次分化培养基。
   4. 将200mg茜素红S染色剂溶解在9mL ddH₂O中，然后使用氢氧化铵和HCl调节pH值至4.1-4.3，制备茜素红S染色剂的工作溶液。接下来，将体积按ddH 2 O增加到₁₀mL。在此之后，使用滤纸过滤除去任何沉淀物。
   5. 用PBS洗涤细胞2次，然后用10%缓冲福尔马林（0.75mL /孔）固定它们15分钟。然后，使用PBS（1 mL /孔）洗涤细胞2次。每次，将细胞孵育5分钟。
   6. 将固定细胞与制备的2%茜素- 红S溶液在37°C培养箱中孵育30分钟。
   7. 之后，取出染色液，用ddH 2 O洗涤细胞₂次，用PBS洗涤一次，然后观察染色的富含钙的细胞外基质，在显微镜下评估成骨分化。
3. 软骨分化
   1. 将7.4×10³ 个细胞/孔（0.5mL培养基/孔）接种在24孔板中，并在37°C的5%CO₂ 的加湿气氛中孵育3天（如步骤1.9中所述）以达到近70%汇合度。
   2. 当达到所需的汇合度时，用含有胰岛素 - 转铁蛋白硒（ITS），软骨原补充剂（随试剂盒提供），100 U / mL青霉素，100μg / mL链霉素，0.25μg / mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺²¹的无血清DMEM / F12诱导细胞的软骨分化。
   3. 将细胞与软骨培养基孵育21天，同时每3天更换一次软骨分化培养基。
   4. 制备Alcian Blue 8GX污渍的工作溶液如下:首先，在ddH₂O中加入3 mL冰醋酸至97 mL ddH₂O，制备3%冰醋酸溶液。然后，通过将0.1g与100mL的3%冰酸溶液混合来制备Alcian Blue 8GX污渍的工作溶液，并使用滤纸过滤除去任何沉淀物。
   5. 用PBS洗涤细胞2次，然后用10%缓冲福尔马林（0.75mL /孔）固定它们15分钟。然后，使用PBS（1 mL /孔）洗涤细胞2次。每次，将细胞孵育5分钟。
   6. 下一步是将细胞在制备的0.1%Alcian Blue 8GX染色剂中在3%冰醋酸中在37°C下孵育60分钟。 用ddH 2 O洗涤染色的细胞₂次，用PBS洗涤一次，然后在显微镜下观察染色的硫酸化蛋白聚糖。

4. 将AD-MSC区分为IPC

1. 在第3段中，使用胰蛋白酶-EDTA分离Ad-MSCs。首先，除去培养基，然后在仍然附着在培养瓶中的细胞时用5 mL PBS洗涤细胞。接下来，将5mL胰蛋白酶- EDTA加入75cm² 烧瓶中，并在37°C下孵育3-10分钟。
   注意:尝试在早期传代诱导细胞，通常在P3-P5之间，因为晚期传代对细胞的性质和分化能力产生不利影响^17，24。
2. 之后，检查细胞是否脱离和单细胞悬浮液。向烧瓶中加入5 mL完整的DMEM / F12培养基以抑制胰蛋白酶的作用。收集细胞悬浮液并将其转移到15 mL试管中，然后将另外5 mL完整的DMEM / F12培养基加入试管中。
3. 将细胞以300×g离心2分钟以沉淀细胞。
4. 用PBS洗涤细胞一次，再次以300×g离心2分钟，然后将细胞沉淀重悬于3-5mL完整的DMEM / F12培养基中。
5. 使用台盼蓝排除染料和血细胞计数器计数细胞。
6. 然后，将细胞接种在6孔板（1 x 10⁶ 细胞/板）和12孔板（用于GSIS测定;1 x 10⁶ 细胞/板）中，并在37°C，5%CO₂ 培养箱中孵育3天，以达到近90%汇合度。
7. 在诱导当天，除去培养基，用PBS洗涤细胞，然后通过预诱导介质（DMEM / F12补充10%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺，10mM烟酰胺[NA]和1mM β-巯基乙醇[β-ME]）预诱导细胞2天。
8. 使用高葡萄糖DMEM（HG-DMEM，4.5g / L葡萄糖）再诱导细胞1天，并补充2.5%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺，10mM NA和1mM β巯基乙醇。在此阶段结束时收集细胞沉淀（在本方案中指定为D3细胞）。
9. 将细胞在由HG-DMEM组成的最终分化诱导培养基中再孵育7天，该诱导培养基补充了2.5%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B，2mM L-谷氨酰胺，10mM β-巯基乙醇和10nM exendin-4。
10. 在指定期限结束时，收集细胞沉淀（在本方案中称为Final），并通过DTZ染色和GSIS测定评估细胞的成功分化，如本方案所示。
11. 按照下文第5步和第6步评估生成的IPC。

5. 二噻酮染色

1. 制备二硫宗（DTZ）染色储备溶液如下:将25mg DTZ完全溶解在2.5mL二甲基亚砜（DMSO）中，分成等分试样，并在-20°C下在黑暗中储存直至使用。
2. 对于染色，通过将储备溶液稀释在完全培养基中（HG-DMEM补充5%FBS，100 U / mL青霉素，100μg/ mL链霉素，0.25μg/ mL两性霉素B和2mM L-谷氨酰胺）来制备工作溶液1:100（体积/体积）。然后，通过0.2μm注射器过滤器过滤工作溶液。
3. 接下来，对于指定的DTZ染色培养细胞在6孔板中，并在抽吸培养基后，用PBS洗涤细胞一次，然后将2mL DTZ工作溶液加入每个孔中。在CO 2培养箱中在37°C下孵育至少₂ 小时。
4. 用PBS小心地洗涤细胞2次。最后一次洗涤后，向每个孔中加入2 mL PBS。然后，在倒置显微镜下观察深红色染色的IPC。使用最初在完全生长培养基（10% FBS - DMEM/F12）中培养的未诱导的Ad-MSCs作为对照。

6. RT-qPCR对β细胞标记物的基因表达

1. 核糖核酸提取
   1. 分化后，收集细胞沉淀并将其储存在-80°C直至使用。将每个细胞沉淀（来自一个6孔板的六个孔池）悬浮在1mL硫氰酸胍RNA提取试剂中，在1.5mL无核酸酶管中，同时上下移液几次。将裂解的样品在室温下孵育5分钟，以允许核蛋白复合物的完全解离。
   2. 每1 mL RNA提取试剂加入200μL氯仿，并牢固地盖住管，用手剧烈摇动15秒。接下来，在室温下孵育3分钟。
   3. 将样品在4°C下以13，800× g 离心15分钟。 这将导致混合物分离成下氯仿相，间相和无色上层水相，RNA保留在水相中。
   4. 将上层水相放入新管中，同时小心避免接触相间。
   5. 向水相（1:1体积）中加入600μL100%异丙醇，然后通过倒置25次彻底混合样品，并在室温下孵育10分钟。
   6. 将样品在4°C下以18，800× g 离心30分钟。 沉淀的RNA在管侧形成一个小的凝胶状沉淀。
   7. 除去上清液并用1mL 80%冰冷乙醇洗涤沉淀。加入乙醇后，缓慢进行RNA沉淀的多次移液10秒。
   8. 在4°C下以9，600× g 离心样品5分钟。 弃去上清液，让RNA沉淀风干5-10分钟。
   9. 干燥后，通过将RNA沉淀上下移液几次，将RNA沉淀溶解在25-100μL无RNase水（根据初始沉淀尺寸）中，直到在1.5mL无核酸酶管中完全溶解。避免RNA沉淀过度干燥。
      注意:通常，颗粒在干燥时会变得透明。但是，一旦透明，立即重悬，以避免颗粒过度干燥。
   10. 通过使用无核酸酶水作为空白，通过测定260nm和280nm处的光密度（OD）来定量RNA。
   11. 确保样品的OD260/OD280 = 1.8-2.0。
2. 中密度脂腺苷酸合成
   1. 使用cDNA合成试剂盒从分离的总RNA中合成cDNA。
   2. 根据制造商的说明进行cDNA合成反应。在200μL PCR管中，向 表1所示的反应主混液中加入含有0.5μg总RNA的RNA溶液。
   3. 将RNA加入预混液后，通过50°C的循环程序进入混合物30分钟，持续一个循环，然后使用热循环仪将95°C的灭活循环2分钟。
   4. 使用无核酸酶的水将cDNA稀释至终浓度为2ng / μL，储存在-20°C以进行后续RT-qPCR。
3. 使用 SYBR 绿色预混液的 RT-qPCR
   1. 根据 表2所示的反应混合物，使用cDNA模板对每个靶基因进行RT-qPCR反应。一式三份完成所有措施。
   2. 所用引物组如 表3所示。在冰上执行所有RT-qPCR程序。
   3. 使用实时荧光定量 PCR 机器在默认程序设置下进行 RT-qPCR 反应。热循环条件包括95°C的初始变性10分钟，然后是45次变性循环（95°C，15秒）和组合退火/延伸（60°C，1分钟）。
   4. 根据^2-ΔΔCt测定C_t值并检测表达水平，β-肌动蛋白作为内部对照。

cDNA合成预混液	体积（μl）
5x cDNA合成缓冲液	4
断续器	2
核糖核酸引物	1
反梭酶混合物	1
RT 增强剂	1
无核酸酶水	变量
总核糖核酸	变量
总反应量	20

表1:cDNA合成预混液体积。

RT-qPCR 反应混合物	体积（μl）	最终浓度在 10 μL 中
断续器	2	2 纳克/孔
RT-qPCR 正向引物 （3 μM）	1	300 海里
RT-qPCR 反向引物 （3 μM）	1	300 海里
无核酸酶水	1	-------
2x 海上省绿色预混液	5	1 倍
总反应体积	10

表2:RT-qPCR反应混合物。

基因	前向引物	反向底漆
狐狸2	嘎嘎	ATGTTGCCGACCACACTG
PDX-1	ATCCACCTCCCGGACCTTTC	CCTCCTTCTGCTGGT
NKX6.1	ACACCAGACCCACATTCTCCG	ATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
马法	TTCAGCAAGGAGGAGGTCAT	CCGCCAACTTCTCGTATTTC
Ins-1	CACCTTTTGTGGTCCTCACCT	CTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-肌动蛋白	TGGAGAAGATTTGGCACCAC	AACACAGCCTGGATGGCTAC

表3:正向和反向引物序列。

7. 葡萄糖刺激的胰岛素分泌

1. 克雷布林格碳酸氢盐（KRB）缓冲液的制备
   1. 制备克雷布的林格碳酸氢盐（KRB）缓冲溶液，同时使用2mM葡萄糖（低葡萄糖）和20mM葡萄糖（高葡萄糖）浓度进行葡萄糖刺激胰岛素分泌（GSIS）测定。用于制备KRB缓冲液的组分如 表4所示。
   2. 使用1 N HCl将缓冲液的pH值调节至约7.25-7.35（即，比所需pH 7.4低0.1-0.2个单位，因为它在过滤过程中可能会上升）。
   3. 以0.1%（重量/体积）的浓度新鲜加入牛血清白蛋白（BSA）。
   4. 之后加入葡萄糖（18mg用于50 mL KRB以制备2 mM低葡萄糖KRB缓冲液，180mg用于50 mL KRB以制备20 mM高葡萄糖KRB缓冲液）。
   5. 通过0.2μm注射器过滤器过滤，对制备的LG和HG KRB缓冲液进行灭菌，为GSIS测定做好准备。
2. GSIS 检测
   1. 最初在12孔细胞培养板中接种1 x 10⁵ 个细胞/孔，并使用完全相同的分化诱导方案诱导这些细胞。
   2. 在诱导方案结束时，用PBS轻轻清洗生成的IPC（板中）2次，用LG-KRB清洗一次。
   3. 然后，用300μLLG-KRB /孔孵育IPC1小时，然后丢弃该缓冲液。
   4. 接下来，将IPC与300μL的2mM（LG）或20mM（HG）KRB缓冲液一起孵育1小时。在潜伏期结束时，收集上清液并储存在-80°C，以便使用商业ELISA试剂盒并按照制造商的说明进行随后的分泌胰岛素测定。
      注意:在进行GSIS测定时，在抽吸或添加PBS和KRB缓冲液时，尽量尽可能温和。

元件	浓度
氯化镁（无水）	0.0468克/升
氯化钾	0.34 克/升
氯化钠	7.00 克/升
磷酸氢钠（无水）	0.1 克/升
磷酸钠单碱性（无水）	0.18 克/升
碳酸氢钠	1.26 克/升
氯化钙	0.2997克/升

表4:用于KRB缓冲液制备的组分。

8. 统计分析

1. 将所有数据表示为平均值±平均值的标准误差（SEM）。所有比较都是使用单因素方差分析（ANOVA）和Tukey使用统计软件的事后检验完成的。p 值 **p ≤ 0.01 且 *p ≤ 0.05 的结果被认为具有统计学意义。

结果

Ad-MSC 的隔离和表征
如图 2所示，从脂肪组织中分离的细胞从分离的第二天开始显示出圆形和成纤维细胞样细胞的异质群体（图2A）。分离后4天，成纤维细胞的数量和大小开始增加，并通过第1代作为同质群体生长（图2B，C）。这些细胞继续作为塑性贴壁的成纤维细胞生长，如图3所示，满足MSC特征的第一...

讨论

在该协议中，我们设法提出了从大鼠附睾脂肪中分离Ad-MSCs的详细方案，并将这些Ad-MSC分化为IPC。事实上，大鼠附睾脂肪是用于获得Ad-MSCs的易于获得的脂肪组织来源，并且不需要任何特殊设备，无论是用于收集还是用于处理^15，26，27。分离的Ad-MSCs表现出优异的培养扩增，并表现出所有被定义为MSC的标准。所使用的协议先前进行...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin, bovine serum Fraction V	MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, USA	A3157
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich, USA	A5533
Ammonium hydroxide	Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC	Stem Cell Technologies	60024FI
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A3912
Calcium Chloride	Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	PA5-85917
Chloroform	Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder	Gibco, Thermo Fisher, USA	17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure	Fisher Scientific, Germany	G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific, Germany	BP231-100
Dithizone staining	Sigma-Aldrich, USA	D5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/L	Lonza, Switzerland	12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/L	Lonza, Switzerland	12-707F
DMEM/F12 medium	Lonza, Switzerland	BE12-719F
DNAse/RNAse free water	Gibco Thermo Fisher, USA	10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade	Sigma-Aldrich, Germany	24103
Exendin-4	Sigma-Aldrich, Germany	E7144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Thermo Fisher, Brazil	10270-106
Formaldehyde 37%	Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade	Fisher Scientific, USA	BP2618500
L-Glutamine	Gibco Thermo Fisher, USA	25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit	R&D systems Inc., MN, USA	SC006
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Germany	N0636
Oil Red Stain	Sigma-Aldrich, USA	O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin	Gibco Thermo Fisher, USA	15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg	Lonza, Switzerland	BE17-516F
Potassium Chloride	Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit	Cloud-Clone Corp., USA	CEA682Ra
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima	Thermo Scientific, USA	K0221
Syringe filter, 0.2 micron	Corning, USA	431224
TRIzol	Thermo Scientific, USA	15596026
Trypan blue	Gibco Thermo Fisher, USA	15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X	Lonza, Switzerland	CC-5012
Verso cDNA synthesis kit	Thermo Scientific, USA	AB-1453/A
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich, Germany	M3148