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要約

脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、インスリン産生細胞(IPC)に分化するMSCの潜在的な供給源となり得る。このプロトコルでは、ラット精巣上体Ad-MSCの単離と特性評価のための詳細な手順を提供し、続いて同じラットAd-MSCからIPCを生成するためのシンプルで短いプロトコルを提供します。

要約

間葉系幹細胞(MSC)、特に脂肪組織から単離されたもの(Ad-MSC)は、倫理的懸念をもたらさない再生可能で豊富な幹細胞源として特に注目されています。しかし、Ad-MSCを分離する現在の方法は標準化されておらず、特別な機器を必要とする複雑なプロトコルを採用しています。我々は、単純で再現可能な方法を用いて、Sprague-Dawleyラットの精巣上体脂肪からAd-MSCを単離した。単離されたAd-MSCは、通常、接着細胞が線維芽細胞性形態を示すため、単離後3日以内に現れる。これらの細胞は、単離後1週間以内に80%のコンフルエントに達する。その後、継代3-5(P3-5)で、CD90、CD73、およびCD105などの特徴的なMSC分化クラスター(CD)表面マーカーに対するイムノフェノタイピングによる単離Ad-MSCの完全な特性評価を行い、これらの細胞を骨形成、脂肪形成、および軟骨形成系統に分化誘導した。これは、次に、単離された細胞の多能性を意味する。さらに、我々は、高グルコースダルベッコ改変イーグル培地(HG-DMEM)、β-メルカプトエタノール、ニコチンアミド、およびエキセンディン-4を組み込むことによって、単純で比較的短いプロトコールを介して、単離されたAd-MSCをインスリン産生細胞(IPC)系統に向けて誘導した。IPCの分化は、まず、MafA、NKX6.1、Pdx-1、およびIns1などの特異的β細胞マーカーの発現レベルを測定すること、ならびに生成されたIPCに対するジチゾン染色を介して遺伝的に評価された。第二に、評価はグルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイによっても機能的に実施された。結論として、Ad-MSCは容易に分離でき、すべてのMSC特性評価基準を示し、糖尿病研究のための実験室で豊富で再生可能なIPC源を提供することができます。

概要

間葉系幹細胞(MSC)は、間葉系間質細胞としても知られており、再生医療に最も広く使用されている細胞型の1つです1,2。それらは成体幹細胞に分類され、多系統分化能と自己複製能によって特徴付けられる3。MSCは、脂肪組織、骨髄、末梢血、臍帯組織および血液、毛包、および歯を含む様々な供給源から単離および得ることができる4,5。

脂肪組織からの幹細胞の単離は、その容易なアクセス、インビトロでの急速な拡大、および高収率のために、魅力的で有望であると考えられている6。脂肪組織由来間葉系幹細胞(Ad−MSC)は、ヒト、ウシ、マウス、ラット、およびより最近ではヤギなどの異なる種から単離することができる7。Ad-MSCは現在、組織工学および遺伝子/細胞療法の潜在的な候補であり、軟部組織の損傷または欠損の長期修復のための自家的代替手段を開発するためにも使用できることが証明されています7,8。

国際細胞遺伝子治療学会(ISCT)は、完全な特性評価のためにMSCが示さなければならない3つの最小基準を定義しています9。まず、それらはプラスチックに付着していなければなりません。第二に、MSCは、CD73、CD90、およびCD105などの間葉系幹細胞表面マーカーを発現し、造血マーカーCD45、CD34、CD14またはCD11b、CD79αまたはCD19、およびHLA-DRの発現を欠いている。最後に、MSCは、脂肪細胞、骨細胞、および軟骨細胞の3つの間葉系譜に分化する能力を示すべきである。興味深いことに、MSCはまた、神経細胞、心筋細胞、肝細胞、および上皮細胞などの他の系統に分化することができる10,11。

実際、MSCは、さまざまな疾患の再生治療における潜在的な治療薬として適用することを可能にするユニークな特性を持っています。MSCsは可溶性因子を分泌して、治療上の利益をもたらす免疫調節環境を誘導することができる12。さらに、MSCは、標的療法を提供するために、傷害部位および腫瘍微小環境に移行することができる。しかし、そのメカニズムは完全には解明されていない13。さらに、MSCは、エキソソーム、非コードRNA、タンパク質、および可溶性因子の積み荷を運ぶナノスケールの細胞外小胞を分泌する能力を有し、これは最近、様々な疾患におけるMSCの治療可能性の新規メカニズムとして浮上した14。

さらに重要なことに、MSCは、遺伝子改変15,16によって、またはin vitro17培養培地中の様々な外因性誘導因子を利用することによって、インスリン産生細胞(IPC)に分化する可能性について顕著な注目を集めている。IPC誘導期間は、使用される誘導プロトコルおよび使用される外因性因子に依存するため、大きく異なる。分化のプロセスは数日から数ヶ月続くことがあり、異なる段階で追加および/または撤回しなければならない外因性誘導因子の組み合わせを必要とする。内分泌膵臓分化に使用されているこれらの因子の多くは、インスリン分泌β細胞の増殖または分化/新生を促進し、および/またはIPCsのインスリン含量を増加させることが示されている生物学的に活性な化合物である18、19、20、21。MSCsは、セクレトームを含むいくつかのメカニズム、ならびに幅広い免疫調節作用を介して糖尿病およびその合併症において治療効果を有することがここでも報告されていることは注目に値する22,23,24。

このプロトコルでは、ラット精巣上体脂肪からのAd-MSCの単離および特性評価のための詳細な段階的プロトコルを提示し、続いてAd-MSCsからのIPCの生成のための単純で比較的短いプロトコルを提示する。

プロトコル

すべての実験は承認されたガイドラインに従って実施され、すべての手順はエジプトのカイロにあるエジプトの英国大学(BUE)の薬学部の倫理委員会によって承認されました。Ad-MSC分離プロトコルは、ロペスとスペンサーから採用され、修正15が加えられました。

1. ラット精巣上体脂肪パッドからのAd-MSCの単離

  1. 生後1ヶ月以下の体重250〜300gの雄のSprague-Dawleyラットを使用してください(隔離ごとに2匹)。動物を麻酔し、子宮頸部脱臼によってそれらを安楽死させる。安楽死させた動物に70%エタノールをスプレーする。腹部の下部の皮膚と筋肉を切除し、2つの精巣を引き抜いて精巣上体脂肪パッドを露出させます。
  2. 精巣上体脂肪パッドをやさしくカットし、血管を切らないように注意してください。
  3. 精巣上体を囲む脂肪組織を単離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)を含むシャーレに入れる。
  4. バイオセーフティキャビネットで、鉗子とメスを使用してこれらの脂肪パッドを小片に切ります。これらの切断した脂肪組織片を、10mLの滅菌PBSを含む50mL遠沈管に移す。
  5. ミンチした脂肪組織を毎回10mLのPBSで5回洗浄し、汚染された血液を除去した。以下の洗浄手順は細心の注意を払って行わなければなりません。
    1. 10mLのPBSを組織に加え、45秒間十分に混合する。次に、チューブを5分間放置して2つの層に分離することにより、組織が重力を介して沈降するのを許します。
    2. 10mlシリンジを使用してインフラタントからPBSを吸引し、別の洗浄のために新鮮な10mLのPBSと交換する。
    3. PBSの血液がきれいになるまで、この洗浄ステップを4〜5回繰り返します。これは、すべてではないにしても、ほとんどの血液が除去されることを示しています。
  6. 洗浄後、脂肪組織を10 mLのコラゲナーゼ溶液(PBS中の0.1%コラゲナーゼ1型)に再懸濁する。チューブをパラフィルムでしっかりと密封し、次いで組織がほぼ均質になるまで振とう水浴(37°C、80rpm、45分間)中でインキュベートする。
    注:組織の完全な消化(溶液が完全に均質になり、すべての組織残留物/片が完全に消失した場合)は、その後の細胞の培養に悪影響を及ぼすため、避けてください。通常、消化には30〜45分かかります。
  7. コラゲナーゼ消化が完了したら、チューブを15秒間渦巻き、次に300 x gで5分間遠心分離 します。チューブを再び10秒間渦巻き、続いてさらに5分間遠心分離を行った。その後、3つの層が観察されます。油層を注意深く廃棄し、続いて水層を、間質血管画分(SVF)ペレットを乱すことなく廃棄する。
    注:脂肪細胞を含む上清とコラゲナーゼ溶液を除去する。まず、脂肪細胞および付随する油層を10mLピペットで除去して油滴を完全に除去し、次いでその下の水層を除去する。
  8. チューブの底部にあるSVFペレットを滅菌BSA溶液(1%アルブミン、PBS中のウシ血清フラクションV溶液)10mLに再懸濁し、次いでチューブを300 x gで5分間遠心分離する。
  9. 遠心分離後、上清を捨て、SVFペレットをAd-MSC用の8.5mLの完全培地(10%FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミンを添加したダルベッコの改変イーグル培地/栄養混合物F-12[DMEM/F12]培地で構成)に懸濁します。
  10. 細胞を25cm2フラスコ中で培養し、5%CO2 下37°Cで培養する。 翌日、付着した細胞を確認し、浮遊細胞を取り出し、培地を交換してください。その後、1日おきにメディアを交換してください。
  11. 細胞が80%〜90%コンフルエントである場合には、トリプシン-EDTAを用いて5〜7日ごとに細胞を継代する。継代3〜5の間の細胞を、このプロトコールに記載される後続の実験に使用する。すべての絶縁ステップの概略図を 図1に示します。
    注:通常、トリピス-EDTAの効力はサプライヤーによって異なる可能性があるため、細胞への毒性作用を避けるためにトリプシン処理の時間を最小限に抑えるようにしてください。

2. フローサイトメトリー解析を用いたイムノフェノタイピングによるAd-MSCのキャラクタリゼーション

  1. 継代3で、トリプシン-EDTAを用いて細胞を分裂させた。PBSで2回洗浄し、血球計数器で細胞を計数する。
  2. 100,000個の細胞を、フルオレセイン−イソチオシアネート(FITC)で標識したマウス抗ラットCD90またはCD105(間葉系マーカー)またはCD34(造血マーカー)モノクローナル抗体のいずれかと共に暗所で4°Cで20分間インキュベートする。
  3. 細胞を洗浄し、500 μLのFACSバッファーに懸濁します。フローサイトメトリー25により分析する。

3. 単離されたAd-MSCの様々な間葉系への分化能の評価

  1. 脂肪原性分化
    1. 細胞を完全な培地に再懸濁し(ステップ1.9に記載)、次いで、24 ウェル組織培養プレート中で3.7 x 104細胞/ウェルの密度で細胞を培養する。5%CO2の加湿雰囲気中37°Cでインキュベートする。次に、細胞がほぼ100%コンフルエントに達するまで3日ごとに培地を交換しますが、通常は3日かかります。
    2. 細胞が所望のコンフルエントに達したら、増殖培地を脂肪生成分化培地(10%FBS、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミンを1x脂肪生成サプリメントで添加したLG-DMEM培地からなる)と交換し、間葉系幹細胞機能識別キットを付属する。その後、3 日ごとに培地を交換します (0.5 mL/ウェル)。脂質液胞を乱さないように培地交換を穏やかに行うように注意してください。
    3. 21日後、脂質液胞外観の顕微鏡検査およびオイルレッド染色により脂肪生成分化を評価した。
    4. オイルレッド染み30mgをイソプロパノール10mLに溶解してオイルレッドの原液を調製し、室温で少なくとも20分間保持する。その後、原液3部と二重蒸留水2部(ddH2O)を混合して作業液を調製し、よく混合し、室温で10分間保持した後、ろ紙でろ過する。
    5. 脂肪分化を文書化するには、細胞をPBSで2回洗浄し、中性緩衝ホルマリン10%(0.75ml/ウェル)を使用して15分間固定します。その後、1mL/ウェルを用いてPBSで細胞を2回洗浄し、毎回5分間インキュベートする。オイルレッドの作業溶液を追加する前に、PBSを完全に吸引することが重要です。
    6. 最後の洗浄後、オイルレッド作業溶液を細胞に加え、37°Cで60分間インキュベートします。 その後、染色液を除去し、PBSで細胞を2回穏やかに洗浄する。染色された脂肪滴を顕微鏡下で観察する。
  2. 骨形成分化
    1. 24ウェルプレートに7.4 x103 細胞/ウェル(0.5 mL培地/ウェル)をシードし、それらを完全培地(ステップ1.9に記載)中の5%CO2 の加湿雰囲気中で37°Cで3日間インキュベートし、ほぼ70%コンフルエントに達する。
    2. 10% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B、および 2 mM L-グルタミンを添加した LG-DMEM 培地で、骨形成サプリメント (キットに付属) で細胞を誘導します。
    3. 骨形成誘導を21日間継続し、3日ごとに分化培地を交換した。
    4. アリザリンレッドS染色剤200mgを9mLのddH2Oに溶解してアリザリンレッドS染色剤の作業液を調製し、水酸化アンモニウムおよびHClを用いてpHを4.1〜4.3に調整する。次に、ddH2Oで体積を10mLに構成する。これに続いて、ろ紙を用いた濾過により析出物を除去した。
    5. 細胞をPBSで2回洗浄し、10%緩衝ホルマリン(0.75mL/ウェル)を使用して15分間固定します。その後、PBS(1mL/ウェル)を用いて細胞を2回洗浄する。毎回、細胞を5分間インキュベートする。
    6. 固定細胞を調製した2%アリザリン-Red S溶液と共に37°Cのインキュベーター内で30分間インキュベートする。
    7. その後、染色液を除去し、細胞をddH2Oで2回、PBSで1回洗浄した後、染色したカルシウムリッチ細胞外マトリックスを観察し、顕微鏡下で骨形成分化を評価した。
  3. 軟骨形成分化
    1. 24ウェルプレートに7.4 x103 細胞/ウェル(0.5 mL培地/ウェル)をシードし、これらを完全培地(ステップ1.9に記載)中の5%CO2 の加湿雰囲気中で37°Cで3日間インキュベートし、ほぼ70%コンフルエントに達する。
    2. 所望のコンフルエントに達したら、インスリントランスフェリンセレン(ITS)、軟骨形成サプリメント(キット付属)、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミン21を含む無血清DMEM/F12を用いて細胞の軟骨形成分化を誘導する。
    3. 細胞を軟骨形成培地と共に21日間インキュベートし、3日ごとに軟骨形成分化培地を交換した。
    4. アルシアンブルー8GX染色剤の作業溶液を以下のように調製する:まず、97mLのddH2Oに3mLの氷酢酸を加えてddH2O中の3%氷酢酸溶液を調製する。次いで、100 mLの3%氷酸溶液に0.1 gを混合してアルシアンブルー8GX染色剤の作業溶液を調製し、ろ紙を用いた濾過により析出物を全て除去した。
    5. 細胞をPBSで2回洗浄し、10%緩衝ホルマリン(0.75mL/ウェル)を使用して15分間固定します。その後、PBS(1mL/ウェル)を用いて細胞を2回洗浄する。毎回、細胞を5分間インキュベートする。
    6. 次のステップは、調製した0.1%アルシアンブルー8GX染色剤中の細胞を3%氷酢酸中で37°Cで60分間インキュベートすることである。 染色した細胞をddH2Oで2回、PBSで1回洗浄し、染色した硫酸化プロテオグリカンを顕微鏡下で観察した。

4. アドMSCとIPCの差別化

  1. 継代3で、トリプシン-EDTAを用いてAd-MSCを分割する。まず、培地を除去し、次いで、培養フラスコに付着したまま細胞を5mLのPBSで洗浄する。次に、5mLのトリプシン-EDTAを75cm2フラスコに加え、37°Cで3〜10分間インキュベートする。
    注:遅い継代は細胞の性質および分化能力に悪影響を及ぼすので、早期継代、通常はP3〜P5の間に細胞を誘導してみてください17,24。
  2. その後、細胞が剥離していないか、および単一細胞懸濁液であるかを検査する。5mLの完全DMEM/F12培地をフラスコに加え、トリプシン作用を阻害する。細胞懸濁液を集めて15 mLチューブに移し、さらに5 mLのDMEM/F12培地をチューブに加えます。
  3. 細胞を300 x gで2分間遠心分離し、細胞をペレット化する。
  4. PBSで細胞を一度洗浄し、300 x gで2分間再び遠心分離し、細胞ペレットを3〜5mLの完全DMEM/F12培地に再懸濁した。
  5. トリパンブルー排除色素および血球計数器を用いて細胞を計数する。
  6. 次いで、細胞を6ウェルプレート(1 x 106細胞/プレート)および12ウェルプレート(GSISアッセイ用;1 x106細胞/プレート)に播種し、37°C、5%CO2インキュベーター内で完全培地(ステップ1.9に記載)中で3日間インキュベートし、ほぼ90%コンフルエントに達する。
  7. 誘導当日に、培地を取り出し、PBSで細胞を洗浄した後、誘導前培地(10%FBSを添加したDMEM/F12、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、2mM L-グルタミン、10mMニコチンアミド[NA]、および1mM β-メルカプトエタノール[β-ME])により、細胞を2日間前誘導する。
  8. 2.5% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B、2 mM L-グルタミン、10 mM NA、および 1mM β-メルカプトエタノールを添加した高グルコース DMEM(HG-DMEM、4.5g/L グルコース) を使用して、さらに 1 日間細胞を誘導します。この段階の終わりに細胞ペレットを採取する(このプロトコルではD3細胞と指定)。
  9. 2.5% FBS、100 U/mL ペニシリン、100 μg/mL ストレプトマイシン、0.25 μg/mL アンホテリシン B、2 mM L-グルタミン、10 mM NA、1mM β-メルカプトエタノール、および 10 nM エキセンディン-4 を添加した HG-DMEM からなる最終分化誘導培地で、細胞をさらに 7 日間インキュベートします。
  10. 指定された期間の終わりに、細胞ペレット(このプロトコールではFinalと命名)を収集し、DTZ染色およびGSISアッセイによって細胞の分化の成功を評価する。
  11. 生成された IPC を評価するには、以下の手順 5 と 6 に従います。

5. ジチゾン染色

  1. ジチゾン(DTZ)染色ストック溶液を以下のように調製する:25mgのDTZを2.5mLのジメチルスルホキシド(DMSO)に完全に溶解させ、アリコートに分割し、使用時まで暗所で−20°Cで保存する。
  2. 染色のために、ストック溶液を完全な培養培地(5%FBSを添加したHG-DMEM、100U/mLペニシリン、100μg/mLストレプトマイシン、0.25μg/mLアンホテリシンB、および2mM L-グルタミン)で希釈することによって、1:100(容量/容量)の作業溶液を調製する。次に、0.2μmのシリンジフィルターで作業溶液をろ過します。
  3. 次に、6ウェルプレート中の培養細胞を同定したDTZ染色について、培養培地を吸引した後、PBSで細胞を1回洗浄し、次いで2mLのDTZ作用溶液を各ウェルに加える。CO2インキュベーター内で37°Cで少なくとも2 時間インキュベートする。
  4. 細胞をPBSで2回慎重に洗浄する。最後の洗浄後、各ウェルに2mLのPBSを加える。その後、真紅に染色されたIPCを倒立顕微鏡で観察する。完全増殖培地(10% FBS - DMEM/F12)で最初に培養した非誘導Ad-MSCを対照として使用してください。

6. RT-qPCRによるβ細胞マーカーの遺伝子発現

  1. RNA抽出
    1. 分化後、細胞ペレットを収集し、使用時まで−80°Cで保存する。各細胞ペレット(プールされた1つの6ウェルプレートの6つのウェルに由来する)を1.5mLヌクレアーゼフリーチューブ内の1mLのチオシアン酸グアニジウムRNA抽出試薬に懸濁し、数回上下にピペッティングする。溶解したサンプルを室温で5分間インキュベートして、核タンパク質複合体の完全な解離を可能にする。
    2. RNA抽出試薬1 mLあたり200 μLのクロロホルムを加え、チューブをしっかりとキャップして手で15秒間激しく振とうします。次に、室温で3分間インキュベートする。
    3. サンプルを 13,800 x g で 4 °C で 15 分間遠心分離します。 これにより、混合物が下部クロロホルム相、間相、および無色の上部水相に分離され、RNAは水相に残ります。
    4. 上部水相を新しいチューブに入れ、相間に触れないように注意する。
    5. 600μLの100%イソプロパノールを水相(1:1容量)に加え、次いで、サンプルを25回反転させて十分に混合し、室温で10分間インキュベートする。
    6. サンプルを 18,800 x g で 4 °C で 30 分間遠心分離します。 沈殿したRNAはチューブ側で小さなゲル状のペレットを形成する。
    7. 上清を除去し、ペレットを1mLの80%氷冷エタノールで洗浄する。エタノールを加えた後、RNAペレットの複数回のピペッティングを10秒間ゆっくりと行う。
    8. サンプルを4°Cで9,600 x g で5分間遠心分離します。 上清を捨て、RNAペレットを5〜10分間風乾させておく。
    9. 乾燥後、1.5 mL ヌクレアーゼフリーチューブで完全に可溶になるまで数回上下にピペッティングすることにより、RNaseフリー水 25 ~ 100 μL (初期ペレットサイズによる) に RNA ペレットを溶解します。RNAペレットの過度の乾燥を避けてください。
      注:通常、ペレットは乾燥すると透明になります。ただし、透明になったら、ペレットの過度の乾燥を避けるために、速やかに再懸濁してください。
    10. ヌクレアーゼを含まない水をブランクとして使用して、260nmおよび280nmにおける光学密度(OD)を決定することによってRNAを定量する。
    11. サンプルの OD260/OD280 = 1.8-2.0 であることを確認します。
  2. cDNA合成
    1. cDNA合成キットを用いて単離された全RNAからcDNAを合成する。
    2. 製造元の指示に従ってcDNA合成反応を行う。200 μL PCRチューブで、0.5 μgの総RNAを含む容量のRNA溶液を 表1に示す反応マスターミックスに加える。
    3. RNAをマスターミックスに加えた後、サーマルサイクラーを用いて、50°Cで30分間のサイクルプログラムを通して混合物を1サイクル、続いて95°Cで2分間の不活化サイクルを通して混合物に入る。
    4. ヌクレアーゼを含まない水を使用して cDNA を終濃度 2 ng/μL に希釈し、その後の RT-qPCR のために -20 °C で保存します。
  3. SYBR グリーンマスターミックスを使用した RT-qPCR
    1. 表2に示す反応ミックスに従ってcDNA鋳型を用いて各標的遺伝子についてRT-qPCR反応を行った。すべての対策を3連で行います。
    2. 用いたプライマーのセットを 表3に示す。すべての RT-qPCR 手順を氷上で実行します。
    3. デフォルトのプログラム設定でリアルタイムPCRマシンを使用してRT-qPCR反応を行います。熱サイクル条件は、初期変性95°Cで10分間、その後45サイクルの変性(95°C、15秒)と複合アニーリング/伸長(60°C、1分)でした。
    4. Ct値を決定し、2-ΔΔCtに従って発現レベルを検出し、内部対照としてβ-アクチンを用いた。

cDNA合成マスターミックス容量(μl)
5x cDNA合成バッファー4
ティッカー2
RNAプライマー1
バーソ酵素ミックス1
RTエンハンサー1
ヌクレアーゼフリーウォーター変数
トータルRNA変数
総反応量20

表1:cDNA合成マスターミックス容量。

RT-qPCR 反応ミックス容量(μl)10 μL中の最終濃度
ティッカー22 ng/ウェル
RT-qPCR フォワードプライマー (3 μM)1300 nM
RT-qPCR リバースプライマー (3 μM)1300 nM
ヌクレアーゼフリーウォーター1-------
2x SYBRグリーンマスターミックス51倍速
全反応量10

表2:RT-qPCR反応混合物。

遺伝子フォワードプライマーリバースプライマー
フォックス2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAACCACTG
ティッカーATCCACCTCCCGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1ACACCAGACCCACATTCTCCGATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
マファTTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC
イン-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTCTGA
βアクチンTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

表3:フォワードおよびリバースプライマー配列。

7. グルコース刺激インスリン分泌

  1. クレブのリンゲル重炭酸塩(KRB)バッファーの調製
    1. グルコース刺激インスリン分泌(GSIS)アッセイ用に、2 mM グルコース (低グルコース) および 20 mM グルコース (高グルコース) 濃度の両方を含む Kreb のリンゲル重炭酸塩 (KRB) バッファー溶液を調製します。KRB緩衝液調製に用いた成分を 表4に示す。
    2. 1 N HClを使用して緩衝液のpHを約7.25〜7.35(すなわち、濾過中に上昇する可能性があるため、所望のpH 7.4より0.1〜0.2単位低い)に調整する。
    3. ウシ血清アルブミン(BSA)を0.1%(重量/体積)の濃度で新鮮に加える。
    4. その後、グルコースを加える(50 mLのKRBに対して18 mgを2 mM低グルコースKRB緩衝液を調製し、50 mLのKRBに対して180 mgを20 mM高グルコースKRB緩衝液を調製する)。
    5. 調製したLGおよびHG KRB緩衝液を0.2μmのシリンジフィルターでろ過して滅菌し、GSISアッセイの準備を整えます。
  2. GSISアッセイ
    1. 最初に12ウェル細胞培養プレートに1 x105 細胞/ウェルをシードし、まったく同じ分化誘導プロトコールを使用してこれらの細胞を誘導する。
    2. 誘導プロトコルの最後に、生成されたIPC(プレート内)をPBSで2回、LG-KRBで1回静かに洗浄します。
    3. その後、IPCを300μLのLG-KRB/ウェルとともに1時間インキュベートし、このバッファーを廃棄します。
    4. 次に、IPC を 300 μL の 2 mM (LG) または 20 mM (HG) KRB バッファーと共にさらに 1 時間インキュベートします。インキュベーション期間の終わりに、上清を収集し、市販のELISAキットを使用し、製造業者の指示に従って、その後の分泌インスリンアッセイのために−80°Cで保存する。
      注: GSIS アッセイを行うときは、PBS および KRB バッファーを吸引または添加しながら、できるだけ穏やかにしてください。
コンポーネント濃度
塩化マグネシウム(無水)0.0468グラム/L
塩化カリウム0.34グラム/L
塩化ナトリウム7.00グラム/リットル
リン酸二塩基ナトリウム(無水)0.1グラム/リットル
リン酸一塩基ナトリウム(無水)0.18グラム/リットル
炭酸水素ナトリウム1.26グラム/リットル
塩化カルシウム0.2997グラム/L

表4:KRB緩衝液調製に用いた成分。

8. 統計解析

  1. 全てのデータを平均±平均の標準誤差(SEM)として表す。すべての比較は、一元配置分散分析(ANOVA)と統計ソフトウェアを使用したTukeyのポストホック検定を使用して行われました。p値 ** pが0.01、 *p が0.05≤結果≤統計的に有意であると考えられた。

結果

広告MSCの分離と特性評価
図 2に示すように、脂肪組織から単離された細胞は、単離の翌日から始まる丸みを帯びた線維芽細胞様細胞の不均一な集団を示した(図2A)。単離後4日目に、線維芽細胞は、継代1によって均質な集団として増殖し、数およびサイズの増加を始めた(図2B、C)。これらの細胞は、?...

ディスカッション

このプロトコルでは、ラット精巣上体脂肪からAd-MSCを単離し、これらのAd-MSCをIPCに分化するための詳細なプロトコルを提示することができました。実際、ラット精巣上体脂肪は、Ad-MSCsを得るための脂肪組織の容易に達成可能な供給源であり、収集にも処理にも特別な装置を必要としない15,26,27。単離されたAd-MSCは、優れた...

開示事項

すべての共著者は、この作品に関連する利益相反を宣言しません。

謝辞

我々は、ラットの解剖を支援したエジプト英国大学(BUE)薬学部獣医師スペシャリストのRawda Samir Mohamed博士(MSc)に謝意を表します。

また、エジプトの英国大学マスコミュニケーション学部(BUE)のこの原稿のビデオの制作と編集に対する努力に感謝し、感謝したいと思います。

エジプトの英国大学(BUE)の英語アシスタント講師であるファトマ・マスード嬢に、原稿の改訂と英語の校正に感謝します。

この研究は、エジプトのカイロにあるエジプトの英国大学(BUE)の薬学部の医薬品研究開発センター(CDRD)によって部分的に資金提供されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin, bovine serum Fraction VMP Biomedicals
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
Ammonium hydroxideFisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITCStem Cell Technologies60024FI
Bovine serum albuminSigma AldrichA3912
Calcium ChlorideFisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITCThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAMA1-19594
CD34 Polyclonal AntibodyThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAPA5-85917
ChloroformFisher Scientific, USA
Collagenase type I, powderGibco, Thermo Fisher, USA17018029
D-Glucose anhydrous, extra pureFisher Scientific, GermanyG/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific, GermanyBP231-100
Dithizone stainingSigma-Aldrich, USAD5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/LLonza, Switzerland12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/LLonza, Switzerland12-707F
DMEM/F12 mediumLonza, SwitzerlandBE12-719F
DNAse/RNAse free waterGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology gradeSigma-Aldrich, Germany24103
Exendin-4Sigma-Aldrich, GermanyE7144
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brazil10270-106
Formaldehyde 37%Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl)Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology gradeFisher Scientific, USABP2618500
L-GlutamineGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kitR&D systems Inc., MN, USASC006
NicotinamideSigma-Aldrich, GermanyN0636
Oil Red StainSigma-Aldrich, USAO0625
Penicillin-Streptomycin-AmphotericinGibco Thermo Fisher, USA15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/MgLonza, SwitzerlandBE17-516F
Potassium ChlorideFisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA KitCloud-Clone Corp., USACEA682Ra
Sodium BicarbonateFisher Scientific, Germany
Sodium ChlorideFisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
SYBR Green MaximaThermo Scientific, USAK0221
Syringe filter, 0.2 micronCorning, USA431224
TRIzolThermo Scientific, USA15596026
Trypan blueGibco Thermo Fisher, USA15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1XLonza, SwitzerlandCC-5012
Verso cDNA synthesis kitThermo Scientific, USAAB-1453/A
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich, GermanyM3148

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