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Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être une source potentielle de CSM qui se différencient en cellules productrices d’insuline (IPC). Dans ce protocole, nous fournissons des étapes détaillées pour l’isolement et la caractérisation des Ad-MSC épididymiques de rat, suivies d’un protocole simple et court pour la génération d’IPC à partir des mêmes Ad-MSC de rat.

Résumé

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), en particulier celles isolées du tissu adipeux (CSA) , ont fait l’objet d’une attention particulière en tant que source renouvelable et abondante de cellules souches qui ne pose aucun problème éthique. Cependant, les méthodes actuelles pour isoler les Ad-MSC ne sont pas normalisées et utilisent des protocoles compliqués qui nécessitent un équipement spécial. Nous avons isolé les CSAd de la graisse épididymale de rats Sprague-Dawley à l’aide d’une méthode simple et reproductible. Les Ad-MSC isolés apparaissent généralement dans les 3 jours suivant l’isolement, car les cellules adhérentes présentent une morphologie fibroblastique. Ces cellules atteignent 80% de confluence dans les 1 semaine suivant l’isolement. Par la suite, au passage 3-5 (P3-5), une caractérisation complète a été effectuée pour les CSA isolés par immunophénotypage des marqueurs de surface du groupe de différenciation (CD) MSC caractéristiques tels que CD90, CD73 et CD105, ainsi que par induction de la différenciation de ces cellules dans les lignées ostéogéniques, adipogènes et chondrogènes. Ceci, à son tour, implique la multipotence des cellules isolées. De plus, nous avons induit la différenciation des Ad-MSC isolés vers la lignée des cellules productrices d’insuline (IPC) via un protocole simple et relativement court en incorporant le milieu Eagle modifié de Dulbecco (HG-DMEM), le β-mercaptoéthanol, le nicotinamide et l’exendine-4. La différenciation des IPC a été évaluée génétiquement, tout d’abord, en mesurant les niveaux d’expression de marqueurs β cellulaires spécifiques tels que MafA, NKX6.1, Pdx-1 et Ins1, ainsi que la coloration à la dithizone pour les IPC générés. Deuxièmement, l’évaluation a également été réalisée fonctionnellement par un test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). En conclusion, les Ad-MSC peuvent être facilement isolés, présentant tous les critères de caractérisation des CSM, et ils peuvent en effet fournir une source abondante et renouvelable de PIC en laboratoire pour la recherche sur le diabète.

Introduction

Les cellules souches mésenchymateuses (CSM), également connues sous le nom de cellules stromales mésenchymateuses, sont parmi les types de cellules les plus largement utilisés pour la médecine régénérative 1,2. Elles sont classées comme cellules souches adultes et caractérisées par un potentiel de différenciation multiligne et une capacité d’auto-renouvellement3. Les CSM peuvent être isolés et obtenus à partir de diverses sources, y compris le tissu adipeux, la moelle osseuse, le sang périphérique, le tissu et le sang du cordon ombilical, les follicules pileux et les dents 4,5.

L’isolement des cellules souches du tissu adipeux est considéré comme à la fois attrayant et prometteur en raison de leur accès facile, de leur expansion rapide in vitro et de leur rendement élevé6. Les cellules souches mésenchymateuses dérivées du tissu adipeux (CSAd) peuvent être isolées de différentes espèces telles que les humains, les bovins, les souris, les rats et, plus récemment, les chèvres7. Il a été prouvé que les Ad-MSC sont maintenant des candidats potentiels pour l’ingénierie tissulaire et la thérapie génique / cellulaire qui peuvent même être utilisés pour développer une alternative autologue pour la réparation à long terme des lésions ou des défauts des tissus mous 7,8.

L’International Society for Cell and Gene Therapy (ISCT) a défini trois critères minimaux qui doivent être présentés par les MSC pour une caractérisation complète9. Tout d’abord, ils doivent être adhérents au plastique. Deuxièmement, les CSM devraient exprimer des marqueurs mésenchymateux de la surface des cellules souches tels que CD73, CD90 et CD105 et manquer d’expression des marqueurs hématopoïétiques CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 et HLA-DR. Enfin, les CSM devraient présenter la capacité de se différencier en trois lignées mésenchymateuses: adipocytes, ostéocytes et chondrocytes. Fait intéressant, les CSM peuvent également se différencier en d’autres lignées telles que les cellules neuronales, les cardiomyocytes, les hépatocytes et les cellules épithéliales10,11.

En fait, les CSM possèdent des propriétés uniques qui leur permettent d’être appliquées en tant qu’agents thérapeutiques potentiels dans la thérapie régénérative pour différentes maladies. Les CSM peuvent sécréter des facteurs solubles pour induire un environnement immunomodulateur qui procure des avantages thérapeutiques12. En outre, les CSM peuvent migrer vers des sites de blessures et des microenvironnements tumoraux pour administrer un traitement ciblé; toutefois, les mécanismes ne sont pas entièrement élucidés13. En outre, les CSM ont la capacité de sécréter des exosomes, des vésicules extracellulaires à l’échelle nanométrique qui transportent une cargaison d’ARN non codants, de protéines et de facteurs solubles, qui ont récemment émergé comme un nouveau mécanisme du potentiel thérapeutique des CSM dans diverses maladies14.

Plus important encore, les CSM ont suscité une attention marquée pour leur potentiel à se différencier en cellules productrices d’insuline (IPC), soit par modification génétique15,16, soit en utilisant divers facteurs extrinsèques dans les milieux de culture in vitro17. La période d’induction de l’IPC varie considérablement, car elle dépend du protocole d’induction utilisé et des facteurs extrinsèques utilisés. Le processus de différenciation peut durer de quelques jours à plusieurs mois, et il nécessite une combinaison de facteurs exogènes qui doivent être ajoutés et / ou retirés à différentes étapes. Bon nombre de ces facteurs qui ont été utilisés pour la différenciation pancréatique endocrinienne sont des composés biologiquement actifs dont il a été démontré qu’ils favorisent la prolifération ou la différenciation/néogenèse des cellules β sécrétant de l’insuline et/ou augmentent la teneur en insuline des IPC 18,19,20,21. Il convient de noter ici que les CSM ont également été signalés pour avoir des effets thérapeutiques dans le diabète et ses complications via plusieurs mécanismes, y compris leur sécrétome, ainsi qu’un large éventail d’actions immunomodulatrices 22,23,24.

Dans ce protocole, nous présentons un protocole détaillé par étapes pour l’isolement et la caractérisation des CSAd à partir de graisse épididymale de rat, suivi d’un protocole simple et relativement court pour la génération de CPI à partir d’Ad-MSC.

Protocole

Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées et toutes les procédures ont été approuvées par le Comité d’éthique de la Faculté de pharmacie de l’Université britannique en Égypte (BUE), au Caire, en Égypte. Le protocole d’isolement Ad-MSC a été adopté par Lopez et Spencer, avec les modifications15.

1. Isolement des Ad-MSC des coussinets de graisse épididymiques de rat

  1. Utilisez des rats Sprague-Dawley mâles pesant de 250 à 300 g et n’ayant pas plus de 1 mois (deux par isolement). Anesthésier les animaux, puis les euthanasier par luxation cervicale. Vaporisez l’animal euthanasié avec 70% d’éthanol. Excisez la peau et le muscle dans la partie inférieure de l’abdomen, puis retirez les deux testicules pour exposer les coussinets adipeux épididymiques.
  2. Coupez doucement les coussinets de graisse épididymale et veillez à ne pas couper les vaisseaux sanguins.
  3. Isolez le tissu adipeux entourant l’épididyme, puis placez-le dans une boîte de Pétri contenant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
  4. Dans l’armoire de biosécurité, coupez ces coussinets de graisse en petits morceaux à l’aide d’une pince et d’un scalpel. Transférer ces morceaux de tissu adipeux coupés dans un tube centrifuge de 50 mL contenant 10 mL de PBS stérile.
  5. Lavez les tissus adipeux hachés 5 fois avec 10 ml de PBS à chaque fois pour éliminer le sang contaminant. Les procédures de lavage suivantes doivent être méticuleusement effectuées.
    1. Ajouter 10 mL de PBS au tissu et bien mélanger pendant 45 s. Ensuite, laissez le tissu se déposer par gravité en maintenant le tube debout pendant 5 minutes pour le séparer en deux couches.
    2. Aspirer le PBS de l’infranageant à l’aide d’une seringue de 10 ml et remplacer par 10 mL de PBS frais pour un autre lavage.
    3. Répétez cette étape de lavage 4 à 5 fois jusqu’à ce que le PBS soit exempt de sang. Cela indique que la plupart, sinon la totalité, du sang est enlevé.
  6. Après le lavage, remettre en suspension le tissu adipeux dans 10 mL de solution de collagénase (0,1 % de collagénase de type 1 dans le PBS). Scellez hermétiquement le tube avec du parafilm, puis incubez-le dans un bain-marie (37 °C, 80 tr/min, pendant 45 min) jusqu’à ce que le tissu soit presque homogène.
    REMARQUE: Évitez la digestion complète du tissu (lorsque la solution devient complètement homogène avec la disparition complète de tous les résidus / morceaux de tissu), car elle affecte négativement la culture des cellules par la suite. Habituellement, la digestion prend 30-45 min.
  7. Une fois la digestion de la collagénase terminée, vortex le tube pendant 15 s, puis centrifuger pendant 5 min à 300 x g. Vortex le tube à nouveau pendant 10 s, suivi d’une autre centrifugation de 5 min. Trois couches seront alors observées. Jetez soigneusement la couche d’huile, suivie de la couche aqueuse, sans perturber la pastille de fraction vasculaire stromale (SVF).
    REMARQUE: Retirez le surnageant contenant les adipocytes et la solution de collagénase. Tout d’abord, retirez les adipocytes et la couche d’huile qui l’accompagne avec une pipette de 10 mL pour assurer l’élimination complète des gouttelettes d’huile, puis retirez la couche aqueuse inférieure.
  8. Remettre en suspension la pastille de SVF au fond du tube dans 10 mL de solution stérile de BSA (albumine à 1%, solution de fraction V de sérum bovin dans PBS), puis centrifuger le tube pendant 5 min à 300 x g.
  9. Après centrifugation, jeter le surnageant et suspendre la pastille de SVF dans 8,5 mL de milieu complet pour les CSA (composé du mélange modifié Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12 [DMEM/F12] de Dulbecco complété par 10 % de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine).
  10. Cultiver les cellules dans une fiole de25 cm 2 à 37 °C sous 5 % de CO2. Le lendemain, vérifiez les cellules attachées, retirez les cellules suspendues et remplacez le support. Ensuite, changez de média tous les deux jours.
  11. Passage des cellules tous les 5-7 jours quand elles sont confluentes à 80% à 90% en utilisant trypsine-EDTA. Utilisez des cellules entre les passages 3 à 5 pour les expériences ultérieures décrites dans ce protocole. Une présentation schématique de toutes les étapes d’isolement est fournie à la figure 1.
    REMARQUE: Habituellement, la puissance de Trypisn-EDTA peut varier entre les différents fournisseurs, alors essayez de minimiser le temps de trypsinisation pour éviter les effets toxiques sur les cellules.

2. Caractérisation des CSAd par immunophénotypage à l’aide d’analyses de cytométrie en flux

  1. Au passage 3, divisez les cellules à l’aide de trypsine-EDTA. Laver avec PBS 2 fois, puis compter les cellules avec un hémocytomètre.
  2. Incuber 100 000 cellules à 4 °C dans l’obscurité pendant 20 min avec un anticorps monoclonal anti-rat CD90 ou CD105 (marqueurs mésenchymateux) ou CD34 (marqueur hématopoïétique) marqué avec de la fluorescéine-isothiocyanate (FITC).
  3. Lavez les cellules et suspendez-les dans 500 μL de tampon FACS. Analyser par cytométrie en flux25.

3. Évaluation du potentiel de différenciation des CSA isolés en diverses lignées mésenchymateuses

  1. Différenciation adipogénique
    1. Remettre en suspension les cellules dans un milieu complet (comme décrit à l’étape 1.9.), puis cultiver les cellules à une densité de 3,7 x 104 cellules/puits dans une plaque de culture tissulaire de 24 puits. Incuber à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2. Ensuite, changez le média tous les 3 jours jusqu’à ce que les cellules atteignent presque 100% de confluence, ce qui prend généralement 3 jours.
    2. Lorsque les cellules atteignent la confluence souhaitée, remplacer le milieu de prolifération par le milieu de différenciation adipogénique (composé de milieux LG-DMEM complétés par 10 % de FBS, de 100 U/mL de pénicilline, de 100 μg/mL de streptomycine, de 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et de 2 mM de L-glutamine avec 1x supplément adipogène, fourni avec le kit d’identification fonctionnelle des cellules souches mésenchymateuses) pour induire l’adipogenèse. Ensuite, changez le média tous les 3 jours (0,5 mL/puits). Prenez soin d’effectuer le remplacement du support en douceur afin de ne pas perturber les vacuoles lipidiques.
    3. Après 21 jours, évaluer la différenciation adipogénique par examen microscopique de l’apparence des vacuoles lipidiques et par coloration rouge huile.
    4. Préparez une solution mère d’huile rouge en dissolvant 30 mg de tache rouge huile dans 10 ml d’isopropanol, puis conservez-la pendant au moins 20 minutes à température ambiante. Ensuite, préparez une solution de travail en mélangeant 3 parties de solution mère avec 2 parties d’eau double distillée (ddH2O), mélangez-les bien et conservez-la pendant 10 minutes à température ambiante, puis filtrez ensuite par papier filtre.
    5. Pour documenter la différenciation adipogénique, lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné neutre à 10% (0,75 ml / puits) pendant 15 min. Après cela, lavez les cellules 2 fois avec du PBS en utilisant 1 mL / puits et incubez les cellules pendant 5 minutes à chaque fois. Il est important d’aspirer complètement le PBS avant d’ajouter la solution de travail Oil Red.
    6. Après le dernier lavage, ajouter la solution de travail Oil Red aux cellules et les incuber pendant 60 min à 37 °C. Ensuite, retirez la solution de coloration et lavez doucement les cellules 2 fois avec DU PBS. Observez les gouttelettes lipidiques colorées au microscope.
  2. Différenciation ostéogénique
    1. Ensemencez 7,4 x 103 cellules/puits (0,5 mL de milieu/puits) dans une plaque de 24 puits et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 en milieu complet (tel que décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 70 % de confluence.
    2. Induire les cellules avec le supplément ostéogénique (fourni avec le kit) dans un milieu LG-DMEM complété par 10% FBS, 100 U / mL pénicilline, 100 μg / mL streptomycine, 0,25 μg / mL amphotéricine B et 2 mM L-glutamine.
    3. Poursuivre l’induction ostéogénique pendant 21 jours, en changeant le milieu de différenciation tous les 3 jours.
    4. Préparer une solution de travail de la tache Alizarin Red S en dissolvant 200 mg de teinture Alizarin Red S dans 9 mL de ddH2O, puis ajuster le pH à 4,1-4,3 en utilisant de l’hydroxyde d’ammonium et du HCl. Ensuite, augmentez le volume à 10 mL par ddH2O. Ensuite, éliminez les précipités par filtration à l’aide de papier filtre.
    5. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné à 10% (0,75 mL / puits) pendant 15 min. Ensuite, lavez les cellules 2 fois à l’aide de PBS (1 mL / puits). A chaque fois, incuber les cellules pendant 5 min.
    6. Incuber les cellules fixes avec la solution préparée à 2% d’Alizarine-Red S pendant 30 min dans un incubateur à 37 °C.
    7. Après cela, retirez la solution de coloration, lavez les cellules 2 fois avec ddH2O et une fois avec PBS, puis observez la matrice extracellulaire riche en calcium colorée pour évaluer la différenciation ostéogénique au microscope.
  3. Différenciation chondrogène
    1. Ensemencez 7,4 x 103 cellules/puits (0,5 mL de milieu/puits) dans une plaque de 24 puits et incubez-les à 37 °C dans une atmosphère humidifiée de 5 % de CO2 en milieu complet (tel que décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 70 % de confluence.
    2. Lorsque la confluence souhaitée est atteinte, induire la différenciation chondrogène des cellules avec du DMEM/F12 sans sérum contenant du sélénium insulino-transferrine (ITS), un supplément chondrogène (fourni avec le kit), 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine21.
    3. Incuber les cellules avec le milieu chondrogène pendant 21 jours, tout en changeant le milieu de différenciation chondrogène tous les 3 jours.
    4. Préparez une solution de travail de teinture Alcian Blue 8GX comme suit: Tout d’abord, préparez une solution d’acide acétique glacial à 3% dans ddH2O en ajoutant 3 mL d’acide acétique glacial à 97 mL de ddH2O. Ensuite, préparez une solution de travail de teinture Alcian Blue 8GX en mélangeant 0,1 g dans 100 mL de solution d’acide glacial à 3% et éliminez les précipités par filtration à l’aide de papier filtre.
    5. Lavez les cellules 2 fois avec du PBS, puis fixez-les à l’aide de formol tamponné à 10% (0,75 mL / puits) pendant 15 min. Ensuite, lavez les cellules 2 fois à l’aide de PBS (1 mL / puits). A chaque fois, incuber les cellules pendant 5 min.
    6. L’étape suivante consiste à incuber les cellules de la teinture Alcian Blue 8GX préparée à 0,1% dans de l’acide acétique glacial à 3% pendant 60 min à 37 °C. Lavez les cellules colorées 2 fois avec ddH2O et une fois avec PBS, puis observez les protéoglycanes sulfatés colorés au microscope.

4. Différenciation des Ad-MSC en IPC

  1. Au passage 3, divisez les Ad-MSC en utilisant Trypsin-EDTA. Tout d’abord, retirez le milieu, puis lavez les cellules tout en restant attachées dans la fiole de culture avec 5 mL de PBS. Ensuite, ajoutez 5 mL de trypsine-EDTA dans la fiole de 75 cm2 et incubez à 37 °C pendant 3 à 10 min.
    REMARQUE: Essayez d’induire les cellules aux premiers passages, généralement entre P3 et P5, car les passages tardifs affectent négativement les propriétés et les capacités de différenciation des cellules17,24.
  2. Ensuite, inspectez les cellules pour le détachement et pour être une suspension à cellule unique. Ajouter 5 mL de milieu DMEM/F12 complet à la fiole pour inhiber l’action de la trypsine. Recueillez la suspension cellulaire et transférez-la dans un tube de 15 mL, puis ajoutez 5 mL supplémentaires de milieu DMEM/F12 complet au tube.
  3. Centrifugez les cellules à 300 x g pendant 2 min pour granuler les cellules.
  4. Lavez les cellules une fois avec du PBS, centrifugez à nouveau à 300 x g pendant 2 min, puis remettez en suspension la pastille de cellule dans 3 à 5 mL de milieu DMEM/F12 complet.
  5. Comptez les cellules à l’aide d’un colorant d’exclusion bleu trypan et d’un hémocytomètre.
  6. Ensuite, ensemencez les cellules dans des plaques de 6 puits (1 x 106 cellules / plaque) et une plaque de 12 puits (pour le test GSIS; 1 x 106 cellules / plaque) et incubez dans un incubateur à 37 ° C, 5% de CO2 dans un milieu complet (comme décrit à l’étape 1.9.) pendant 3 jours pour atteindre près de 90% de confluence.
  7. Le jour de l’induction, retirez le milieu, lavez les cellules avec du PBS, puis pré-induisez les cellules pendant 2 jours par un milieu de pré-induction (DMEM/F12 complété par 10% fbS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 2 mM de L-glutamine, 10 mM de nicotinamide [NA] et 1mM de β-mercaptoéthanol [β-ME]).
  8. Induire les cellules pendant 1 jour supplémentaire en utilisant un DMEM à haute teneur en glucose (HG-DMEM, 4,5 g / L de glucose) complété par 2,5% FBS, 100 U / mL pénicilline, 100 μg / mL streptomycine, 0,25 μg / mL amphotéricine B, 2 mM L-glutamine, 10 mM NA et 1mM β-mercaptoéthanol. Collecter des pastilles cellulaires à la fin de cette étape (cellules D3 désignées dans ce protocole).
  9. Incuber les cellules pendant 7 jours supplémentaires dans le milieu d’induction de différenciation finale composé de HG-DMEM complété par 2,5% de FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 2 mM de L-glutamine, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoéthanol et 10 nM d’exendine-4.
  10. À la fin de la période spécifiée, recueillir les pastilles cellulaires (nommées Final dans ce protocole) et évaluer la différenciation réussie des cellules par coloration DTZ et test GSIS, comme suit dans ce protocole.
  11. Évaluez les IPC générés en suivant les étapes 5 et 6 ci-dessous.

5. Coloration à la dithizone

  1. Préparer la solution mère de teinture de dithizone (DTZ) comme suit : Dissoudre complètement 25 mg de DTZ dans 2,5 mL de diméthylsulfoxyde (DMSO), diviser en aliquotes et conserver à −20 °C dans l’obscurité jusqu’à utilisation.
  2. Pour la coloration, préparer une solution de travail 1:100 (volume/volume) en diluant la solution mère dans un milieu de culture complet (HG-DMEM complété par 5% FBS, 100 U/mL de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B et 2 mM de L-glutamine). Ensuite, filtrez la solution de travail à travers un filtre à seringue de 0,2 μm.
  3. Ensuite, pour les cellules de culture de coloration DTZ spécifiées dans une plaque de 6 puits et, après avoir aspiré le milieu de culture, lavez les cellules une fois avec DU PBS, puis ajoutez 2 mL de solution de travail DTZ dans chaque puits. Incuber pendant au moins 2 h à 37 °C dans l’incubateur à CO2 .
  4. Lavez soigneusement les cellules 2 fois avec PBS. Après le dernier lavage, ajouter 2 mL de PBS dans chaque puits. Ensuite, observez les IPC tachés de rouge cramoisi sous un microscope inversé. Utilisez des Ad-MSC non induits initialement cultivés dans un milieu de croissance complet (10% FBS - DMEM / F12) comme contrôle.

6. Expression génique des marqueurs β cellules par RT-qPCR

  1. Extraction de l’ARN
    1. Après différenciation, recueillir les pastilles cellulaires et les conserver à −80 °C jusqu’à leur utilisation. Suspendre chaque pastille cellulaire (dérivée des six puits d’une plaque de 6 puits regroupée) dans 1 mL de réactif d’extraction d’ARN de thiocyanate de guanidium dans un tube sans nucléase de 1,5 mL, avec pipetage de haut en bas plusieurs fois. Incuber les échantillons lysés à température ambiante pendant 5 min pour permettre une dissociation complète des complexes nucléoprotéiques.
    2. Ajouter 200 μL de chloroforme pour 1 mL de réactif d’extraction d’ARN et boucher solidement les tubes pour les serrer vigoureusement à la main pendant 15 s. Ensuite, incuber pendant 3 min à température ambiante.
    3. Centrifuger les échantillons à 13 800 x g pendant 15 min à 4 °C. Cela conduira à la séparation du mélange en une phase chloroforme inférieure, une phase interphase et une phase aqueuse supérieure incolore, l’ARN restant dans la phase aqueuse.
    4. Placez la phase aqueuse supérieure dans un nouveau tube, tout en évitant soigneusement de toucher l’interphase.
    5. Ajouter 600 μL d’isopropanol à 100% à la phase aqueuse (volume 1:1), puis bien mélanger les échantillons par inversion 25 fois, et incuber à température ambiante pendant 10 min.
    6. Centrifuger les échantillons à 18 800 x g pendant 30 min à 4 °C. L’ARN précipité forme une petite pastille en forme de gel du côté du tube.
    7. Retirez le surnageant et lavez les granulés avec 1 mL d’éthanol glacé à 80 %. Après avoir ajouté l’éthanol, effectuez lentement un pipetage multiple de la pastille d’ARN pendant 10 s.
    8. Centrifuger les échantillons pendant 5 min à 9 600 x g à 4 °C. Jetez le surnageant et laissez sécher les pastilles d’ARN à l’air libre pendant 5 à 10 minutes.
    9. Après séchage, dissoudre les pastilles d’ARN dans 25 à 100 μL d’eau sans RNase (selon la taille initiale de la pastille) en pipetant plusieurs fois de haut en bas jusqu’à la solubilisation complète dans des tubes sans nucléase de 1,5 mL. Évitez le séchage excessif de la pastille d’ARN.
      REMARQUE: Habituellement, la pastille devient transparente lorsqu’elle sèche. Cependant, une fois qu’il est clair, remettez-le rapidement en suspension pour éviter une sécheresse excessive de la pastille.
    10. Quantifier l’ARN en déterminant les densités optiques (OD) à 260 nm et 280 nm, en utilisant de l’eau sans nucléase comme blanc.
    11. Assurez-vous que les échantillons ont OD260/OD280 = 1,8-2,0.
  2. Synthèse de l’ADNc
    1. Synthétisez l’ADNc à partir de l’ARN total isolé à l’aide d’un kit de synthèse d’ADNc.
    2. Effectuer la réaction de synthèse de l’ADNc selon les instructions du fabricant. Dans un tube PCR de 200 μL, ajouter un volume de solution d’ARN contenant 0,5 μg d’ARN total au mélange maître de réaction présenté dans le tableau 1.
    3. Après avoir ajouté l’ARN au mélange maître, entrez le mélange par un programme de cycle de 50 °C pendant 30 min pendant un cycle, suivi d’un cycle d’inactivation de 95 °C pendant 2 min, à l’aide d’un cycleur thermique.
    4. Diluer l’ADNc à l’aide d’eau sans nucléase jusqu’à une concentration finale de 2 ng/μL. Conserver à −20 °C pour une RT-qPCR ultérieure.
  3. RT-qPCR utilisant SYBR Green Master Mix
    1. Effectuer la réaction RT-qPCR pour chaque gène cible à l’aide d’un modèle d’ADNc selon le mélange de réactions présenté dans le tableau 2. Faites toutes les mesures en trois exemplaires.
    2. Les ensembles d’amorces utilisés sont présentés dans le tableau 3. Effectuez toutes les procédures RT-qPCR sur la glace.
    3. Effectuez la réaction RT-qPCR à l’aide d’une machine PCR en temps réel sur les paramètres du programme par défaut. Les conditions de cycle thermique comprenaient une dénaturation initiale de 95 °C pendant 10 min, suivie de 45 cycles de dénaturation (95 °C, 15 s) et d’un recuit/extension combiné (60 °C, 1 min).
    4. Déterminer les valeurs Ct et détecter les niveaux d’expression conformément à 2-ΔΔCt, avec β-actine comme contrôle interne.

Mélange maître de synthèse d’ADNcVolume (μl)
5x tampon de synthèse d’ADNc4
dNTP2
Amorce d’ARN1
Mélange d’enzymes Verso1
Amplificateur RT1
Eau sans nucléaseVariable
ARN totalVariable
Volume total de réaction20

Tableau 1 : Volumes de mélange maître de synthèse d’ADNc.

Mélange de réactions RT-qPCRVolume (μl)Concentration finale en 10 μL
ADNc22 ng/puits
Amorce avant RT-qPCR (3 μM)1300 nM
Amorce inverse RT-qPCR (3 μM)1300 nM
Eau sans nucléase1-------
2x SYBR Green master mix51x
Volume total de réaction10

Tableau 2 : Mélange réactionnel RT-qPCR.

GèneAmorce avantAmorce inversée
FOXA2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAACCACTG
PDX-1ATCCACCTCCCGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1ACACCAGACCCACATTCTCCGATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
MafATTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC
Ins-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-actineTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

Tableau 3 : Séquences d’amorces avant et arrière.

7. Sécrétion d’insuline stimulée par le glucose

  1. Préparation du tampon de bicarbonate de Ringer (KRB) de Kreb
    1. Préparez la solution tampon de bicarbonate de Ringer (KRB) de Kreb avec des concentrations de glucose de 2 mM (faible teneur en glucose) et de 20 mM de glucose (glucose élevé) pour le test de sécrétion d’insuline stimulée par le glucose (GSIS). Les composants utilisés pour la préparation du tampon KRB sont donnés dans le tableau 4.
    2. Ajuster le pH du tampon à l’aide de 1 N HCl à environ 7,25-7,35 (c.-à-d. 0,1-0,2 unités en dessous du pH souhaité de 7,4, car il peut augmenter pendant la filtration).
    3. Ajouter l’albumine sérique bovine (BSA) fraîchement à une concentration de 0,1 % (poids/volume).
    4. Ajouter du glucose par la suite (18 mg pour 50 mL de KRB pour préparer le tampon KRB à faible teneur en glucose de 2 mM, et 180 mg pour 50 mL de KRB pour préparer le tampon KRB à haute teneur en glucose de 20 mM).
    5. Stériliser les tampons LG et HG KRB préparés par filtration à travers un filtre à seringue de 0,2 μm pour être prêt pour le test GSIS.
  2. Essai GSIS
    1. Initialement, ensemencez 1 x 105 cellules / puits dans une plaque de culture cellulaire de 12 puits et induisez ces cellules en utilisant exactement le même protocole d’induction de différenciation.
    2. À la fin du protocole d’induction, lavez doucement les IPC générés (en plaque) 2 fois avec PBS et une fois avec LG-KRB.
    3. Ensuite, incuber les IPC avec 300 μL de LG-KRB/puits pendant 1 h, puis jeter ce tampon.
    4. Ensuite, incubez les IPC avec 300 μL de tampon KRB de 2 mM (LG) ou 20 mM (HG) pendant 1 h supplémentaire. À la fin de la période d’incubation, prélever le surnageant et le conserver à −80 °C pour le test d’insuline sécrété ultérieur à l’aide d’un kit ELISA commercial et en suivant les instructions du fabricant.
      REMARQUE: Essayez d’être aussi doux que possible lors de l’aspiration ou de l’ajout du tampon PBS et KRB lors de l’exécution du test GSIS.
ComposantConcentration
Chlorure de magnésium (anhydre)0,0468 g/L
Chlorure de potassium0,34 g/L
Chlorure de sodium7,00 g/L
Phosphate de sodium dibasique (anhydre)0,1 g/L
Phosphate de sodium monobasique (anhydre)0,18 g/L
Sodium Bicarbonate1,26 g/L
Chlorure de calcium0,2997 g/L

Tableau 4 : Composants utilisés pour la préparation du tampon KRB.

8. Analyse statistique

  1. Exprimer toutes les données en moyenne ± erreur-type de la moyenne (SEM). Toutes les comparaisons ont été effectuées à l’aide de l’analyse unidirectionnelle de la variance (ANOVA) et du test post-hoc de Tukey à l’aide d’un logiciel statistique. Les résultats avec des valeurs de p **p ≤ 0,01 et *p ≤ 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs.

Résultats

Isolement et caractérisation des Ad-MSC
Comme le montre la figure 2, les cellules isolées du tissu adipeux ont montré une population hétérogène de cellules arrondies et ressemblant à des fibroblastes à partir du jour suivant de l’isolement (figure 2A). 4 jours après l’isolement, les cellules fibroblastiques ont commencé à augmenter en nombre et en taille et à croître en tant que population homogène au passage 1 (

Discussion

Dans ce protocole, nous avons réussi à présenter un protocole détaillé pour l’isolement des Ad-MSC de la graisse épididymale de rat et la différenciation de ces Ad-MSC en IPC. En fait, la graisse épidydimale de rat est une source facilement accessible de tissu adipeux pour l’obtention d’Ad-MSC et ne nécessite aucun équipement spécial, ni pour la collecte ni pour le traitement 15,26,27. Les Ad-MSC isolés ont mon...

Déclarations de divulgation

Tous les co-auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts associé à ce travail.

Remerciements

Nous remercions le Dr Rawda Samir Mohamed, MSc, vétérinaire spécialiste, Faculté de pharmacie, Université britannique d’Égypte (BUE) pour son aide à la dissection des rats.

Nous tenons également à remercier et à apprécier les efforts de la Faculté de communication de masse de l’Université britannique en Égypte (BUE) pour la production et le montage de la vidéo de ce manuscrit.

Nous tenons à remercier Mlle Fatma Masoud, MSc, maître de conférences en anglais, The British University in Egypt (BUE) pour la révision et la relecture en anglais du manuscrit.

Ce travail a été partiellement financé par le Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculté de pharmacie, Université britannique en Égypte (BUE), Le Caire, Égypte.

matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin, bovine serum Fraction VMP Biomedicals
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
Ammonium hydroxideFisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITCStem Cell Technologies60024FI
Bovine serum albuminSigma AldrichA3912
Calcium ChlorideFisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITCThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAMA1-19594
CD34 Polyclonal AntibodyThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAPA5-85917
ChloroformFisher Scientific, USA
Collagenase type I, powderGibco, Thermo Fisher, USA17018029
D-Glucose anhydrous, extra pureFisher Scientific, GermanyG/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific, GermanyBP231-100
Dithizone stainingSigma-Aldrich, USAD5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/LLonza, Switzerland12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/LLonza, Switzerland12-707F
DMEM/F12 mediumLonza, SwitzerlandBE12-719F
DNAse/RNAse free waterGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology gradeSigma-Aldrich, Germany24103
Exendin-4Sigma-Aldrich, GermanyE7144
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brazil10270-106
Formaldehyde 37%Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl)Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology gradeFisher Scientific, USABP2618500
L-GlutamineGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kitR&D systems Inc., MN, USASC006
NicotinamideSigma-Aldrich, GermanyN0636
Oil Red StainSigma-Aldrich, USAO0625
Penicillin-Streptomycin-AmphotericinGibco Thermo Fisher, USA15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/MgLonza, SwitzerlandBE17-516F
Potassium ChlorideFisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA KitCloud-Clone Corp., USACEA682Ra
Sodium BicarbonateFisher Scientific, Germany
Sodium ChlorideFisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
SYBR Green MaximaThermo Scientific, USAK0221
Syringe filter, 0.2 micronCorning, USA431224
TRIzolThermo Scientific, USA15596026
Trypan blueGibco Thermo Fisher, USA15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1XLonza, SwitzerlandCC-5012
Verso cDNA synthesis kitThermo Scientific, USAAB-1453/A
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich, GermanyM3148

Références

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