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Resumo

Células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser uma fonte potencial de MSCs que se diferenciam em células produtoras de insulina (IPCs). Neste protocolo, fornecemos passos detalhados para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs epidímicas de ratos, seguidos de um protocolo simples e curto para a geração de IPCs a partir dos mesmos Ad-MSCs de ratos.

Resumo

As células-tronco mesenquimais (MSCs)- especialmente aquelas isoladas do tecido adiposo (Ad-MSCs)-ganharam atenção especial como uma fonte renovável e abundante de células-tronco que não representam nenhuma preocupação ética. No entanto, os métodos atuais para isolar os Ad-MSCs não são padronizados e empregam protocolos complicados que requerem equipamentos especiais. Isolamos os Ad-MSCs da gordura epidídimamal dos ratos de Sprague-Dawley usando um método simples e reprodutível. Os Ad-MSCs isolados geralmente aparecem dentro de 3 dias após o isolamento, já que as células aderentes apresentam morfologia fibroblástica. Essas células atingem 80% de confluência em 1 semana de isolamento. Posteriormente, na passagem 3-5 (P3-5), foi realizada uma caracterização completa para os Ad-MSCs isolados por imunofenofoteping para aglomerados característicos de marcadores de superfície msc de diferenciação (CD), como CD90, CD73 e CD105, bem como induzir diferenciação dessas células pelas linhagenias osteogênicas, adipogênicas e condrogênicas. Isso, por sua vez, implica a multipotência das células isoladas. Além disso, induzimos a diferenciação dos Ad-MSCs isolados em relação à linhagem de células produtoras de insulina (IPCs) através de um protocolo simples e relativamente curto, incorporando o meio eagle modificado de alta glicose Dulbecco (HG-DMEM), β-mercaptoetanol, nicotinamida e exendin-4. A diferenciação dos IPCs foi geneticamente avaliada, em primeiro lugar, através da medição dos níveis de expressão de marcadores específicos de células β, como MafA, NKX6.1, Pdx-1 e Ins1, bem como a coloração de dithizone para os IPCs gerados. Em segundo lugar, a avaliação também foi realizada funcionalmente por um ensaio de secreção de insulina estimulada por glicose (GSIS). Em conclusão, os Ad-MSCs podem ser facilmente isolados, exibindo todos os critérios de caracterização do MSC, e eles podem de fato fornecer uma fonte abundante e renovável de IPCs no laboratório para pesquisa de diabetes.

Introdução

As células-tronco mesenquimais (MSCs), também conhecidas como células estromais mesenquimais, estão entre os tipos de células mais amplamente utilizados para a medicina regenerativa 1,2. São classificadas como células-tronco adultas e caracterizadas pelo potencial de diferenciação multilineagem e capacidade de auto-renovação3. Os MSCs podem ser isolados e obtidos de várias fontes, incluindo tecido adiposo, medula óssea, sangue periférico, tecido do cordão umbilical e sangue, folículos capilares e dentes 4,5.

O isolamento das células-tronco do tecido adiposo é visto como atraente e promissor devido ao seu fácil acesso, rápida expansão in vitro e alto rendimento6. As células-tronco mesenquimais derivadas do tecido adiposo (Ad-MSCs) podem ser isoladas de diferentes espécies, como humanos, bovinos, ratos, ratos e, mais recentemente, cabras7. Foi comprovado que os Ad-MSCs são agora potenciais candidatos à engenharia de tecidos e terapia gene/célula que podem até ser usados para desenvolver uma alternativa autóloga para a reparação a longo prazo de lesões de tecido mole ou defeitos 7,8.

A Sociedade Internacional de Terapia Celular e Genética (ISCT) definiu três critérios mínimos que devem ser apresentados pelos MSCs para caracterização completa9. Primeiro, eles devem ser adeptos de plástico. Em segundo lugar, os MSCs devem expressar marcadores de superfície de células-tronco mesenquimais como CD73, CD90 e CD105 e falta de expressão dos marcadores hematopoiéticos CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79α ou CD19 e HLA-DR. Finalmente, os MSCs devem exibir a capacidade de diferenciar-se nas três linhagens mesenquimais: adipócitos, osteocitos e condrócitos. Curiosamente, os MSCs também podem se diferenciar em outras linhagens, como células neuronais, cardiomiócitos, hepatócitos e células epiteliais10,11.

De fato, os MSCs possuem propriedades únicas que lhes permitem ser aplicados como potenciais agentes terapêuticos na terapia regenerativa para diferentes doenças. Os MSCs podem segregar fatores solúveis para induzir um ambiente imunomodulatório que proporciona benefícios terapêuticos12. Além disso, os MSCs podem migrar para locais de lesões e microambientes tumorais para fornecer terapia direcionada; no entanto, os mecanismos não são totalmente elucidados13. Além disso, os MSCs têm a capacidade de segregar exosósmos, vesículas extracelulares na nanoescala que carregam uma carga de RNAs não codificantes, proteínas e fatores solúveis, que recentemente surgiram como um novo mecanismo do potencial terapêutico dos MSCs em várias doenças14.

Mais importante, os MSCs têm gerado atenção marcante para seu potencial de diferenciação em células produtoras de insulina (IPCs), seja por modificação genética15,16 ou através da utilização de vários fatores indutores extrínsecos dentro da mídia cultural in vitro17. O período de indução do IPC varia muito, pois depende do protocolo de indução utilizado e dos fatores extrínsecos utilizados. O processo de diferenciação pode durar de dias a meses, e requer uma combinação de fatores indutores exógenos que devem ser adicionados e/ou retirados em diferentes estágios. Muitos desses fatores que têm sido utilizados para a diferenciação pancreática endócrina são compostos biologicamente ativos que têm sido mostrados para promover a proliferação ou diferenciação/neogênese de células β e/ou aumentar o teor de insulina dos IPCs 18,19,20,21. Vale ressaltar aqui que os MSCs também têm tido efeitos terapêuticos no diabetes e suas complicações através de diversos mecanismos, incluindo seu secretome, bem como uma ampla gama de ações imuno-modulatórias 22,23,24.

Neste protocolo, apresentamos um protocolo passo detalhado para o isolamento e caracterização de Ad-MSCs a partir de gordura epidídica de ratos, seguido por um protocolo simples e relativamente curto para a geração de IPCs a partir de Ad-MSCs.

Protocolo

Todos os experimentos foram realizados de acordo com as diretrizes aprovadas, e todos os procedimentos foram aprovados pelo Comitê de Ética da Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito. O protocolo de isolamento Ad-MSC foi adotado por Lopez e Spencer, com modificações15.

1. Isolamento de Ad-MSCs de almofadas de gordura epidídica de ratos

  1. Use ratos sprague-dawley machos pesando 250-300 g que não têm mais de 1 mês de idade (dois por isolamento). Anestesiar os animais, então eutanásia-los por deslocamento cervical. Pulverizar o animal eutanizado com 70% de etanol. Extirpa a pele e o músculo na parte inferior do abdômen, e depois retire os dois testículos para expor as almofadas de gordura epidídica.
  2. Corte suavemente as almofadas de gordura epidídica e tenha cuidado para não cortar os vasos sanguíneos.
  3. Isole o tecido adiposo ao redor da epidídico, em seguida, coloque-o em uma placa de Petri contendo soro fisco tamponado por fosfato (PBS).
  4. No armário de biossegurança, corte essas almofadas de gordura em pequenos pedaços usando fórceps e bisturi. Transfira estes pedaços de tecido adiposo cortados em um tubo centrífuga de 50 mL contendo 10 mL de PBS estéril.
  5. Lave os tecidos de gordura picados 5 vezes com 10 mL de PBS cada vez para remover o sangue contaminante. Os seguintes procedimentos de lavagem devem ser meticulosamente realizados.
    1. Adicione 10 mL de PBS ao tecido e misture bem por 45 s. Em seguida, deixe o tecido se estabelecer através da gravidade mantendo o tubo em pé por 5 minutos para se separar em duas camadas.
    2. Aspire o PBS do infranatante utilizando uma seringa de 10 ml e substitua por 10 mL fresco de PBS para outra lavagem.
    3. Repita esta etapa de lavagem 4-5 vezes até que o PBS esteja livre de sangue. Isso indica que a maioria, se não todos, do sangue é removido.
  6. Após a lavagem, resuspenque o tecido adiposo em 10 mL de solução de colagenase (0,1% colagenase tipo 1 em PBS). Sele o tubo firmemente com parafilm, depois incuba-o em um banho de água tremendo (37 °C, 80 rpm, por 45 min) até que o tecido seja quase homogêneo.
    NOTA: Evite a digestão completa do tecido (quando a solução se torna completamente homogênea com o desaparecimento completo de todos os resíduos/pedaços de tecido), pois afeta negativamente a cultura das células posteriormente. Normalmente, a digestão leva de 30 a 45 minutos.
  7. Uma vez que a digestão da colagemnase é feito, vórtice do tubo para 15 s, em seguida, centrífuga por 5 min a 300 x g. Vórtice o tubo novamente para 10 s, seguido por outra centrifugação de 5 min. Em seguida, serão observadas três camadas. Descarte cuidadosamente a camada de óleo, seguida pela camada aquosa, sem perturbar a pelota de fração vascular estromida (SVF).
    NOTA: Remova o supernatante contendo adipócitos e a solução de colagemnase. Primeiro, remova os adipócitos e a camada de óleo que acompanha com uma pipeta de 10 mL para garantir a remoção completa das gotículas de óleo e, em seguida, remova a camada aquosa por baixo.
  8. Resuspenque a pelota SVF na parte inferior do tubo em 10 mL de solução BSA estéril (1% de albumina, solução de fração V de soro bovino em PBS), depois centrifugar o tubo por 5 min a 300 x g.
  9. Após a centrifugação, descarte o supernascimento e suspenda a pelota SVF em 8,5 mL de mídia completa para Ad-MSCs (composta por dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mix F-12 [DMEM/F12] complementada com 10% de FBS, Penicilina U/mL 100 U/mL, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL anfotericina B e 2 mM L-glutamina).
  10. Cultue as células em um frasco de25 cm 2 a 37 °C abaixo de 5% de CO2. No dia seguinte, verifique as células anexadas, remova as células suspensas e substitua a mídia. Depois, mude a mídia dia não.
  11. Passagem as células a cada 5-7 dias quando elas são 80%-90% confluentes usando Trypsin-EDTA. Use células entre as passagens 3-5 para os experimentos subsequentes descritos neste protocolo. Uma apresentação esquemática de todas as etapas de isolamento é fornecida na Figura 1.
    NOTA: Normalmente, a potência trypisn-EDTA pode variar entre diferentes fornecedores, por isso tente minimizar o tempo de experimentação para evitar efeitos tóxicos nas células.

2. Caracterização de Ad-MSCs por imunofenofoteping utilizando análises de citometria de fluxo

  1. Na passagem 3, divida as células usando Trypsin-EDTA. Lave com PBS 2 vezes e conte as células com um hemótmetro.
  2. Incubar 100.000 células a 4 °C no escuro por 20 min com cd90 ou CD105 (marcadores mesenquimais) ou anticorpo monocloiético CD34 (marcador hematopoiético) rotulado com fluoresceína-isothiocyanato (FITC).
  3. Lave as células e suspenda-as em 500 μL de tampão FACS. Análise por citometria de fluxo25.

3. Avaliação do potencial de diferenciação de Ad-MSCs isolados em várias linhagens mesenquimais

  1. Diferenciação adipogênica
    1. Resuspend as células em mídia completa (como descrito na etapa 1.9.), em seguida, cultura as células a uma densidade de 3,7 x 104 células/bem em uma placa de cultura tecidual de 24 poços. Incubar a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2. Em seguida, mude a mídia a cada 3 dias até que as células atinjam quase 100% de confluência, o que geralmente leva 3 dias.
    2. Quando as células atingirem a confluência desejada, substitua a mídia de proliferação pelo media de diferenciação adipogênica (consistindo de mídia LG-DMEM complementada com 10% de FBS, Penicilina U/mL 100 μg/mL, 0,25 μg/mL de anfonotericina B e 2 mM L-glutamina com suplemento adipogênico 1x, fornecido com o Kit de Identificação Funcional de Células-Tronco Mesenquimal) para induzir adipogenese. Em seguida, mude a mídia a cada 3 dias (0,5 mL/well). Tome cuidado para realizar a substituição da mídia suavemente para não interromper os vacuoles lipídes.
    3. Após 21 dias, avalie a diferenciação adipogênica por exame microscópico da aparência de vacuoles lipídicos e pela coloração do Vermelho-Óleo.
    4. Prepare uma solução de estoque de Óleo Vermelho dissolvendo 30 mg de mancha vermelha de óleo em 10 mL de isopropanol, e depois mantenha-a por pelo menos 20 minutos em temperatura ambiente. Depois, prepare uma solução de trabalho misturando 3 peças de solução de estoque com 2 peças de água dupla destilada (ddH2O), misture-as bem e mantenha-a por 10 minutos à temperatura ambiente, depois depois depois por papel filtro.
    5. Para documentar a diferenciação adipogênica, lave as células 2 vezes com PBS e, em seguida, fixe-as usando formalina tamponada neutra 10% (0,75 ml/bem) por 15 minutos. Depois disso, lave as células 2 vezes com PBS usando 1 mL/poço e incuba as células por 5 minutos cada vez. É importante aspirar completamente o PBS antes de adicionar a solução de trabalho Oil Red.
    6. Após a última lavagem, adicione a solução de trabalho Oil Red às células e incuba-as por 60 min a 37 °C. Depois, remova a solução de manchas e lave suavemente as células 2 vezes com PBS. Observe as gotículas lipídicas manchadas sob o microscópio.
  2. Diferenciação osteogênica
    1. Semente 7,4 x 103 células/bem (0,5 mL médio/bem) em uma placa de 24 poços e incuba-las a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 em mídia completa (como descrito na etapa 1.9.) por 3 dias para atingir quase 70% de confluência.
    2. Induzir as células com o suplemento osteogênico (fornecido com o kit) em mídia LG-DMEM suplementada com 10% de FBS, penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL amphoterina B e 2 mM L-glutamina.
    3. Continue a indução osteogênica por 21 dias, mudando a mídia de diferenciação a cada 3 dias.
    4. Prepare uma solução de trabalho da mancha Alizarin Red S dissolvendo 200 mg de mancha De Alizarin Em 9 mL de ddH2O, e depois ajuste o pH para 4.1-4.3 usando hidróxido de amônio e HCl. Em seguida, compor o volume para 10 mL por ddH2O. Na sequência, remova quaisquer precipitados por filtragem usando papel filtro.
    5. Lave as células 2 vezes com PBS e, em seguida, fixe-as usando formalina 10% tamponada (0,75 mL/bem) por 15 minutos. Depois, lave as células 2 vezes usando PBS (1 mL/well). Cada vez, incuba as células por 5 minutos.
    6. Incubar as células fixas com a solução Alizarin-Red S preparada de 2% para 30 min em uma incubadora de 37 °C.
    7. Depois disso, remova a solução de manchas, lave as células 2 vezes com ddH2O e uma vez com PBS, e então observe a matriz extracelular rica em cálcio manchada para avaliar a diferenciação osteogênica sob o microscópio.
  3. Diferenciação condrogênica
    1. Sementes 7,4 x 103 células/bem (0,5 mL médio/bem) em uma placa de 24 poços e incuba-las a 37 °C em uma atmosfera umidificada de 5% de CO2 em mídia completa (como descrito na etapa 1.9.) por 3 dias para atingir quase 70% de confluência.
    2. Quando a confluência desejada for alcançada, induza a diferenciação condrogênica das células com DMEM/F12 sem soro contendo selênio de insulina-transferrina (ITS), suplemento condrogênico (fornecido com o kit), penicilina u/mL 100, Estreptomicina 100 μg/mL, 0,25 μg/mL de anfotericina B e 2 mM L-glutamina21.
    3. Incubar as células com a mídia condrogênica por 21 dias, alterando a mídia de diferenciação condrogênica a cada 3 dias.
    4. Prepare uma solução de trabalho da mancha Alcian Blue 8GX da seguinte forma: Primeiro, prepare uma solução de ácido acético glacial de 3% em ddH2O adicionando 3 mL de ácido acético glacial a 97 mL de ddH2O. Em seguida, prepare uma solução de trabalho da mancha Alcian Blue 8GX misturando 0,1 g em 100 mL de solução de ácido glacial de 3% e remova quaisquer precipitados por filtragem usando papel filtro.
    5. Lave as células 2 vezes com PBS e, em seguida, fixe-as usando formalina 10% tamponada (0,75 mL/bem) por 15 minutos. Depois, lave as células 2 vezes usando PBS (1 mL/well). Cada vez, incuba as células por 5 minutos.
    6. O próximo passo é incubar as células na mancha 8GX azul alciana preparada em 3% de ácido acético glacial por 60 min a 37 °C. Lave as células manchadas 2 vezes com ddH2O e uma vez com PBS, e então observe os proteoglicanos manchados sob o microscópio.

4. Diferenciação de Ad-MSCs em IPCs

  1. Na passagem 3, divida os Ad-MSCs usando Trypsin-EDTA. Primeiro, remova a mídia, depois lave as células enquanto ainda estiver presa no frasco de cultura com 5 mL de PBS. Em seguida, adicione 5 mL de Trypsin-EDTA ao frasco de 75 cm2 e incubar a 37 °C por 3-10 min.
    NOTA: Tente induzir as células em passagens precoces, geralmente entre P3-P5, pois passagens tardias afetam negativamente as propriedades das células e as habilidades de diferenciação17,24.
  2. Depois, inspecione as células para desprendimento e por ser uma suspensão unicelular. Adicione 5 mL de mídia DMEM/F12 completa ao frasco para inibir a ação de trypsin. Colete a suspensão da célula e transfira-a para um tubo de 15 mL e, em seguida, adicione mais 5 mL de mídia DMEM/F12 completa ao tubo.
  3. Centrifugar as células a 300 x g por 2 min para pelotar as células.
  4. Lave as células uma vez com PBS, centrífuga novamente a 300 x g por 2 min e, em seguida, resuspended a pelota de célula em 3-5 mL de mídia DMEM/F12 completa.
  5. Conte as células usando corante de exclusão azul trypan e um hemótmetro.
  6. Em seguida, semente as células em placas de 6 poços (1 x 106 células/placa) e uma placa de 12 poços (para ensaio GSIS; 1 x 106 células/placa) e incubar em uma incubadora de 37 °C, 5% CO2 em mídia completa (como descrito na etapa 1,9.) por 3 dias para atingir quase 90% de confluência.
  7. No dia da indução, remova a mídia, lave as células com PBS e, em seguida, pré-induza as células por 2 dias por mídia de pré-indução (DMEM/F12 complementado com 10% de FBS, Penicilina U/mL 100 μg/mL, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 2 mM L-glutamina, 10 mM de nicotinamida [NA]e 1mM β-mercaptoethanol [β-ME]).
  8. Induzir as células por mais 1 dia usando DMEM de alta glicose (HG-DMEM, 4,5g/L de glicose) suplementada com 2,5% FBS, penicilina U/mL, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL de anfotericina B, 2 mM L-glutamina, 10 mM NA e 1mM β merc-mercaptotanol. Coletar pelotas de células no final desta etapa (células D3 designadas neste protocolo).
  9. Incubar as células por mais 7 dias na mídia de indução de diferenciação final composta por HG-DMEM suplementada com 2,5% de FBS, Penicilina U/mL 100 U/mL, 100 μg/mL streptomicina, 0,25 μg/mL anfotericina B, 2 mM L-glutamina, 10 mM NA, 1mM β-mercaptoethanol e 10 nM exendin-4.
  10. Ao final do período especificado, colete pelotas celulares (denominadas Final neste protocolo) e avalie a diferenciação bem sucedida das células por manchas DTZ e ensaio GSIS, conforme segue neste protocolo.
  11. Avalie os IPCs gerados seguindo as etapas 5 e 6 abaixo.

5. Mancha de dithizone

  1. Prepare a solução de estoque de manchas dithizone (DTZ) da seguinte forma: Dissolva completamente 25 mg de DTZ em 2,5 mL de sulfóxido de dimetil (DMSO), divida em alíquotas e armazene a −20 °C no escuro até usar.
  2. Para coloração, prepare uma solução de trabalho 1:100 (volume/volume) diluindo a solução de estoque em meio de cultura completa (HG-DMEM complementada com 5% FBS, penicilina U/mL, 100 μg/mL estreptomicina, 0,25 μg/mL de anfoterina B e 2 mM L-glutina). Em seguida, filtre a solução de funcionamento através de um filtro de seringa de 0,2 μm.
  3. Em seguida, para as células de cultura de coloração DTZ especificadas em uma placa de 6 poços e, depois de aspirar a mídia cultural, lave as células uma vez com PBS e, em seguida, adicione 2 mL de solução de trabalho DTZ em cada poço. Incubar por pelo menos 2 h a 37 °C na incubadora de CO2 .
  4. Lave cuidadosamente as células 2 vezes com PBS. Após a última lavagem, adicione 2 mL de PBS em cada poço. Em seguida, observe os IPCs vermelhos vermelhos sob um microscópio invertido. Use Ad-MSCs não induzidos inicialmente cultivados em meio de crescimento completo (10% FBS - DMEM/F12) como controle.

6. Expressão genética de marcadores de células β por RT-qPCR

  1. Extração de RNA
    1. Após a diferenciação, colete as pelotas de célula e armazene-as a −80 °C até usar. Suspenda cada pelota celular (derivada dos seis poços de uma placa de 6 poços agrupadas) em 1 mL de reagente de extração de RNA de tiocianato de guanidium em um tubo sem nuclease de 1,5 mL, juntamente com tubulação para cima e para baixo várias vezes. Incubar as amostras diluídas à temperatura ambiente por 5 minutos para permitir a dissociação completa dos complexos de nucleoproteína.
    2. Adicione 200 μL de clorofórmio por 1 mL de reagente de extração de RNA, e tampar com segurança os tubos para serem vigorosamente agitados à mão por 15 s. Em seguida, incubar por 3 minutos em temperatura ambiente.
    3. Centrifugar as amostras a 13.800 x g por 15 min a 4 °C. Isso levará à separação da mistura em uma fase de clorofórmio inferior, uma interfase e uma fase aquosa superior incolor, com o RNA permanecendo na fase aquosa.
    4. Coloque a fase aquosa superior em um novo tubo, evitando cuidadosamente tocar na interfase.
    5. Adicione 600 μL de isopropanol de 100% à fase aquosa (volume 1:1), depois misture as amostras completamente por inversão 25 vezes e incubar à temperatura ambiente por 10 minutos.
    6. Centrifugar as amostras a 18.800 x g por 30 min a 4 °C. O RNA precipitado forma uma pequena pelota em gel no lado do tubo.
    7. Retire o supernatante e lave as pelotas com 1 mL de 80% de etanol gelado. Depois de adicionar o etanol, conduz lentamente a tubulação múltipla da pelota de RNA para 10 s.
    8. Centrifugar as amostras por 5 min a 9.600 x g a 4 °C. Descarte o supernatante e deixe as pelotas de RNA secas por 5-10 minutos.
    9. Após a secagem, dissolva as pelotas de RNA em 25-100 μL de água sem RNase (de acordo com o tamanho inicial da pelota) ao esbotoar várias vezes até a solubilização completa em tubos livres de nuclease de 1,5 mL. Evite a secagem excessiva da pelota de RNA.
      NOTA: Normalmente, a pelota fica transparente quando seca. No entanto, uma vez que esteja claro, prontamente resususpensá-lo para evitar o ressecamento excessivo da pelota.
    10. Quantifique o RNA determinando as densidades ópticas (OD) a 260 nm e 280 nm, usando água sem nuclease como em branco.
    11. Certifique-se de que as amostras tenham OD260/OD280 = 1,8-2,0.
  2. Síntese cDNA
    1. Síntese cDNA do RNA total isolado usando um kit de síntese cDNA.
    2. Realize a reação de síntese cDNA de acordo com as instruções do fabricante. Em um tubo PCR de 200 μL, adicione um volume de solução RNA contendo 0,5 μg de RNA total ao mix mestre de reação mostrado na Tabela 1.
    3. Depois de adicionar o RNA ao mix mestre, insira a mistura através de um programa de ciclismo de 50 °C por 30 minutos para um ciclo, seguido por um ciclo de inativação de 95 °C por 2 min, utilizando um cicloviário térmico.
    4. Diluir o cDNA usando água sem nuclease para uma concentração final de 2 ng/μL. Armazene a −20 °C para RT-qPCR subsequente.
  3. RT-qPCR usando SYBR Green Master Mix
    1. Realize a reação RT-qPCR para cada gene alvo usando o modelo cDNA de acordo com a mistura de reação mostrada na Tabela 2. Faça todas as medidas em triplicados.
    2. Os conjuntos de primers utilizados são mostrados na Tabela 3. Realize todos os procedimentos RT-qPCR no gelo.
    3. Realize a reação RT-qPCR usando uma máquina PCR em tempo real nas configurações padrão do programa. As condições térmicas de ciclismo incluíram desnaturação inicial de 95 °C por 10 min, seguida por 45 ciclos de desnaturação (95 °C, 15 s) e ressarem/extensão combinadas (60 °C, 1 min).
    4. Determine os valores Ct e detecte os níveis de expressão de acordo com 2-ΔΔCt, com β-actin como um controle interno.

mistura mestre de síntese cDNAVolume (μl)
Tampão de síntese cDNA de 5x4
dNTP2
Primer RNA1
Mistura de enzimas verso1
Melhorador de RT1
Água livre de nucleaseVariável
Total RNAVariável
Volume total de reação20

Tabela 1: síntese cDNA de volumes de mixagem mestre.

Mistura de reação RT-qPCRVolume (μl)Concentração final em 10 μL
cDNA22 ng/well
Primer RT-qPCR Forward (3 μM)1300 nM
Primer reverso RT-qPCR (3 μM)1300 nM
Água livre de nuclease1-------
2x SYBR Green master mix51x
Volume total de reação10

Tabela 2: Mistura de reação RT-qPCR.

GenePrimer para a frentePrimer reverso
FOXA2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAAACCACTG
PDX-1ATCCACCTCCCGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
NKX6.1ACACCAGACCCACATTCTCCGATCTCGGCTGCGTCTTCTT
MafATTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC
Ins-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-actinTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

Tabela 3: Sequências de primer para frente e para trás.

7. Secreção de insulina estimulada por glicose

  1. Preparação do buffer de bicarbonato Ringer (KRB) da Kreb
    1. Prepare a solução tampão de bicarbonato ringer (KRB) da Kreb com as concentrações de glicose de 2 mM (baixa glicose) e 20 mM de glicose (alta glicose) para o ensaio de secreção de insulina estimulada pela glicose (GSIS). Os componentes utilizados para a preparação do buffer KRB são fornecidos na Tabela 4.
    2. Ajuste o pH do buffer usando 1 N HCl para cerca de 7,25-7,35 (ou seja, 0,1-0,2 unidades abaixo do pH 7.4 desejado, pois pode subir durante a filtragem).
    3. Adicione a albumina de soro bovino (BSA) recentemente em uma concentração de 0,1 % (peso/volume).
    4. Adicione glicose depois (18 mgs para 50 mL de KRB para preparar o tampão de KRB de baixa glicose de 2 mM, e 180 mgs para 50 mL de KRB para preparar o tampão de 20 mM de alta glicose KRB).
    5. Esterilize os buffers LG e HG KRB preparados por filtragem através de um filtro de seringa de 0,2 μm para estar pronto para o ensaio GSIS.
  2. Ensaio GSIS
    1. Inicialmente semente 1 x 105 células/poço em uma placa de cultura celular de 12 poços e induzir essas células usando exatamente o mesmo protocolo de indução de diferenciação.
    2. No final do protocolo de indução, lave suavemente os IPCs gerados (na placa) 2 vezes com PBS e uma vez com LG-KRB.
    3. Depois, incubar os IPCs com 300 μL de LG-KRB/well por 1 h e, em seguida, descartar este buffer.
    4. Em seguida, incubar os IPCs com 300 μL de 2 mM (LG) ou 20 mM (HG) tampão KRB por mais 1h. Ao final do período de incubação, colete o supernascido e armazene a −80 °C para o ensaio subsequente de insulina secretado usando um kit ELISA comercial e seguindo as instruções do fabricante.
      NOTA: Tente ser o mais suave possível ao aspirar ou adicionar o buffer PBS e KRB ao realizar o ensaio GSIS.
ComponenteConcentração
Cloreto de Magnésio (Anidra)0,0468 g/L
Cloreto de potássio0,34 g/L
Cloreto de sódio7,00 g/L
Fosfato de sódio Dibásico (Anidrous)0,1 g/L
Monobásico fosfato de sódio (Anidrous)0,18 g/L
Bicarbonato de sódio1,26 g/L
Cloreto de Cálcio0,2997 g/L

Tabela 4: Os componentes utilizados para a preparação do buffer KRB.

8. Análise estatística

  1. Expresse todos os dados como ± erro padrão da média (SEM). Todas as comparações foram feitas utilizando-se análise unidirecional de variância (ANOVA) e teste pós-hoc de Tukey usando software estatístico. Os resultados com valores p **p ≤ 0,01 e *p ≤ 0,05 foram considerados estatisticamente significativos.

Resultados

Isolamento e caracterização de Ad-MSCs
Como mostrado na Figura 2, as células isoladas do tecido adiposo mostraram uma população heterogênea de células arredondadas e semelhantes a fibroblastos a partir do dia seguinte de isolamento (Figura 2A). 4 dias após o isolamento, as células do fibroblasto começaram a aumentar em número e tamanho e crescer como uma população homogênea pela passagem 1 (Figura 2B,C

Discussão

Neste protocolo, conseguimos apresentar um protocolo detalhado para o isolamento dos Ad-MSCs da gordura epidídica de ratos e a diferenciação desses Ad-MSCs em IPCs. De fato, a gordura epidídimal de rato é uma fonte facilmente atingível de tecido adiposo para a obtenção de Ad-MSCs e não requer nenhum equipamento especial, nem para coleta nem para processamentode 15,26,27. Os Ad-MSCs isolados apresentaram excelente expans...

Divulgações

Todos os coautores não declaram conflito de interesses associados a este trabalho.

Agradecimentos

Reconhecemos a Dra. Rawda Samir Mohamed, MSc, Especialista Em Veterinária, Faculdade de Farmácia da Universidade Britânica do Egito (BUE) por ajudar na dissecação dos ratos.

Também gostaríamos de reconhecer e apreciar os esforços da Faculdade de Comunicação de Massa, a Universidade Britânica no Egito (BUE) para a produção e edição do vídeo deste manuscrito.

Gostaríamos de agradecer à Srta. Fatma Masoud, MSc, Professora Assistente de Inglês, Universidade Britânica no Egito (BUE) pela revisão e revisão da língua inglesa do manuscrito.

Este trabalho foi parcialmente financiado pelo Center for Drug Research and Development (CDRD), Faculdade de Farmácia, Universidade Britânica no Egito (BUE), Cairo, Egito.

Materiais

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin, bovine serum Fraction VMP Biomedicals
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
Ammonium hydroxideFisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITCStem Cell Technologies60024FI
Bovine serum albuminSigma AldrichA3912
Calcium ChlorideFisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITCThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAMA1-19594
CD34 Polyclonal AntibodyThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAPA5-85917
ChloroformFisher Scientific, USA
Collagenase type I, powderGibco, Thermo Fisher, USA17018029
D-Glucose anhydrous, extra pureFisher Scientific, GermanyG/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific, GermanyBP231-100
Dithizone stainingSigma-Aldrich, USAD5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/LLonza, Switzerland12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/LLonza, Switzerland12-707F
DMEM/F12 mediumLonza, SwitzerlandBE12-719F
DNAse/RNAse free waterGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology gradeSigma-Aldrich, Germany24103
Exendin-4Sigma-Aldrich, GermanyE7144
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brazil10270-106
Formaldehyde 37%Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl)Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology gradeFisher Scientific, USABP2618500
L-GlutamineGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kitR&D systems Inc., MN, USASC006
NicotinamideSigma-Aldrich, GermanyN0636
Oil Red StainSigma-Aldrich, USAO0625
Penicillin-Streptomycin-AmphotericinGibco Thermo Fisher, USA15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/MgLonza, SwitzerlandBE17-516F
Potassium ChlorideFisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA KitCloud-Clone Corp., USACEA682Ra
Sodium BicarbonateFisher Scientific, Germany
Sodium ChlorideFisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
SYBR Green MaximaThermo Scientific, USAK0221
Syringe filter, 0.2 micronCorning, USA431224
TRIzolThermo Scientific, USA15596026
Trypan blueGibco Thermo Fisher, USA15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1XLonza, SwitzerlandCC-5012
Verso cDNA synthesis kitThermo Scientific, USAAB-1453/A
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich, GermanyM3148

Referências

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