JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (Ad-MSC), могут быть потенциальным источником МСК, которые дифференцируются в инсулин-продуцирующие клетки (IPC). В этом протоколе мы предоставляем подробные шаги для выделения и характеристики ad-MSC придатка яичка крыс, за которым следует простой, короткий протокол для генерации IPC из тех же крыс Ad-MSC.

Аннотация

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), особенно те, которые выделены из жировой ткани (Ad-MSC), привлекли особое внимание как возобновляемый, обильный источник стволовых клеток, который не представляет никаких этических проблем. Однако современные методы изоляции Ad-MSC не стандартизированы и используют сложные протоколы, требующие специального оборудования. Мы выделили Ad-MSC из эпидидимального жира крыс Sprague-Dawley, используя простой, воспроизводимый метод. Изолированные Ad-MSC обычно появляются в течение 3 дней после изоляции, так как адгезивные клетки демонстрируют фибробластную морфологию. Эти клетки достигают 80% слияния в течение 1 недели после изоляции. Затем, при прохождении 3-5 (P3-5), была проведена полная характеристика для изолированных Ad-МСК путем иммунофенотипирования для характерного кластера MSC поверхностных маркеров дифференцировки (CD), таких как CD90, CD73 и CD105, а также индуцирование дифференцировки этих клеток вниз по остеогенным, адипогенным и хондрогенным линиям. Это, в свою очередь, подразумевает мультипотентность изолированных клеток. Кроме того, мы индуцировали дифференцировку изолированных Ad-MSC в сторону линии инсулин-продуцирующих клеток (IPC) с помощью простого, относительно короткого протокола путем включения модифицированной среды Eagle с высоким содержанием глюкозы Dulbecco (HG-DMEM), β-меркаптоэтанола, никотинамида и эксендина-4. Дифференцировка IPC оценивалась генетически, во-первых, путем измерения уровней экспрессии специфических β-клеточных маркеров, таких как MafA, NKX6.1, Pdx-1 и Ins1, а также окрашивания дитизоном для генерируемых IPC. Во-вторых, оценка также проводилась функционально с помощью глюкозо-стимулированной секреции инсулина (GSIS). В заключение, Ad-MSC могут быть легко изолированы, демонстрируя все критерии характеристики MSC, и они действительно могут обеспечить обильный, возобновляемый источник IPC в лаборатории для исследований диабета.

Введение

Мезенхимальные стволовые клетки (МСК), также известные как мезенхимальные стромальные клетки, являются одними из наиболее широко используемых типов клеток для регенеративной медицины 1,2. Они классифицируются как взрослые стволовые клетки и характеризуются многолинейным дифференцирующим потенциалом и способностью к самообновлению3. МСК могут быть выделены и получены из различных источников, включая жировую ткань, костный мозг, периферическую кровь, пуповинную ткань и кровь, волосяные фолликулы и зубы 4,5.

Выделение стволовых клеток из жировой ткани рассматривается как привлекательное и перспективное из-за их легкого доступа, быстрого расширения in vitro и высокого выхода6. Мезенхимальные стволовые клетки, полученные из жировой ткани (Ad-MSC), могут быть выделены из различных видов, таких как люди, коровы, мыши, крысы и, в последнее время, козы7. Было доказано, что Ad-MSC в настоящее время являются потенциальными кандидатами на тканевую инженерию и генно-клеточную терапию, которые могут быть даже использованы для разработки аутологичной альтернативы для долгосрочного восстановления повреждения мягких тканей или дефектов 7,8.

Международное общество клеточной и генной терапии (ISCT) определило три минимальных критерия, которые должны быть выставлены МСК для полной характеристики9. Во-первых, они должны быть пластиковыми. Во-вторых, МСК должны экспрессировать поверхностные маркеры мезенхимальных стволовых клеток, такие как CD73, CD90 и CD105, и не иметь экспрессии гемопоэтических маркеров CD45, CD34, CD14 или CD11b, CD79α или CD19 и HLA-DR. Наконец, МСК должны проявлять способность дифференцироваться в три мезенхимальные линии: адипоциты, остеоциты и хондроциты. Интересно, что МСК могут также дифференцироваться в другие линии, такие как нейронные клетки, кардиомиоциты, гепатоциты и эпителиальные клетки10,11.

Фактически, МСК обладают уникальными свойствами, которые позволяют применять их в качестве потенциальных терапевтических средств в регенеративной терапии различных заболеваний. МСК могут секретировать растворимые факторы, чтобы индуцировать иммуномодулирующую среду, которая обеспечивает терапевтические преимущества12. Кроме того, МСК могут мигрировать в места повреждения и микроокружения опухоли для проведения таргетной терапии; однако механизмы не полностью выяснены13. Кроме того, МСК обладают способностью секретировать экзосомы, внеклеточные везикулы в наномасштабе, которые несут груз некодирующих РНК, белка и растворимых факторов, которые в последнее время появились как новый механизм терапевтического потенциала МСК при различных заболеваниях14.

Что еще более важно, МСК привлекли заметное внимание к их способности дифференцироваться в инсулин-продуцирующие клетки (IPC) либо путем генетической модификации 15,16, либо путем использования различных внешних индуцирующих факторов в культуральной среде in vitro17. Период индукции IPC сильно варьируется, так как он зависит от используемого протокола индукции и используемых внешних факторов. Процесс дифференцировки может длиться от нескольких дней до месяцев, и он требует комбинации экзогенно-индуцирующих факторов, которые должны быть добавлены и / или выведены на разных стадиях. Многие из этих факторов, которые использовались для эндокринной дифференцировки поджелудочной железы, являются биологически активными соединениями, которые, как было показано, способствуют пролиферации или дифференцировке/неогенезу инсулин-секретирующих β-клеток и/или увеличивают содержание инсулина в IPC 18,19,20,21. Здесь также примечательно, что МСК также, как сообщается, оказывают терапевтическое действие при диабете и его осложнениях через несколько механизмов, включая их секретом, а также широкий спектр иммуномодулирующих действий 22,23,24.

В этом протоколе мы представляем подробный пошаговый протокол для выделения и характеристики Ad-MSC из эпидидимального жира крыс, за которым следует простой, относительно короткий протокол для генерации IPC из Ad-MSC.

протокол

Все эксперименты проводились в соответствии с утвержденными руководящими принципами, а все процедуры были одобрены Этическим комитетом фармацевтического факультета Британского университета в Египте (BUE), Каир, Египет. Протокол изоляции Ad-MSC был принят у Лопеса и Спенсера с изменениями15.

1. Выделение Ad-MSC из жировых подушечек придатка яичка крыс

  1. Используют самцов крыс Sprague-Dawley массой 250-300 г, которым не более 1 месяца (по два на выделение). Обезболивают животных, затем усыпляют их при вывихе шейки матки. Опрыскивайте усыпленное животное 70% этанолом. Иссекните кожу и мышцы в нижней части живота, а затем вытащите два яичка, чтобы обнажить жировые подушечки придатка яичка.
  2. Аккуратно отрежьте жировые подушечки придатка яичка и будьте осторожны, чтобы не перерезать кровеносные сосуды.
  3. Изолируйте жировую ткань, окружающую придаток яичка, затем поместите ее в чашку Петри, содержащую фосфатно-буферный физиологический раствор (PBS).
  4. В шкафу биобезопасности разрежьте эти жировые подушечки на мелкие кусочки с помощью щипцов и скальпеля. Переложите эти разрезанные кусочки жировой ткани в центрифужную трубку объемом 50 мл, содержащую 10 мл стерильного PBS.
  5. Промывайте измельченные жировые ткани 5 раз 10 мл PBS каждый раз, чтобы удалить загрязняющую кровь. Следующие промывочные процедуры должны быть тщательно проведены.
    1. Добавьте 10 мл PBS в ткань и тщательно перемешайте в течение 45 с. Затем дайте ткани осесть под действием силы тяжести, удерживая трубку в течение 5 минут, чтобы разделиться на два слоя.
    2. Аспирируйте PBS из инфранатанта с помощью шприца 10 мл и замените свежими 10 мл PBS для другой стирки.
    3. Повторите этот этап промывки 4-5 раз, пока PBS не очистится от крови. Это указывает на то, что большая часть, если не вся, кровь удаляется.
  6. После промывания повторно суспендируют жировую ткань в 10 мл раствора коллагеназы (0,1% коллагеназы типа 1 в PBS). Плотно запечатайте трубку парапленкой, затем высиживайте ее на встряхивающей водяной бане (37 °C, 80 об/мин, в течение 45 мин) до тех пор, пока ткань не станет почти однородной.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Избегайте полного переваривания ткани (когда раствор становится полностью однородным с полным исчезновением всех тканевых остатков / кусочков), потому что это отрицательно влияет на культивирование клеток впоследствии. Обычно пищеварение занимает 30-45 мин.
  7. Как только переваривание коллагеназы будет завершено, вращайте трубку в течение 15 с, затем центрифугируйте в течение 5 минут при 300 х г. Снова вихрьте трубку в течение 10 с, затем еще 5 минут центрифугирования. Затем будут наблюдаться три слоя. Осторожно отбросьте масляный слой, а затем водный слой, не нарушая гранулу стромальной сосудистой фракции (SVF).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Удалите супернатант, содержащий адипоциты и раствор коллагеназы. Сначала удалите адипоциты и сопутствующий масляный слой пипеткой 10 мл, чтобы обеспечить полное удаление капель масла, затем удалите нижний водный слой.
  8. Повторно суспендируют гранулу SVF на дне пробирки в 10 мл стерильного раствора BSA (1% альбумин, раствор фракции V бычьей сыворотки в PBS), затем центрифугируют пробирку в течение 5 мин при 300 х г.
  9. После центрифугирования отбросьте супернатант и суспендируйте гранулу SVF в 8,5 мл полной среды для Ad-MSC (в составе модифицированной среды Eagle Medium/питательной смеси F-12 [DMEM/F12] от Dulbecco, дополненной 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B и 2 мМ L-глутамина).
  10. Культивируйте клетки в колбу размером25 см2 при 37 °C при 5% CO2. На следующий день проверьте прикрепленные ячейки, удалите взвешенные ячейки и замените носитель. После этого меняйте СМИ через день.
  11. Пропускают клетки каждые 5-7 дней, когда они на 80%-90% сливаются с помощью трипсина-ЭДТА. Используйте клетки между проходами 3-5 для последующих экспериментов, описанных в этом протоколе. Схематическое представление всех этапов изоляции приведено на рисунке 1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно эффективность Триписн-ЭДТА может варьироваться у разных поставщиков, поэтому старайтесь минимизировать время трипсинизации, чтобы избежать токсического воздействия на клетки.

2. Характеристика Ad-МСК методом иммунофенотипирования с использованием анализа проточной цитометрии

  1. В проходе 3 расщепляют клетки с помощью трипсина-ЭДТА. Промыть PBS 2 раза, а затем подсчитать клетки гемоцитометром.
  2. Инкубировать 100 000 клеток при 4 °C в темноте в течение 20 мин с помощью мышиного анти-крысиного CD90 или CD105 (мезенхимальные маркеры) или CD34 (гемопоэтический маркер) моноклонального антитела, меченного флуоресцеин-изотиоцианатом (FITC).
  3. Промыть клетки и суспендировать их в 500 мкл буфера FACS. Анализ методом проточной цитометрии25.

3. Оценка потенциала дифференциации изолированных Ad-MSC в различные мезенхимальные линии

  1. Адипогенная дифференциация
    1. Повторно суспендируют клетки в полной среде (как описано на этапе 1.9.), затем культивируют клетки с плотностью 3,7 х 104 клеток/лунку в 24-луночной тканевой культуральной пластине. Инкубировать при 37 °C во увлажненной атмосфере с содержанием 5% CO2. Далее меняйте среду каждые 3 дня, пока клетки не достигнут почти 100% слияния, что обычно занимает 3 дня.
    2. Когда клетки достигнут желаемого слияния, замените пролиферационную среду адипогенной дифференцировкой (состоящей из среды LG-DMEM, дополненной 10% FBS, 100 Ед / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина B и 2 мМ L-глутамина с 1x адипогенной добавкой, поставляемой с набором функциональной идентификации мезенхимальных стволовых клеток), чтобы индуцировать адипогенез. Затем меняйте носитель каждые 3 дня (0,5 мл/колодец). Позаботьтесь о том, чтобы аккуратно выполнить замену среды, чтобы не нарушить липидные вакуоли.
    3. Через 21 день оценить адипогенную дифференцировку путем микроскопического исследования внешнего вида липидных вакуолей и окрашивания масляным красным цветом.
    4. Приготовьте бульонный раствор Oil Red, растворив 30 мг масляного красного пятна в 10 мл изопропанола, а затем выдержите его не менее 20 мин при комнатной температуре. После этого подготовьте рабочий раствор, смешав 3 части исходного раствора с 2 частями двойной дистиллированной воды (ddH2O), хорошо перемешайте их и выдержите в течение 10 минут при комнатной температуре, а затем процедите фильтровальной бумагой.
    5. Чтобы задокументировать адипогенную дифференцировку, промыть клетки 2 раза PBS, затем зафиксировать их с помощью нейтрально-буферного формалина 10% (0,75 мл / хорошо) в течение 15 мин. После этого промывайте клетки 2 раза PBS, используя 1 мл / лунку и инкубируйте клетки в течение 5 минут каждый раз. Важно полностью аспирировать PBS перед добавлением рабочего раствора Oil Red.
    6. После последней промывки добавьте к клеткам рабочий раствор Oil Red и инкубируйте их в течение 60 мин при 37 °C. После этого удалите раствор для пятен и аккуратно промойте клетки 2 раза PBS. Наблюдайте за окрашенными липидными каплями под микроскопом.
  2. Остеогенная дифференциация
    1. Семена 7,4 х 103 клетки/лунка (0,5 мл среды/лунки) в 24-луночной пластине и инкубируют их при 37°С в увлажненной атмосфере 5% CO2 в полной среде (как описано на стадии 1,9.) в течение 3 дней до достижения почти 70% сливаемости.
    2. Индуцировать клетки остеогенной добавкой (поставляемой с набором) в среде LG-DMEM, дополненной 10% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B и 2 мМ L-глутамина.
    3. Продолжают остеогенную индукцию в течение 21 дня, меняя дифференцировальные среды каждые 3 дня.
    4. Готовят рабочий раствор окрашивания Alizarin Red S путем растворения 200 мг пятна Alizarin Red S в 9 мл ddH2O, а затем регулируют рН до 4,1-4,3 с помощью гидроксида аммония и HCl. Далее восполняем объем до 10 мл на ddH2O. После этого удалите все осадки путем фильтрации с помощью фильтровальной бумаги.
    5. Промыть клетки 2 раза PBS, затем зафиксировать их с помощью 10% буферизованного формалина (0,75 мл/лунка) в течение 15 мин. После этого промыть клетки 2 раза, используя PBS (1 мл / хорошо). Каждый раз инкубируйте клетки в течение 5 мин.
    6. Инкубировать фиксированные клетки приготовленным 2% раствором Alizarin-Red S в течение 30 мин в инкубаторе с температурой 37 °C.
    7. После этого удаляют пятно раствором, промывают клетки 2 раза с ddH2Oи один раз с PBS, а затем наблюдают за окрашенным богатым кальцием внеклеточным матриксом для оценки остеогенной дифференцировки под микроскопом.
  3. Хондрогенная дифференциация
    1. Семена 7,4 х 103 клеток/лунка (0,5 мл среды/лунки) в 24-луночной пластине и инкубируют их при 37°С в увлажненной атмосфере 5% CO2 в полной среде (как описано на стадии 1,9.) в течение 3 дней для достижения почти 70% сливаемости.
    2. Когда желаемое слияние достигнуто, индуцируют хондрогенную дифференцировку клеток с помощью бессывороточного DMEM/F12, содержащего инсулин-трансферриновый селен (ITS), хондрогенную добавку (поставляется с набором), 100 Ед/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B и 2 мМ L-глутамина21.
    3. Инкубируют клетки с хондрогенными средами в течение 21 дня, при этом изменяя хондрогенные дифференцировочные среды каждые 3 дня.
    4. Приготовьте рабочий раствор пятна Alcian Blue 8GX следующим образом: Сначала приготовьте 3% раствор ледниковой уксусной кислоты в ddH2O, добавив 3 мл ледниковой уксусной кислоты к 97 мл ddH2O. Затем готовят рабочий раствор пятна Alcian Blue 8GX, смешивая 0,1 г в 100 мл 3% раствора ледниковой кислоты, и удаляют любые осадки фильтрацией с помощью фильтровальной бумаги.
    5. Промыть клетки 2 раза PBS, затем зафиксировать их с помощью 10% буферизованного формалина (0,75 мл/лунка) в течение 15 мин. После этого промыть клетки 2 раза, используя PBS (1 мл / хорошо). Каждый раз инкубируйте клетки в течение 5 мин.
    6. Следующим этапом является инкубация клеток в приготовленном 0,1% алциановом синем пятне 8GX в 3% ледниковой уксусной кислоте в течение 60 мин при 37 °C. Промыть окрашенные клетки 2 раза с ddH2Oи один раз с PBS, а затем наблюдать окрашенные сульфатированные протеогликаны под микроскопом.

4. Дифференциация Ad-MSC на IPC

  1. В отрывке 3 разделите Ad-MSC с помощью Trypsin-EDTA. Сначала удалите среду, затем промывайте клетки, все еще прикрепленные в колбе для культивирования с 5 мл PBS. Далее добавляют 5 мл трипсина-ЭДТА в колбу объемом 75см2 и инкубируют при 37 °C в течение 3-10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь индуцировать клетки в ранних проходах, обычно между P3-P5, так как поздние проходы отрицательно влияют на свойства клеток и способности дифференцировки17,24.
  2. После этого осмотрите камеры на предмет отсоединения и на предмет однокамерной суспензии. Добавьте 5 мл полной среды DMEM/F12 в колбу, чтобы ингибировать действие трипсина. Соберите клеточную суспензию и переложите ее в трубку объемом 15 мл, а затем добавьте еще 5 мл полной среды DMEM/F12 в трубку.
  3. Центрифугируйте ячейки при 300 х г в течение 2 мин, чтобы гранулировать ячейки.
  4. Промыть ячейки один раз PBS, снова центрифугировать при 300 х г в течение 2 мин, а затем повторно суспендировать ячейку гранулы в 3-5 мл полной среды DMEM/F12.
  5. Подсчитайте клетки с помощью красителя для исключения трипан-синего цвета и гемоцитометра.
  6. Затем засевают клетки в 6-луночные пластины (1 х 106 ячеек/пластину) и 12-луночную пластину (для анализа GSIS; 1 х 106 клеток/пластину) и инкубируют в инкубаторе 37 °C, 5% CO2 в полной среде (как описано на этапе 1.9.) в течение 3 дней, чтобы достичь почти 90% слияния.
  7. В день индукции удалите среду, промывайте клетки PBS, а затем предварительно индуцируйте клетки в течение 2 дней с помощью прединдукционных сред (DMEM / F12, дополненный 10% FBS, 100 МД / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина B, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ никотинамида [NA] и 1 мМ β-меркаптоэтанола [β-ME]).
  8. Индуцируйте клетки в течение еще 1 дня, используя высокий уровень глюкозы DMEM (HG-DMEM, 4,5 г / л глюкозы), дополненный 2,5% FBS, 100 ЕД / мл пенициллина, 100 мкг / мл стрептомицина, 0,25 мкг / мл амфотерицина B, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ NA и 1 мМ β-меркаптоэтанола. Соберите клеточные гранулы в конце этой стадии (обозначенные D3-клетками в этом протоколе).
  9. Инкубируйте клетки в течение дополнительных 7 дней в окончательной индукционной среде дифференцировки, состоящей из HG-DMEM, дополненной 2,5% FBS, 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B, 2 мМ L-глутамина, 10 мМ NA, 1 мМ β-меркаптоэтанола и 10 нМ эксендина-4.
  10. В конце указанного периода собирают клеточные гранулы (названные Final в этом протоколе) и оценивают успешную дифференцировку клеток путем окрашивания DTZ и анализа GSIS, как указано в этом протоколе.
  11. Оцените сформированные МПК, выполнив шаги 5 и 6 ниже.

5. Окрашивание дитизоном

  1. Приготовьте раствор для окрашивания дитизона (ДТЗ) следующим образом: Полностью растворите 25 мг ДТЗ в 2,5 мл диметилсульфоксида (ДМСО), разделите на аликвоты и храните при −20 °C в темноте до использования.
  2. Для окрашивания готовят рабочий раствор 1:100 (объем/объем) путем разведения исходного раствора в полной питательной среде (HG-DMEM, дополненный 5% FBS, 100 ЕД/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина, 0,25 мкг/мл амфотерицина B и 2 мМ L-глутамина). Затем отфильтруйте рабочий раствор через шприцевый фильтр 0,2 мкм.
  3. Далее для указанного DTZ окрашивают клетки культуры в 6-луночную пластину и, после аспирации культуральной среды, промывают клетки один раз PBS, а затем добавляют 2 мл рабочего раствора DTZ в каждую лунку. Инкубировать в течение не менее 2 ч при 37 °C в инкубаторе CO2 .
  4. Тщательно промыть клетки 2 раза PBS. После последней промывки добавьте в каждую лунку по 2 мл PBS. Затем наблюдайте за малиновыми красными IPC под перевернутым микроскопом. Используйте в качестве контроля неиндуктивные Ad-MSC, первоначально культивируемые в полной среде роста (10% FBS - DMEM/F12).

6. Генная экспрессия маркеров β клеток с помощью RT-qPCR

  1. Экстракция РНК
    1. После дифференцировки соберите гранулы клеток и храните их при −80 °C до использования. Суспендировать каждую клеточную гранулу (полученную из шести лунок одной 6-луночной пластины, объединенной) в 1 мл реагента экстракции РНК гуанидия тиоцианата в трубке без нуклеазы объемом 1,5 мл вместе с пипеткой вверх и вниз несколько раз. Инкубируйте лизированные образцы при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы обеспечить полную диссоциацию нуклеопротеиновых комплексов.
    2. Добавьте 200 мкл хлороформа на 1 мл экстракционного реагента РНК и надежно закройте пробирки, чтобы их можно было энергично встряхнуть вручную в течение 15 с. Далее инкубировать в течение 3 мин при комнатной температуре.
    3. Центрифугирование образцов при 13 800 х г в течение 15 мин при 4 °C. Это приведет к разделению смеси на нижнюю хлороформную фазу, интерфазу и бесцветную верхнюю водную фазу, при этом РНК останется в водной фазе.
    4. Поместите верхнюю водную фазу в новую трубку, осторожно избегая прикосновения к интерфазе.
    5. Добавьте 600 мкл 100% изопропанола в водную фазу (объем 1:1), затем тщательно перемешайте образцы путем инверсии 25 раз и инкубируйте при комнатной температуре в течение 10 мин.
    6. Центрифугирование образцов при 18 800 х г в течение 30 мин при 4 °C. Осажденная РНК образует небольшую гелеобразную гранулу на стороне трубки.
    7. Удалите супернатант и промойте гранулы 1 мл 80% ледяного этанола. После добавления этанола медленно проводят многократное пипетирование гранулы РНК в течение 10 с.
    8. Центрифугируйте образцы в течение 5 мин при 9 600 х г при 4 °C. Выбросьте супернатант и оставьте гранулы РНК сушиться на воздухе в течение 5-10 мин.
    9. После высыхания растворяют гранулы РНК в 25-100 мкл неразо-свободной воды (в соответствии с исходным размером гранул) путем пипетки вверх и вниз несколько раз до полной солюбилизации в 1,5 мл безнуклеазных пробирок. Избегайте чрезмерного высыхания гранул РНК.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обычно гранула становится прозрачной при высыхании. Однако, как только он будет очищен, своевременно повторно суспендируйте его, чтобы избежать чрезмерной сухости гранулы.
    10. Количественное определение РНК путем определения оптических плотностей (OD) при 260 нм и 280 нм, используя воду без нуклеазы в качестве пустой.
    11. Убедитесь, что образцы имеют OD260/OD280 = 1.8-2.0.
  2. Синтез кДНК
    1. Синтезируйте кДНК из изолированной общей РНК с помощью набора синтеза кДНК.
    2. Проводят реакцию синтеза кДНК в соответствии с инструкциями производителя. В пробирке ПЦР объемом 200 мкл добавьте объем раствора РНК, содержащего 0,5 мкг общей РНК, к реакционной мастер-смеси, показанной в таблице 1.
    3. После добавления РНК в мастер-микс вводят смесь через циклическую программу 50 °C в течение 30 мин в течение одного цикла, затем цикл инактивации 95 °C в течение 2 мин, используя тепловой циклер.
    4. Разбавляют кДНК водой без нуклеазы до конечной концентрации 2 нг/мкл. Хранить при −20 °C для последующей RT-qPCR.
  3. RT-qPCR с использованием SYBR Green Master Mix
    1. Проводят реакцию RT-qPCR для каждого гена-мишени с использованием шаблона кДНК в соответствии с реакционной смесью, показанной в таблице 2. Сделайте все меры в трех экземплярах.
    2. Наборы используемых грунтовок приведены в таблице 3. Выполняйте все процедуры RT-qPCR на льду.
    3. Проводите реакцию RT-qPCR с помощью ПЦР-аппарата реального времени на настройках программы по умолчанию. Условия теплового цикла включали начальную денатурацию 95 °C в течение 10 мин, за которой следовали 45 циклов денатурации (95 °C, 15 с) и комбинированный отжиг/удлинение (60 °C, 1 мин).
    4. Определите значения Ct и определите уровни экспрессии в соответствии с 2-ΔΔCt, с β-актином в качестве внутреннего контроля.

Мастер-микс синтеза кДНКОбъем (мкл)
5x буфер синтеза кДНК4
дНТП2
Букварь РНК1
Смесь ферментов Verso1
Усилитель RT1
Вода без нуклеазыПеременная
Общая РНКПеременная
Общий объем реакции20

Таблица 1: Объемы мастер-микса синтеза кДНК.

Реакционная смесь RT-qPCRОбъем (мкл)Конечная концентрация в 10 мкл
кДНК22 нг/лунка
RT-qPCR Прямая грунтовка (3 мкМ)1300 нМ
Реверсивная грунтовка RT-qPCR (3 мкМ)1300 нМ
Вода без нуклеаз1-------
2x SYBR Зеленый мастер микс5в 1 раз
Общий объем реакции10

Таблица 2: Реакционная смесь RT-qPCR.

ГенГрунтовка впередОбратная грунтовка
ФОКСА2GAGCCGTGAAGATGGAAGGATGTTGCCGGAACCACTG
ПДХ-1ATCCACCTCCCGGACCTTTCCCTCCGGTTCTGCTGCGTAT
НКХ6.1ACACCAGACCCACATTCTCCGATCTCGGCTGCGTGCTTCTT
МафаTTCAGCAAGGAGGAGGTCATCCGCCAACTTCTCGTATTTC
Инс-1CACCTTTGTGGTCCTCACCTCTCCAGTGCCAAGGTCTGA
β-актинTGGAGAAGATTTGGCACCACAACACAGCCTGGATGGCTAC

Таблица 3: Последовательности прямых и обратных праймеров.

7. Глюкозо-стимулированная секреция инсулина

  1. Получение буфера бикарбоната Рингера Креба (KRB)
    1. Приготовьте буферный раствор бикарбоната Рингера Креба (KRB) с концентрациями глюкозы 2 мМ (низкий уровень глюкозы) и 20 мМ глюкозы (высокая глюкоза) для анализа секреции инсулина,стимулируемого глюкозой (GSIS). Компоненты, используемые для подготовки буфера KRB, приведены в таблице 4.
    2. Отрегулируйте рН буфера с помощью 1 Н HCl примерно до 7,25-7,35 (т.е. на 0,1-0,2 единицы ниже желаемого рН 7,4, поскольку он может повышаться во время фильтрации).
    3. Добавьте бычий сывороточный альбумин (BSA) в свежем виде в концентрации 0,1 % (масса/объем).
    4. После этого добавьте глюкозу (18 мг на 50 мл KRB для приготовления буфера KRB с низким содержанием глюкозы 2 мМ и 180 мг на 50 мл KRB для приготовления буфера KRB с высоким содержанием глюкозы 20 мМ).
    5. Стерилизуйте подготовленные буферы LG и HG KRB путем фильтрации через шприцевой фильтр 0,2 мкм, чтобы они были готовы к анализу GSIS.
  2. Анализ GSIS
    1. Первоначально сейте 1 х 105 клеток / лунку в 12-луночную пластину для культивирования клеток и индуцируйте эти клетки, используя точно такой же протокол индукции дифференцировки.
    2. В конце индукционного протокола аккуратно промыть сгенерированные IPC (в пластине) 2 раза PBS и один раз LG-KRB.
    3. После этого инкубируйте IPC с 300 мкл LG-KRB/лунку в течение 1 ч, а затем выбрасывайте этот буфер.
    4. Затем инкубируйте IPC с буфером KRB 300 мкл 2 мМ (LG) или 20 мМ (HG) KRB в течение дополнительного 1 часа. В конце инкубационного периода собирают супернатант и хранят при температуре −80 °C для последующего секретируемого инсулинового анализа с использованием коммерческого набора ИФА и в соответствии с инструкциями производителя.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь быть как можно более мягкими при аспирации или добавлении буфера PBS и KRB при выполнении анализа GSIS.
КомпонентКонцентрация
Магния хлорид (безводный)0,0468 г/л
Хлористый калий0,34 г/л
Хлорид натрия7,00 г/л
Фосфат натрия двухосновный (безводный)0,1 г/л
Фосфат натрия одноосновный (безводный)0,18 г/л
Бикарбонат натрия1,26 г/л
Хлорид кальция0,2997 г/л

Таблица 4: Компоненты, используемые для подготовки буфера КРБ.

8. Статистический анализ

  1. Выражайте все данные как среднее ± стандартной погрешности среднего значения (SEM). Все сравнения проводились с использованием одностороннего дисперсионного анализа (ANOVA) и пост-специального теста Туки с использованием статистического программного обеспечения. Результаты с p-значениями **p ≤ 0,01 и *p ≤ 0,05 были признаны статистически значимыми.

Результаты

Выделение и характеристика Рекламных МСК
Как показано на рисунке 2, изолированные клетки из жировой ткани показали гетерогенную популяцию округлых и фибробластоподобных клеток, начиная со следующего дня выделения (рисунок 2А). Через 4 дня посл...

Обсуждение

В этом протоколе нам удалось представить подробный протокол для выделения Ad-MSC из эпидидимального жира крыс и дифференциации этих Ad-MSC в IPC. Фактически, эпидимидмальный жир крысы является легкодоступным источником жировой ткани для получения Ad-MSC и не требует какого-либо специального об...

Раскрытие информации

Все соавторы заявляют об отсутствии конфликта интересов, связанного с данной работой.

Благодарности

Мы благодарим доктора Равду Самир Мохамед, магистратуру, ветеринарного специалиста фармацевтического факультета Британского университета Египта (BUE) за помощь в рассечении крыс.

Мы также хотели бы отметить и оценить усилия факультета массовых коммуникаций Британского университета в Египте (BUE) по производству и редактированию видео этой рукописи.

Мы хотели бы поблагодарить мисс Фатму Масуд, магистратуру, ассистента преподавателя английского языка, Британский университет в Египте (BUE) за пересмотр и вычитку рукописи на английском языке.

Эта работа была частично профинансирована Центром исследований и разработок лекарств (CDRD), фармацевтическим факультетом Британского университета в Египте (BUE), Каир, Египет.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Albumin, bovine serum Fraction VMP Biomedicals
Alcian Blue 8GXSigma-Aldrich, USAA3157
Alizarin Red SSigma-Aldrich, USAA5533
Ammonium hydroxideFisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITCStem Cell Technologies60024FI
Bovine serum albuminSigma AldrichA3912
Calcium ChlorideFisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITCThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAMA1-19594
CD34 Polyclonal AntibodyThermo Fisher Scientific, Invitrogen, USAPA5-85917
ChloroformFisher Scientific, USA
Collagenase type I, powderGibco, Thermo Fisher, USA17018029
D-Glucose anhydrous, extra pureFisher Scientific, GermanyG/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Fisher Scientific, GermanyBP231-100
Dithizone stainingSigma-Aldrich, USAD5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/LLonza, Switzerland12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/LLonza, Switzerland12-707F
DMEM/F12 mediumLonza, SwitzerlandBE12-719F
DNAse/RNAse free waterGibco Thermo Fisher, USA10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology gradeSigma-Aldrich, Germany24103
Exendin-4Sigma-Aldrich, GermanyE7144
Fetal Bovine Serum (FBS)Gibco Thermo Fisher, Brazil10270-106
Formaldehyde 37%Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl)Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology gradeFisher Scientific, USABP2618500
L-GlutamineGibco Thermo Fisher, USA25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kitR&D systems Inc., MN, USASC006
NicotinamideSigma-Aldrich, GermanyN0636
Oil Red StainSigma-Aldrich, USAO0625
Penicillin-Streptomycin-AmphotericinGibco Thermo Fisher, USA15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/MgLonza, SwitzerlandBE17-516F
Potassium ChlorideFisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA KitCloud-Clone Corp., USACEA682Ra
Sodium BicarbonateFisher Scientific, Germany
Sodium ChlorideFisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)Fisher Scientific, Germany
SYBR Green MaximaThermo Scientific, USAK0221
Syringe filter, 0.2 micronCorning, USA431224
TRIzolThermo Scientific, USA15596026
Trypan blueGibco Thermo Fisher, USA15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1XLonza, SwitzerlandCC-5012
Verso cDNA synthesis kitThermo Scientific, USAAB-1453/A
β-mercaptoethanolSigma-Aldrich, GermanyM3148

Ссылки

  1. Hmadcha, A., Martin-Montalvo, A., Gauthier, B. R., Soria, B., Capilla-Gonzalez, V. Therapeutic potential of mesenchymal stem cells for cancer therapy. Frontiers in Bioengineering and Biotechnology. 8, 43 (2020).
  2. Kamal, M., Kassem, D., Haider, K. H., Haider, K. H. Sources and therapeutic strategies of mesenchymal stem cells in regenerative medicine. Handbook of Stem Cell Therapy. , 1-28 (2022).
  3. Jiang, Y., et al. Pluripotency of mesenchymal stem cells derived from adult marrow. Nature. 418 (6893), 41-49 (2002).
  4. De Ugarte, D. A., et al. Differential expression of stem cell mobilization-associated molecules on multi-lineage cells from adipose tissue and bone marrow. Immunology Letters. 89 (2-3), 267-270 (2003).
  5. Mosna, F., Sensebe, L., Krampera, M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: A user's guide. Stem Cells and Development. 19 (10), 1449-1470 (2010).
  6. Camara, B. O. S., et al. Differentiation of canine adipose mesenchymal stem cells into insulin-producing cells: Comparison of different culture medium compositions. Domestic Animal Endocrinology. 74, 106572 (2021).
  7. Ren, Y., et al. Isolation, expansion, and differentiation of goat adipose-derived stem cells. Research in Veterinary Science. 93 (1), 404-411 (2012).
  8. Vallee, M., Cote, J. F., Fradette, J. Adipose-tissue engineering: Taking advantage of the properties of human adipose-derived stem/stromal cells. Pathologie Biologie. 57 (4), 309-317 (2009).
  9. Dominici, M., et al. Minimal criteria for defining multipotent mesenchymal stromal cells. The International Society for Cellular Therapy position statement. Cytotherapy. 8 (4), 315-317 (2006).
  10. Gong, W., et al. Mesenchymal stem cells stimulate intestinal stem cells to repair radiation-induced intestinal injury. Cell Death & Disease. 7 (9), 2387 (2016).
  11. Dai, R., Wang, Z., Samanipour, R., Koo, K. I., Kim, K. Adipose-derived stem cells for tissue engineering and regenerative medicine applications. Stem Cells International. 2016, 6737345 (2016).
  12. Ceccarelli, S., Pontecorvi, P., Anastasiadou, E., Napoli, C., Marchese, C. Immunomodulatory effect of adipose-derived stem cells: The cutting edge of clinical application. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 236 (2020).
  13. Karp, J., Leng Teo, G. Mesenchymal stem cell homing: The devil is in the details. Cell Stem Cell. 4 (3), 206-216 (2009).
  14. Andaloussi, S., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. Extracellular vesicles: Biology and emerging therapeutic opportunities. Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).
  15. Lopez, M. J., Spencer, N. D. In vitro adult rat adipose tissue-derived stromal cell isolation and differentiation. Methods in Molecular Biology. 702, 37-46 (2011).
  16. Karnieli, O., Izhar-Prato, Y., Bulvik, S., Efrat, S. Generation of insulin-producing cells from human bone marrow mesenchymal stem cells by genetic manipulation. Stem Cells. 25 (11), 2837-2844 (2007).
  17. Yang, Y. K., Ogando, C. R., Wang See, C., Chang, T. Y., Barabino, G. A. Changes in phenotype and differentiation potential of human mesenchymal stem cells aging in vitro. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 131 (2018).
  18. Lee, R. H., et al. Multipotent stromal cells from human marrow home to and promote repair of pancreatic islets and renal glomeruli in diabetic NOD/scid mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (46), 17438-17443 (2006).
  19. Gao, L. R., et al. Overexpression of apelin in Wharton's jelly mesenchymal stem cell reverses insulin resistance and promotes pancreatic β cell proliferation in type 2 diabetic rats. Stem Cell Research & Therapy. 9 (1), 339 (2018).
  20. Ghoneim, M. A., Refaie, A. F., Elbassiouny, B. L., Gabr, M. M., Zakaria, M. M. From mesenchymal stromal/stem cells to insulin-producing cells: Progress and challenges. Stem Cell Reviews and Reports. 16 (6), 1156-1172 (2020).
  21. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Exendin-4 enhances the differentiation of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells through activation of various β-cell markers. Stem Cell Research & Therapy. 7, 108 (2016).
  22. Yang, Z., Li, K., Yan, X., Dong, F., Zhao, C. Amelioration of diabetic retinopathy by engrafted human adipose-derived mesenchymal stem cells in streptozotocin diabetic rats. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 248 (10), 1415-1422 (2010).
  23. Zhang, N., Li, J., Luo, R., Jiang, J., Wang, J. A. Bone marrow mesenchymal stem cells induce angiogenesis and attenuate the remodeling of diabetic cardiomyopathy. Experimental and Clinical Endocrinology & Diabetes. 116 (2), 104-111 (2008).
  24. Zhao, A. G., Shah, K., Freitag, J., Cromer, B., Sumer, H. Differentiation potential of early- and late-passage adipose-derived mesenchymal stem cells cultured under hypoxia and normoxia. Stem Cells International. 2020, 8898221 (2020).
  25. Krishnamurthy, H., Cram, L. S. Basics of flow cytometry. Applications of Flow Cytometry in Stem Cell Research and Tissue. , 1-12 (2010).
  26. Habib, S. A., Kamal, M. M., El-Maraghy, S. A., Senousy, M. A. Exendin-4 enhances osteogenic differentiation of adipose tissue mesenchymal stem cells through the receptor activator of nuclear factor-kappa B and osteoprotegerin signaling pathway. Journal of Cellular Biochemistry. , (2022).
  27. Qi, Y., et al. Adipose-derived mesenchymal stem cells from obese mice prevent body weight gain and hyperglycemia. Stem Cell Research & Therapy. 12 (1), 277 (2021).
  28. Tiryaki, T., Conde-Green, A., Cohen, S. R., Canikyan, S., Kocak, P. A 3-step mechanical digestion method to harvest adipose-derived stromal vascular fraction. Plastic and Reconstructive Surgery - Global Open. 8 (2), 2652 (2020).
  29. Alstrup, T., Eijken, M., Bohn, A. B., Moller, B., Damsgaard, T. E. Isolation of adipose tissue-derived stem cells: Enzymatic digestion in combination with mechanical distortion to increase adipose tissue-derived stem cell yield from human aspirated fat. Current Protocols in Stem Cell Biology. 48 (1), 68 (2019).
  30. Taghizadeh, R. R., Cetrulo, K. J., Cetrulo, C. L. Collagenase impacts the quantity and quality of native mesenchymal stem/stromal cells derived during processing of umbilical cord tissue. Cell Transplantation. 27 (1), 181-193 (2018).
  31. Kamal, M. M., Kassem, D. H. Therapeutic potential of Wharton's jelly mesenchymal stem cells for diabetes: Achievements and challenges. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 16 (2020).
  32. Gabr, M. M., et al. From human mesenchymal stem cells to insulin-producing cells: Comparison between bone marrow- and adipose tissue-derived cells. BioMed Research International. 2017, 3854232 (2017).
  33. Xin, Y., et al. Insulin-producing cells differentiated from human bone marrow mesenchymal stem cells in vitro ameliorate streptozotocin-induced diabetic hyperglycemia. PLoS One. 11 (1), 0145838 (2016).
  34. Kassem, D. H., Kamal, M. M. Therapeutic efficacy of umbilical cord-derived stem cells for diabetes mellitus: A meta-analysis study. Stem Cell Research & Therapy. 11 (1), 484 (2020).
  35. El-Demerdash, R. F., Hammad, L. N., Kamal, M. M., El Mesallamy, H. O. A comparison of Wharton's jelly and cord blood as a source of mesenchymal stem cells for diabetes cell therapy. Regenerative Medicine. 10 (7), 841-855 (2015).
  36. Kassem, D. H., Kamal, M. M., El-Kholy, A. E. -. L. G., El-Mesallamy, H. O. Association of expression levels of pluripotency/stem cell markers with the differentiation outcome of Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin producing cells. Biochimie. 127, 187-195 (2016).
  37. El-Asfar, R. K., Kamal, M. M., Abd El-Razek, R. S., El-Demerdash, E., El-Mesallamy, H. O. Obestatin can potentially differentiate Wharton's jelly mesenchymal stem cells into insulin-producing cells. Cell and Tissue Research. 372 (1), 91-98 (2018).
  38. Gabr, M. M., et al. Insulin-producing cells from adult human bone marrow mesenchymal stromal cells could control chemically induced diabetes in dogs: A preliminary study. Cell Transplantation. 27 (6), 937-947 (2018).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

186

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены