인슐린 생성 세포로 분화를 위한 쥐 지방조직 중간엽 줄기세포의 분리

요약

지방 조직 유래 중간엽 줄기 세포 (Ad-MSCs)는 인슐린 생산 세포 (IPCs)로 분화되는 MSCs의 잠재적 인 원천이 될 수 있습니다. 이 프로토콜에서, 우리는 래트 부고환 Ad-MSCs의 분리 및 특성화를위한 상세한 단계를 제공하고, 동일한 래트 Ad-MSCs로부터의 IPC의 생성을위한 간단하고 짧은 프로토콜을 제공한다.

초록

중간엽 줄기 세포 (MSCs)-특히 지방 조직 (Ad-MSCs)에서 분리 된 것들 -은 윤리적 인 우려를 제기하지 않는 재생 가능하고 풍부한 줄기 세포 공급원으로 특별한 주목을 받았습니다. 그러나 Ad-MSC를 분리하는 현재의 방법은 표준화되지 않았으며 특수 장비가 필요한 복잡한 프로토콜을 사용합니다. 우리는 간단하고 재현 가능한 방법을 사용하여 Sprague-Dawley 쥐의 부고환 지방으로부터 Ad-MSC를 분리했습니다. 분리된 Ad-MSCs는 부착성 세포가 섬유아세포 형태를 나타내기 때문에 보통 분리 후 3일 이내에 나타난다. 이러한 세포는 격리 후 1 주 이내에 80 %의 합류율에 도달합니다. 그 후, 계대 3-5 (P3-5)에서, CD90, CD73 및 CD105와 같은 특징적인 MSC 클러스터의 분화 표면 마커에 대한 면역표현형에 의해 단리된 Ad-MSCs에 대한 완전한 특성화를 수행하였고, 이들 세포의 분화를 유도할 뿐만 아니라 골형성, 지방형성, 및 연골형성 혈통을 아래로 유도하였다. 이것은 차례로 단리된 세포의 다분화능을 의미한다. 또한, 우리는 고글루코스 둘베코의 변형된 이글 배지 (HG-DMEM), β-메르캅토에탄올, 니코틴아미드 및 엑센딘-4를 통합함으로써 간단하고 비교적 짧은 프로토콜을 통해 인슐린 생산 세포 (IPCs) 계통을 향한 단리된 Ad-MSCs의 분화를 유도하였다. IPCs 분화는 먼저 생성된 IPCs에 대한 디티존 염색뿐만 아니라 MafA, NKX6.1, Pdx-1 및 Ins1과 같은 특이적 β세포 마커의 발현 수준을 측정함으로써 유전적으로 평가되었다. 둘째로, 평가는 또한 글루코스-자극된 인슐린 분비 (GSIS) 검정에 의해 기능적으로 수행되었다. 결론적으로, Ad-MSC는 모든 MSC 특성화 기준을 제시하여 쉽게 분리 될 수 있으며 당뇨병 연구를위한 실험실에서 풍부하고 재생 가능한 IPC 소스를 실제로 제공 할 수 있습니다.

서문

중간엽 기질 세포로도 알려진 중간엽 줄기 세포 (MSCs)는 재생 의학 ^1,2에 가장 널리 사용되는 세포 유형 중 하나입니다. 이들은 성체줄기세포로 분류되며 다계보 분화 가능성과 자가재생능력을 특징으로^한다3. 중간엽 줄기세포는 지방 조직, 골수, 말초 혈액, 탯줄 조직 및 혈액, 모낭 및 치아 ^4,5를 포함하는 다양한 공급원으로부터 단리되고 수득될 수 있다.

지방 조직으로부터 줄기 세포를 분리하는 것은 쉬운 접근, 시험관 내에서의 빠른 팽창 및 높은 수율⁶으로 인해 매력적이고 유망한 것으로 간주됩니다. 지방조직 유래 중간엽 줄기세포(Ad-MSCs)는 인간, 소, 생쥐, 래트 및 보다 최근에는 염소⁷과 같은 상이한 종으로부터 분리될 수 있다. Ad-MSC는 이제 조직 공학 및 유전자 / 세포 요법의 잠재적 인 후보자이며 연조직 손상 또는 결함 ^....

프로토콜

모든 실험은 승인 된 지침에 따라 수행되었으며, 모든 절차는 이집트 카이로, 이집트의 영국 대학 (BUE)의 약학 학부 윤리위원회의 승인을 받았습니다. Ad-MSC 격리 프로토콜은 Lopez 및 Spencer에서 채택되었으며 수정¹⁵가 적용되었습니다.

1. 쥐 부고환 지방 패드에서 Ad-MSC의 분리

1. 생후 1 개월 이하의 체중 250-300g의 수컷 Sprague-Dawley 쥐를 사용하십시오 (격리 당 두 마리). 동물을 마취 한 다음 자궁 경부 탈구로 안락사시킵니다. 안락사된 동물에게 70% 에탄올을 뿌린다. 복부의 아래 부분에서 피부와 근육을 절제한 다음 두 고환을 꺼내 부고환 지방 패드를 노출시킵니다.
2. 부고환 지방 패드를 부드럽게 자르고 혈관을 자르지 않도록주의하십시오.
3. 부고환을 둘러싼 지방 조직을 분리한 다음, 인산완충식염수(PBS)를 함유하는 페트리 접시에 넣는다.
4. 생물 안전 캐비닛에서이 뚱뚱한 패드를 포셉과 메스를 사용하여 작은 조각으로 자릅니다. 이들 절단된 지방 조직 조각을 10 mL의 멸균 PBS를 함유하는 50 mL 원심분리 튜브 내로 옮긴다.
5. 다진 지방 조직을 ....

결과

Ad-MSC의 격리 및 특성화
도 2에 나타난 바와 같이, 지방 조직으로부터 분리된 세포는 단리의 다음날부터 시작하여 둥근 섬유아세포와 같은 세포의 이종 집단을 나타내었다(도 2A). 분리 4일 후, 섬유아세포는 수와 크기가 증가하기 시작했고, 계대 1에 의해 동질적인 집단으로 성장하였다(도 2B,C). 이들 세?.......

토론

이 프로토콜에서, 우리는 쥐 부고환 지방으로부터 Ad-MSCs의 분리 및 이러한 Ad-MSCs를 IPCs로 분화시키는 상세한 프로토콜을 제시 할 수 있었다. 사실, 쥐 epidydimal 지방은 Ad-MSCs를 얻기 위해 지방 조직의 쉽게 얻을 수있는 원천이며 수집 또는^15,26,27 처리를 위해 특별한 장비가 필요하지 않습니다. 단리된 Ad-MSCs는 우수한 배양 확장을 .......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Albumin, bovine serum Fraction V	MP Biomedicals
Alcian Blue 8GX	Sigma-Aldrich, USA	A3157
Alizarin Red S	Sigma-Aldrich, USA	A5533
Ammonium hydroxide	Fisher Scientific, Germany
Antibody for Rat CD90, FITC	Stem Cell Technologies	60024FI
Bovine serum albumin	Sigma Aldrich	A3912
Calcium Chloride	Fisher Scientific, Germany
CD105 Monoclonal Antibody, FITC	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	MA1-19594
CD34 Polyclonal Antibody	Thermo Fisher Scientific, Invitrogen, USA	PA5-85917
Chloroform	Fisher Scientific, USA
Collagenase type I, powder	Gibco, Thermo Fisher, USA	17018029
D-Glucose anhydrous, extra pure	Fisher Scientific, Germany	G/0450/53
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Fisher Scientific, Germany	BP231-100
Dithizone staining	Sigma-Aldrich, USA	D5130
DMEM - High Glucose 4.5 g/L	Lonza, Switzerland	12-604F
DMEM - Low Glucose 1 g/L	Lonza, Switzerland	12-707F
DMEM/F12 medium	Lonza, Switzerland	BE12-719F
DNAse/RNAse free water	Gibco Thermo Fisher, USA	10977-035
Ethanol absolute, Molecular biology grade	Sigma-Aldrich, Germany	24103
Exendin-4	Sigma-Aldrich, Germany	E7144
Fetal Bovine Serum (FBS)	Gibco Thermo Fisher, Brazil	10270-106
Formaldehyde 37%	Fisher Scientific
Hydrochloric acid (HCl)	Fisher Scientific, Germany
Isopropanol, Molecular biology grade	Fisher Scientific, USA	BP2618500
L-Glutamine	Gibco Thermo Fisher, USA	25030-024
Magnesium Chloride (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
Mesenchymal Stem Cell Functional identification kit	R&D systems Inc., MN, USA	SC006
Nicotinamide	Sigma-Aldrich, Germany	N0636
Oil Red Stain	Sigma-Aldrich, USA	O0625
Penicillin-Streptomycin-Amphotericin	Gibco Thermo Fisher, USA	15240062
Phosphate buffered saline, 1X, without Ca/Mg	Lonza, Switzerland	BE17-516F
Potassium Chloride	Fisher Scientific, Germany
Rat Insulin ELISA Kit	Cloud-Clone Corp., USA	CEA682Ra
Sodium Bicarbonate	Fisher Scientific, Germany
Sodium Chloride	Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Dibasic (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
Sodium Phosphate Monobasic (Anhydrous)	Fisher Scientific, Germany
SYBR Green Maxima	Thermo Scientific, USA	K0221
Syringe filter, 0.2 micron	Corning, USA	431224
TRIzol	Thermo Scientific, USA	15596026
Trypan blue	Gibco Thermo Fisher, USA	15250061
Trypsin-Versene-EDTA, 1X	Lonza, Switzerland	CC-5012
Verso cDNA synthesis kit	Thermo Scientific, USA	AB-1453/A
β-mercaptoethanol	Sigma-Aldrich, Germany	M3148