一种测量大鼠视力的新光动测试方法

摘要

视动眼球震颤 （OKN） 行为测试方法用于评估啮齿动物的视力。这里展示了一种简单的方法，可以在研究实验室中轻松设置，以可靠地评估正常和实验大鼠的视觉功能。

摘要

视动性眼球震颤 （OKN） 是由视野中视觉刺激的运动引发的反射性眼球运动。与 OKN 相关的头部跟踪运动通常用作啮齿动物视觉功能的量度。为了记录正常大鼠和实验大鼠的 OKN 反应，已经开发了一种简单且廉价的设备。此设置使用两个平板电脑屏幕来显示 OKN 视觉刺激，该刺激由使用免费软件 OKN Stripes Visualization Web Application 生成的高对比度黑白条纹组成。将大鼠放置在一个透明的有机玻璃支架内，该支架限制移动，使大鼠的头部持续面向 OKN 显示屏。可以改变鼠架的位置，以调整鼠与显示屏之间的距离。位于大鼠支架上方的微型摄像头用于记录大鼠的视觉活动。这些记录可用于定量评估。根据是否存在清晰的头部跟踪，可以确定不同空间频率的 OKN 响应。收集的数据展示了一种可靠测量正常和视网膜退化大鼠视力的新技术。

引言

当眼睛暴露于持续的全视野视觉运动时，在视觉运动方向上会出现一种快速平稳的跟踪眼球运动和低加速度头部运动的独特模式，称为视动性眼球震颤 （OKN）^1,2。OKN 的神经通路从视网膜传递到外侧膝状体、枕叶和小脑絮状体，并连接到眼运动神经元³。这些神经通路上任何位置的神经损伤都可能导致 OKN 反应的变化。OKN 反应被用作评估人类患者大脑对称性、心因性失明和视力的工具 ^4,5。通过量化功能反应来评估视力，这对于确定以恢复因神经退行性疾病而丧失的视力为中心的治疗和实验的成功是不可或缺的 ^3,6,7。在动物中，OKN 反应可用于准确评估视力，这使研究人员能够收集有关视觉功能的定量和定性数据。在啮齿动物中，可以根据条纹在顺时针和逆时针方向的旋转方向独立测量左眼和右眼的视力⁸。这种逆时针和顺时针运动分别使每只眼睛暴露于鼻颞 （NT） 或颞鼻 （TN） 运动⁹。与 NT 刺激相比，TN 刺激导致的反应明显更高，因为啮齿动物对来自后面或侧面的危险更敏感。

以前，使用不同的 OKN 测试方法^{6、10、11、12、13} 测试正常实验室大鼠和视网膜退化大鼠的视觉功能。然而，在不同的研究之间观察到视力评分存在一定的差异，包括本调查中显示的数据。这种可变性主要归因于所使用的测试设置的差异。测试场大小和使用的 OKN 视觉刺激类型的差异 ^6,10 可能是主要因素。这些实验中使用的刺激包括用于虚拟圆柱体¹⁴ 外观的正弦波光栅、可互换旋转圆柱体¹⁵ 和四个计算机显示器上显示的高对比度（黑白）条纹¹⁰。与这些 OKN 测试设备和方法相关的主要限制包括设备体积大、动物在测试场内的移动以及动物从测试平台跌落的频繁发生率 ^7,11,12。

为了最大限度地减少上述限制，已经开发了一种用于大鼠 OKN 检测的新设备。该仪器相对便宜，被证明是有效的，易于作，并且可以评估视觉功能（图 1）。该设备使用两个平板电脑屏幕来显示不同空间频率的 OKN 视觉刺激（可视化软件）。微型相机用于记录动物在测试期间的活动，以便以后分析数据。为了在研究实验室中制造易于设置的 OKN 设备，这种新设置概述了对现有 OKN 测试设备的关键修改。这里使用的 OKN 刺激由不同空间频率和不同旋转方向（从左到右或从右到左）的黑色和白色条纹组成。OKN 测试设备的主要组件包括两个触摸屏平板电脑屏幕（7.9 英寸），用于显示 OKN 刺激（图 2）。两个可调节支架用于将平板电脑屏幕固定在所需位置。支架牢固地固定在手术台的边缘，可以调整其高度和角度。将大鼠放置在面向显示屏的鼠架中。大鼠架由透明塑料（聚甲基丙烯酸甲酯）管制成。支架连接到底座和金属支架上，以确保稳定放置在手术台上。固定管的尺寸从 4 到 6 英寸长和 2.5 到 3 英寸不等，具体取决于所用大鼠的大小。通过改变鼠架的位置来调整鼠与显示屏之间的距离。鼠架有助于保持大鼠头部持续暴露在显示屏上，并减少其在测试过程中的移动。微型相机用于记录头部跟踪响应。这种新设置的缺点包括屏幕刷新率不同，以及使用窄条纹时可能会出现错觉。但是，这些可以被视为与基于计算机的 OKN 设置相关的常见问题。除了上述问题之外，在当前设置中，没有使用影响最佳 OKN 响应的虚拟圆柱体¹⁴ 对大鼠进行测试。这种方法的新颖性在于采用该方法的技术和设备。这项技术可以在研究实验室中轻松设置，以便可靠地测量啮齿动物的视力。

研究方案

所有动物程序均按照地区当局批准的实验指南进行，并被南加州大学 （USC） 机构动物护理和使用委员会 （IACUC） 接受，并符合视觉与眼科学研究协会 （ARVO） 关于在眼科和视觉研究中使用动物的声明和欧洲指令 2010/63/EU关于保护用于科学目的的动物。

注意：本研究中使用的大鼠是色素沉着视网膜退化皇家外科医学院 （RCS） 大鼠和 Long Evans （LE） 大鼠。 图 3 显示了 OKN 测试和分析的不同阶段的示意图。

1. 程序

1. 准备设置
   1. 将大鼠放在笼子里，并在测试室内关闭灯内 30 分钟。
      注意：这有助于最大限度地减少运输过程中产生的应力，并为所有实验提供均匀的照明条件。
   2. 将平板电脑屏幕彼此相对的位置设置为 155°，以显示 OKN Stripes 可视化 Web 应用程序。
   3. 将鼠架放在两个平板电脑屏幕的中间，距离中心 4.5 英寸。
      注意： 在这个位置，老鼠的头将距离显示屏约 3.5 英寸。
   4. 单击平板电脑桌面上的 OKN Stripes Visualization Web 应用程序 ，从最低空间频率开始显示视觉刺激（黑白条纹）。
      注：使用空间频率 0.08、0.15、0.2、0.24、0.28、0.33、0.38 周期/度 （c/d），从最低空间频率 （0.08c/d） 开始，更改为更高的空间频率（高达 0.38 c/d）。在每个空间频率下，测试大鼠的条纹旋转的顺时针和逆时针方向（每个 1 分钟）。
2. OKN 测试程序
   1. 选择合适尺寸的鼠架。
   2. 将老鼠带到鼠架的开口处，小心地将老鼠引向内部。
   3. 测试前让大鼠在支架内安顿下来（1-2 分钟）。
      注意：通过适当的处理，在大多数情况下可以将老鼠保持在支架内;必要时，将 RAT 支架高高举起（最高离桌子 2 英尺）几秒钟，直到 RAT 稳定下来。发现对高度的恐惧可以减少老鼠从老鼠架上爬下来的趋势。如果需要，给予大鼠额外的时间 （1-2 分钟） 以稳定下来。
   4. 将鼠架的底座插入金属支架中，使其放置稳定。
      注意：此设置允许更改大鼠与平板电脑屏幕的观看距离。
   5. 打开相机开始视频录制。
   6. 单击平板电脑屏幕桌面上的 OKN Stripes Visualization Web Application（OKN Stripes 可视化 Web 应用程序 ），然后开始运行该程序。
   7. 沿从左到右或从右到左的方向运行 OKN 刺激。
      注意：沿顺时针方向旋转条纹会激活左眼，而逆时针方向旋转会激活右眼。初始旋转方向是随机选择的，以避免潜在的习惯化。
   8. 观察大鼠的头部跟踪行为。
   9. 使用最低空间频率 （0.08 c/d） 开始测试，然后按升序逐步（按升序）增加空间频率。
   10. 请注意 OKN 响应的存在与否。
   11. 继续测试，不同空间频率之间没有给出静止期。
   12. 完成所有空间频率后停止视频录制，并使用大鼠识别号保存数据。
   13. 将大鼠从支架中取出，将其放在笼子中，在连续测试之间休息约 30 分钟。
   14. 每只大鼠重复测试三次。

2. 数据分析

1. 查看录制的视频，并通过找到大鼠反应的空间频率来确定每只大鼠的视力。
2. 在电子表格中记录所有回答（是否存在明确的头部跟踪）。
3. 找到大鼠对 3 个测试的反应的最高空间频率。这被认为是最终的视力。
   注意：由于视力测量是主观的，因此数据将由两名独立的研究人员进行评估，以确认每只大鼠的视力评分¹²。结果会进行交叉检查，直到最终分数达成一致。积极的 OKN 反应定义为存在明确且持续的头部跟踪活动。随机头部跟踪（与 OKN 视觉刺激无关）或没有任何头部运动被认为是负面的 OKN 反应。
4. 进行统计分析以比较各组或两只眼睛之间（左眼与右眼）。
   注意：查看视频录像以阐明是否根据需要进行了积极或消极的回答。

结果

使用视网膜退化 （RD） 皇家外科医师学院 （RCS） 大鼠和年龄匹配的正常 Long Evans （LE） 大鼠进行 OKN 检测。LE 大鼠 （n = 4） 用于建立基线数据，以确定使用新设置的正常大鼠的视力评分。使用 Microsoft excel （平均值±标准差） 进行统计分析。LE 大鼠在 0.15 c/d 至 0.33 c/d 的空间频率下表现出强大的头部跟踪能力。为了评估新 OKN 装置测量 RD 大鼠视力的可靠性和有效性，使?...

讨论

OKN 是眼睛响应漂移刺激而进行的反射性锯齿运动，用作评估人类受试者视力的工具³。在动物（包括灵长类动物和啮齿动物）中，OKN 测试用作视觉功能的定量测量。本研究描述了一种新颖、廉价的 OKN 装置，可以很容易地在研究实验室中设置，用于大鼠的 OKN 行为测试。啮齿动物的 OKN 评估通过不同的方法进行。以前，使用连接到电机的可互换 OKN 鼓来旋?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
iPad Mini	Apple	A1489	Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software.
Micro-camera/Micro-Camera Attachment	Lanon	B097H6WWDS	The micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions.
Plexiglass Tube/Rat Holder	Best Acrylics	B07KMF31MC	The Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab.
Plexiglass Tube Attachment	Best Acrylics	B07KMF31MC	This attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated.
Screen Holders	Kabcon	B08JLRPKQ1	Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat.
OKN Stripes Visualization Web Application	The MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushin	https://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/	This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies