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요약

OKN(Optokinetic Nystagmus) 행동 테스트 방법은 설치류의 시력 평가에 사용됩니다. 여기에서는 정상 쥐와 실험용 쥐 모두의 시각 기능에 대한 신뢰할 수 있는 평가를 위해 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 간단한 방법을 보여줍니다.

초록

안진(OKN)은 시야에서 시각적 자극의 움직임에 의해 시작되는 반사적 안구 운동입니다. OKN과 관련된 머리 추적 움직임은 일반적으로 설치류의 시각 기능을 측정하는 데 사용됩니다. 정상 및 실험용 쥐의 OKN 반응을 기록하기 위해 간단하고 저렴한 장치가 개발되었습니다. 이 설정은 두 개의 태블릿 화면을 사용하여 무료로 사용할 수 있는 소프트웨어인 OKN Stripes Visualization Web Application을 사용하여 생성된 고대비 흑백 줄무늬로 구성된 OKN 시각적 자극을 표시합니다. 쥐는 쥐의 머리가 OKN 디스플레이 화면을 계속 향하도록 움직임을 제한하는 투명한 플렉시글라스 홀더 안에 넣습니다. 쥐 홀더의 위치를 변경하여 쥐와 디스플레이 화면 사이의 거리를 조정할 수 있습니다. 쥐 사육장 위에 위치한 마이크로 카메라는 쥐의 시각 활동을 기록하는 데 사용됩니다. 이러한 녹음은 정량적 평가에 사용할 수 있습니다. 명확한 헤드 트래킹의 유무에 따라 서로 다른 공간 주파수에서 OKN 응답을 결정할 수 있습니다. 수집된 데이터는 정상 및 망막 퇴행성 쥐의 시력을 안정적으로 측정할 수 있는 새로운 기술을 보여줍니다.

서문

눈이 지속적인 전체 시야 시각적 움직임에 노출되면 빠르고 부드러운 안구 움직임과 저가속 머리 움직임의 뚜렷한 패턴이 시각적 움직임 방향으로 나타나는데, 이를 광동태 안진(OKN)1,2이라고 합니다. OKN의 신경학적 경로는 망막에서 외측 외상체(lateral geniculate body), 후두엽(occipital lobe), 소뇌 응집체(cerebellar flocculus)로 지나가며 안구 운동 뉴런(ocular motor neuron)에 연결된다3. 이러한 신경 경로를 따라 어느 곳에서나 신경 손상이 발생하면 OKN 반응의 변화로 이어질 수 있습니다. OKN 반응은 인간 환자의 대뇌 대칭, 심인성 실명 및 시력을 평가하는 도구로 사용됩니다 4,5. 시력은 기능적 반응을 정량화하여 평가되며, 이는 신경퇴행성 질환으로 인해 상실된 시력을 회복하는 데 중점을 둔 치료 및 실험의 성공을 결정하는 데 필수적일 수 있습니다 3,6,7. 동물에서 OKN 반응은 시력을 정확하게 평가하는 데 사용할 수 있으며, 이를 통해 연구자는 시각 기능에 관한 정량적 및 정성적 데이터를 모두 수집할 수 있습니다. 설치류의 경우 시계 방향과 시계 반대 방향으로 줄무늬의 회전 방향에 따라 왼쪽과 오른쪽 눈의 시력을 독립적으로 측정 할 수 있습니다8. 이 시계 반대 방향 및 시계 방향 움직임은 각 눈을 각각 비측두(N-T) 또는 측두-비강(T-N) 움직임9에 노출시킵니다. T-N 자극은 설치류가 뒤나 옆에서 오는 위험에 더 민감하기 때문에 N-T 자극에 비해 훨씬 더 높은 반응을 보입니다.

이전에는 정상 실험실 쥐와 망막 퇴행성 쥐의 시각 기능을 서로 다른 OKN 테스트 방법 6,10,11,12,13을 사용하여 테스트했습니다. 그러나 시력 점수의 특정 변동은 본 조사에 표시된 데이터를 포함하여 서로 다른 연구 간에 관찰됩니다. 이러한 가변성은 주로 사용된 테스트 설정의 차이에 기인할 수 있습니다. 테스트 경기장의 크기와 사용된 OKN 시각적 자극 유형 6,10의 차이가 주요 요인이 될 수 있습니다. 이러한 실험에 사용된 자극은 가상 실린더(14)의 출현을 위한 사인파 격자, 교체 가능한 회전 실린더(15), 및 4개의 컴퓨터 모니터(10)에 표시되는 고대비(흑백) 스트라이프를 포함한다. 이러한 OKN 테스트 장치 및 방법과 관련된 주요 제한 사항에는 장비의 큰 크기, 테스트 경기장에서 동물의 이동, 테스트 플랫폼에서 동물이 떨어지는 빈번한 발생률 7,11,12 등이 있습니다.

위의 한계를 최소화하기 위해 쥐에서 OKN 테스트를 위한 새로운 장치가 개발되었습니다. 이 장치는 비교적 저렴하고, 효율성이 입증되었으며, 작동이 간편하고, 시각 기능을 평가할 수 있습니다(그림 1). 이 장치는 두 개의 태블릿 화면을 사용하여 서로 다른 공간 주파수에서 OKN 시각적 자극(시각화 소프트웨어)을 표시합니다. 마이크로 카메라는 나중에 데이터를 분석하기 위해 테스트 중 동물의 활동을 기록하는 데 사용됩니다. 연구 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 OKN 장치를 만들기 위한 목적으로 이 새로운 설정은 기존 OKN 테스트 장치에 대한 중요한 수정 사항을 간략하게 설명합니다. 여기에 사용된 OKN 자극은 서로 다른 공간 주파수와 서로 다른 회전 방향(왼쪽에서 오른쪽 또는 오른쪽에서 왼쪽)의 흑백 줄무늬로 구성됩니다. OKN 테스트 장치의 주요 구성 요소에는 OKN 자극을 표시하는 데 사용되는 두 개의 터치스크린 태블릿 화면(7.9인치)이 포함됩니다(그림 2). 두 개의 조정 가능한 홀더는 태블릿 화면을 원하는 위치에 고정하는 데 사용됩니다. 홀더는 높이와 각도를 조정할 수 있는 절차 테이블의 가장자리에 단단히 부착되어 있습니다. 쥐는 디스플레이 화면을 향하는 쥐 홀더에 넣습니다. 쥐 홀더는 투명 플라스틱(폴리메틸 메타크릴레이트) 튜브로 만들어졌습니다. 홀더는 받침대와 금속 스탠드에 부착되어 시술 테이블에 안정적으로 배치할 수 있습니다. 홀딩 튜브의 크기는 사용 된 쥐의 크기에 따라 길이가 4-6 인치, 직경이 2.5-3 인치까지 다양합니다. 쥐와 디스플레이 화면 사이의 거리는 쥐 홀더의 위치를 변경하여 조정됩니다. 쥐 홀더는 쥐의 머리가 디스플레이 화면을 향하는 지속적인 노출을 유지하고 테스트 중에 움직임을 줄이는 데 도움이 됩니다. 마이크로 카메라는 헤드 트래킹 응답을 기록하는 데 사용됩니다. 이 새로운 설정의 단점은 화면의 재생 빈도가 다르고 좁은 줄무늬를 사용할 때 착시 발생 가능성이 있다는 것입니다. 그러나 이러한 문제는 컴퓨터 기반 OKN 설정과 관련된 일반적인 문제로 간주될 수 있습니다. 위의 문제 외에도 현재 설정에서 랫드는 최적의 OKN 응답에 영향을 미치는 가상 실린더14 를 사용하여 테스트되지 않습니다. 이 방법의 참신함은 이 방법이 사용되는 기술과 장치에 있습니다. 이 기술은 설치류의 신뢰할 수 있는 시력 측정을 위해 연구 실험실에서 쉽게 설정할 수 있습니다.

프로토콜

모든 동물 절차는 지역 당국이 승인하고 University of Southern California(USC)의 IACUC(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 실험 지침에 따라 수행되었으며, ARVO(Association for Research in Vision and Ophthalmology) Statement for the Use of Animals in Ophthalmic and Vision Research 및 Scientific Purposes(과학적 목적으로 사용되는 동물 보호에 관한 유럽 지침 2010/63/EU)를 준수했습니다.

참고: 이 연구에 사용된 쥐는 색소 망막 퇴행성 왕립 외과 대학(RCS) 쥐와 Long Evans(LE) 쥐입니다. 그림 3 은 OKN 테스트 및 분석의 여러 단계를 보여주는 개략도를 보여줍니다.

1. 절차

  1. 설정 준비
    1. 쥐를 케이지에 가두고 실내 조명을 끈 상태에서 30분 동안 시험장 안에 두십시오.
      참고: 이는 운송 중에 발생하는 스트레스를 최소화하는 데 도움이 되며 모든 실험에 균일한 조명 조건을 제공합니다.
    2. 태블릿 화면이 서로 마주보고 있는 위치를 155°로 설정하여 OKN Stripes 시각화 웹 애플리케이션을 표시합니다.
    3. 쥐 홀더를 중앙에서 4.5인치 떨어진 두 개의 태블릿 화면 중앙에 놓습니다.
      알림: 이 위치에서 쥐의 머리는 디스플레이 화면에서 약 3.5인치 떨어져 있습니다.
    4. 태블릿 바탕 화면에서 OKN Stripes Visualization 웹 응용 프로그램을 클릭하면 가장 낮은 공간 주파수부터 시작하는 시각적 자극(흑백 줄무늬)이 표시됩니다.
      참고: 공간 주파수 0.08, 0.15, 0.2, 0.24, 0.28, 0.33, 0.38 사이클(c/d)이 사용되며, 가장 낮은 공간 주파수(0.08c/d)에서 시작하여 더 높은 공간 주파수(최대 0.38c/d)로 변경됩니다. 각 공간 주파수에서 쥐는 줄무늬 회전에서 시계 방향 및 시계 반대 방향 모두에 대해 테스트됩니다(각각 1분).
  2. OKN 테스트 절차
    1. 적절한 크기의 쥐 홀더를 선택하십시오.
    2. 쥐를 쥐 홀더의 입구 쪽으로 데려가고 쥐를 조심스럽게 안쪽으로 안내합니다.
    3. 테스트하기 전에 쥐가 홀더 내부에 정착하도록 합니다(1-2분).
      알림: 적절한 취급을 통해 대부분의 경우 홀더 내부의 쥐를 유지할 수 있습니다. 필요한 경우 쥐가 안정될 때까지 몇 초 동안 쥐 홀더를 높게(테이블에서 최대 2피트) 유지합니다. 높이에 대한 두려움은 쥐가 쥐 홀더에서 내려오는 경향을 줄이는 것으로 밝혀졌습니다. 필요한 경우 쥐가 정착할 수 있도록 추가 시간(1-2분)이 주어집니다.
    4. 쥐 홀더의 받침대를 금속 스탠드에 삽입하여 안정적으로 배치하십시오.
      알림: 이 설정을 사용하면 쥐의 view태블릿 화면에서 거리.
    5. 카메라를 켜서 동영상 녹화를 시작합니다.
    6. 태블릿 화면의 바탕 화면에서 OKN Stripes Visualization Web Application 을 클릭하고 프로그램 실행을 시작합니다.
    7. OKN 자극을 왼쪽에서 오른쪽 또는 오른쪽에서 왼쪽 방향으로 실행합니다.
      참고: 줄무늬를 시계 방향으로 돌리면 왼쪽 눈이 활성화되고 시계 반대 방향으로 돌리면 오른쪽 눈이 활성화됩니다. 초기 회전 방향은 잠재적인 습관화를 피하기 위해 무작위로 선택되었습니다.
    8. 쥐의 머리 추적 행동을 관찰합니다.
    9. 가장 낮은 공간 주파수(0.08c/d)를 사용하여 테스트를 시작한 다음 공간 주파수를 단계별(오름차순)로 높입니다.
    10. OKN 응답의 존재 여부를 확인합니다.
    11. 테스트를 계속하고 서로 다른 공간 주파수 사이에 휴식 시간이 제공되지 않습니다.
    12. 모든 공간 주파수를 완료한 후 비디오 녹화를 중지하고 쥐 식별 번호를 사용하여 데이터를 저장합니다.
    13. 홀더에서 쥐를 꺼내 연속 테스트 사이에 약 30분 동안 휴식을 취하면서 케이지에 넣습니다.
    14. 쥐당 세 번 테스트를 반복합니다.

2. 데이터 분석

  1. 녹화된 비디오를 검토하고 쥐가 반응한 공간 주파수를 찾아 각 쥐의 시력을 확인합니다.
  2. 모든 응답(명확한 헤드 트래킹의 유무)을 스프레드시트에 기록합니다.
  3. 세 가지 테스트에서 쥐가 반응한 가장 높은 공간 주파수를 찾습니다. 이것은 최종 시력으로 간주됩니다.
    참고: 시력 측정은 주관적이기 때문에 각 쥐12의 시력 점수를 확인하기 위해 두 명의 독립적인 연구 담당자가 데이터를 평가합니다. 최종 점수가 합의될 때까지 결과를 교차 확인합니다. 긍정적인 OKN 반응은 명확하고 지속적인 헤드 트래킹 활동의 존재로 정의됩니다. 무작위 머리 추적(OKN 시각적 자극과 관련이 없음) 또는 머리 움직임이 없는 것은 부정적인 OKN 반응으로 간주됩니다.
  4. 통계 분석을 수행하여 그룹 또는 두 눈(왼쪽 눈 대 오른쪽 눈) 사이를 비교합니다.
    참고: 비디오 녹화를 검토하여 필요에 따라 긍정적 또는 부정적 응답이 수행되는지 명확히 하십시오.

결과

OKN 검사는 망막 퇴행성(RD) 왕립 외과 대학(RCS) 쥐와 연령이 일치하는 정상 Long Evans(LE) 쥐를 사용하여 수행되었습니다. LE 쥐(n = 4)는 새로운 설정을 사용하여 정상 쥐의 시력 점수를 결정하기 위한 기준 데이터를 설정하는 데 사용되었습니다. 통계 분석은 Microsoft Excel(평균 ± 표준 편차)을 사용하여 수행되었습니다. LE 쥐는 0.15 c/d에서 0.33 c/d의 공간 주파수에서 강력한 헤드 ?...

토론

OKN은 표류하는 자극에 반응하여 눈의 반사적 톱니 운동으로, 인간 피험자의 시력을 평가하는 도구로 사용됩니다3. 영장류와 설치류를 포함한 동물에서 OKN 테스트는 시각 기능의 정량적 측정으로 사용됩니다. 본 연구는 쥐의 OKN 행동 테스트를 위해 연구 실험실에서 쉽게 설정할 수 있는 새롭고 저렴한 OKN 장치에 대해 설명합니다. 설치류에 대한 OKN 평가?...

공개

저자는 보고할 이해 상충이 없습니다.

감사의 말

이 연구는 CIRM(California Institute for Regenerative Medicine) 보조금 (DISC1-09912 PI- Thomas, DR3-07438- PI- Humayun), 뉴욕주 뉴욕주 뉴욕의 실명 방지 연구에서 안과에 대한 무제한 보조금 및 Bright Focus Foundation(M2016186, Thomas, PI)의 지원으로 지원되었습니다. 이 간행물에 보고된 연구는 미국 국립보건원(National Institutes of Health)의 국립 안과 연구소(National Eye Institute)의 수상 번호 P30EY029220의 지원을 받았습니다.

자료

NameCompanyCatalog NumberComments
iPad MiniAppleA1489Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software.
Micro-camera/Micro-Camera AttachmentLanonB097H6WWDSThe micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions. 
Plexiglass Tube/Rat HolderBest AcrylicsB07KMF31MCThe Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab.
Plexiglass Tube AttachmentBest AcrylicsB07KMF31MCThis attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated. 
Screen HoldersKabconB08JLRPKQ1Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat. 
OKN Stripes Visualization Web ApplicationThe MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushinhttps://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies

참고문헌

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