Un nuovo metodo di test optocinetico per misurare la visione del ratto

Riepilogo

Il metodo di test comportamentale del nistagmo optocinetico (OKN) viene utilizzato per la valutazione dell'acuità visiva nei roditori. Qui viene dimostrato un metodo semplice che può essere facilmente messo a punto nei laboratori di ricerca per una valutazione affidabile della funzione visiva sia nei ratti normali che in quelli sperimentali.

Abstract

Il nistagmo optocinetico (OKN) è un movimento oculare riflessivo avviato dal movimento di stimoli visivi nel campo visivo. Il movimento di tracciamento della testa associato all'OKN è comunemente usato come misura della funzione visiva nei roditori. Per registrare le risposte OKN in ratti normali e sperimentali, è stato sviluppato un apparato semplice ed economico. Questa configurazione utilizza due schermi di tablet per visualizzare lo stimolo visivo OKN costituito da strisce bianche e nere ad alto contrasto generate utilizzando l'applicazione Web di visualizzazione delle strisce OKN, un software disponibile gratuitamente. Il ratto è posizionato all'interno di un supporto in plexiglass trasparente che limita il movimento in modo che la testa del ratto sia continuamente rivolta verso lo schermo OKN. La posizione del portaratto può essere modificata per regolare la distanza tra il ratto e lo schermo del display. Una microcamera posizionata sopra il portaratto viene utilizzata per registrare le attività visive del ratto. Queste registrazioni possono essere utilizzate per valutazioni quantitative. Sulla base della presenza o dell'assenza di un chiaro tracciamento della testa, è possibile determinare le risposte OKN a diverse frequenze spaziali. I dati raccolti dimostrano una nuova tecnica per la misurazione affidabile dell'acuità visiva in ratti normali e degenerati in retini.

Introduzione

Quando l'occhio è esposto a un movimento visivo sostenuto a tutto campo, emerge un modello distinto di movimenti oculari a tracciamento rapido e fluido e movimenti della testa a bassa accelerazione, chiamato nistagmo optocinetico (OKN)^1,2. La via neurologica dell'OKN passa dalla retina al corpo genicolato laterale, al lobo occipitale e al flocculo cerebellare e si collega ai motoneuroni oculari³. Il danno neurale in qualsiasi punto lungo questi percorsi neurali può portare a cambiamenti nelle risposte OKN. La risposta OKN viene utilizzata come strumento per valutare la simmetria cerebrale, la cecità psicogena e l'acuità visiva nei pazienti umani ^4,5. L'acuità visiva viene valutata quantificando le risposte funzionali, che possono essere fondamentali nel determinare il successo dei trattamenti e degli esperimenti incentrati sul ripristino della vista persa a causa di malattie neurodegenerative ^3,6,7. Negli animali, le risposte OKN possono essere utilizzate per valutare con precisione l'acuità visiva, il che fornisce ai ricercatori la possibilità di raccogliere dati quantitativi e qualitativi riguardanti la funzione visiva. Nei roditori è possibile misurare l'acuità visiva dell'occhio sinistro e destro in modo indipendente in base al senso di rotazione delle strisce sia in senso orario che antiorario⁸. Questo movimento in senso antiorario e orario espone ciascun occhio rispettivamente al movimento naso-temporale (N-T) o tempo-nasale (T-N)⁹. Lo stimolo T-N si traduce in una risposta significativamente più elevata rispetto allo stimolo N-T poiché i roditori sono più sensibili ai pericoli provenienti da dietro o lateralmente.

In precedenza, la funzione visiva nei ratti da laboratorio normali e nei ratti degenerati della retina è stata testata utilizzando diversi metodi di test OKN 6,10,11,12,13. Tuttavia, si osservano alcune variabilità nei punteggi dell'acuità visiva tra i diversi studi, compresi i dati mostrati nella presente indagine. Questa variabilità può essere attribuita principalmente alle differenze nella configurazione di test utilizzata. Le differenze nelle dimensioni dell'arena di test e il tipo di stimoli visivi OKN utilizzati ^6,10 possono essere i fattori principali. Gli stimoli utilizzati in questi esperimenti includono reticoli sinusoidali per l'aspetto di un cilindro virtuale¹⁴, cilindri rotanti intercambiabili¹⁵ e strisce ad alto contrasto (bianco e nero) visualizzate su quattro monitor di computer¹⁰. Le principali limitazioni associate a questi apparati e metodi di test OKN includono le grandi dimensioni dell'attrezzatura, il movimento degli animali nell'arena di test e la frequente incidenza della caduta dell'animale dalla piattaforma di test ^7,11,12.

Per ridurre al minimo le limitazioni di cui sopra, è stato sviluppato un nuovo apparato per il test dell'OKN nei ratti. Questo apparecchio è relativamente economico, si è dimostrato efficiente, facile da usare e consente la valutazione della funzione visiva (Figura 1). L'apparato utilizza due schermi di tablet per visualizzare gli stimoli visivi OKN (software di visualizzazione) a diverse frequenze spaziali. Una microcamera viene utilizzata per registrare le attività dell'animale durante i test per una successiva analisi dei dati. Con l'obiettivo di realizzare un apparato OKN facile da configurare nei laboratori di ricerca, questa nuova configurazione delinea le modifiche critiche all'apparato di test OKN esistente. Gli stimoli OKN utilizzati qui sono costituiti da strisce bianche e nere a diverse frequenze spaziali e diversi sensi di rotazione (da sinistra a destra o da destra a sinistra). Il componente principale dell'apparato di test OKN include due schermi di tablet touchscreen (7,9 pollici) utilizzati per visualizzare gli stimoli OKN (Figura 2). Due supporti regolabili vengono utilizzati per mantenere gli schermi dei tablet nella posizione desiderata. I supporti sono fissati saldamente al bordo di un tavolo operatorio che consente la regolazione dell'altezza e dell'angolazione. I ratti sono collocati in un portatopi che si affaccia sugli schermi. I portaratti sono realizzati in tubo di plastica trasparente (polimetilmetacrilato). Il supporto è fissato a un piedistallo e a un supporto in metallo per garantire un posizionamento stabile sul tavolo operatorio. La dimensione dei tubi di contenimento varia da 4 a 6 pollici di lunghezza e da 2,5 a 3 pollici di diametro, a seconda delle dimensioni dei ratti utilizzati. La distanza tra il ratto e lo schermo del display viene regolata modificando la posizione del portaratti. Il supporto per ratti aiuta a mantenere l'esposizione continua della testa del ratto verso gli schermi e riduce i suoi movimenti durante il test. Una microcamera viene utilizzata per registrare le risposte di tracciamento della testa. I difetti di questa nuova configurazione includono diverse frequenze di aggiornamento per lo schermo e la possibilità di illusioni ottiche quando si utilizzano strisce strette. Tuttavia, questi possono essere considerati problemi comuni associati a una configurazione OKN basata su computer. Oltre ai problemi di cui sopra, nella configurazione attuale, i ratti non vengono testati utilizzando un cilindro virtuale¹⁴ che influenza la risposta OKN ottimale. La novità di questo metodo risiede nella tecnica e nell'apparato in cui il metodo viene impiegato. Questa tecnica può essere facilmente implementata nei laboratori di ricerca per una misurazione affidabile dell'acuità visiva nei roditori.

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Protocollo

Tutte le procedure sugli animali sono state eseguite in conformità con le linee guida sperimentali approvate dalle autorità regionali e accettate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso la University of Southern California (USC) e conformi alla Dichiarazione dell'Associazione per la Ricerca in Visione e Oftalmologia (ARVO) per l'uso di animali nella ricerca oftalmica e visiva e alla direttiva europea 2010/63/UE sulla protezione degli animali utilizzati per scopi scientifici.

NOTA: I ratti utilizzati in questo studio sono ratti degenerati della retina pigmentata del Royal College of Surgeons (RCS) e ratti Long Evans (LE). La Figura 3 mostra un'illustrazione schematica che mostra le diverse fasi del test e dell'analisi OKN.

1. Procedure

1. Preparazione dell'installazione
   1. Tenere il ratto nella gabbia e per 30 minuti all'interno della sala prove con le luci spente.
      NOTA: Questo aiuta a ridurre al minimo lo stress che si verifica durante il trasporto e fornisce una condizione di illuminazione uniforme per tutti gli esperimenti.
   2. Impostare la posizione degli schermi dei tablet uno di fronte all'altro a 155° per visualizzare l'applicazione Web di visualizzazione OKN Stripes.
   3. Posiziona il porta topi al centro di due schermi di tablet a 4.5 pollici dal centro.
      NOTA: In questa posizione, la testa del ratto si troverà a circa 3.5 pollici di distanza dallo schermo del display.
   4. Fare clic sull'applicazione Web OKN Stripes Visualization dal desktop del tablet per visualizzare gli stimoli visivi (strisce bianche e nere) a partire dalla frequenza spaziale più bassa.
      NOTA: Vengono utilizzate frequenze spaziali 0,08, 0,15, 0,2, 0,24, 0,28, 0,33, 0,38 cicli per gradi (c/d), a partire dalla frequenza spaziale più bassa (0,08c/d) e passando a frequenze spaziali più elevate (fino a 0,38 c/d). Ad ogni frequenza spaziale, i ratti vengono testati sia in senso orario che antiorario nella rotazione di strisce (1 minuto ciascuna).
2. Procedura di test OKN
   1. Seleziona un portatopi di dimensioni adeguate.
   2. Porta il topo verso l'apertura del portatopi e guida con cura il topo verso l'interno.
   3. Lasciare che il ratto si stabilisca all'interno del supporto (1-2 minuti) prima del test.
      NOTA: Con una corretta manipolazione, nella maggior parte dei casi è possibile mantenere il ratto all'interno del supporto; Quando necessario, il portatopi viene tenuto in alto (fino a 2 piedi sopra il tavolo) per alcuni secondi fino a quando il topo non si deposita. Si è scoperto che la paura dell'altezza riduce la tendenza del ratto a scendere dal portaratti. Se necessario, viene concesso del tempo aggiuntivo (1-2 minuti) al topo per sistemarsi.
   4. Inserire il piedistallo del portatopi nel supporto metallico per un suo posizionamento stabile.
      NOTA: Questa configurazione consente di modificare la distanza di visione del ratto dallo schermo del tablet.
   5. Accendi la fotocamera per avviare la registrazione video.
   6. Fare clic su OKN Stripes Visualization Web Application dal desktop dello schermo del tablet e avviare l'esecuzione del programma.
   7. Esegui gli stimoli OKN da sinistra a destra o da destra a sinistra.
      NOTA: La rotazione delle strisce in senso orario attiva l'occhio sinistro, mentre la rotazione in senso antiorario attiva l'occhio destro. Il senso di rotazione iniziale è stato scelto in modo casuale per evitare una potenziale assuefazione.
   8. Osserva il comportamento del ratto nel tracciare la testa.
   9. Iniziare il test utilizzando la frequenza spaziale più bassa (0,08 c/d), quindi aumentare la frequenza spaziale in ordine graduale (in ordine crescente).
   10. Notare la presenza o l'assenza di risposte OKN.
   11. Continuare i test, non è previsto alcun periodo di riposo tra le diverse frequenze spaziali.
   12. Interrompi la registrazione video dopo aver completato tutte le frequenze spaziali e salva i dati utilizzando il numero di identificazione del ratto.
   13. Estrarre il ratto dal supporto e metterlo nella gabbia per circa 30 minuti di riposo tra test consecutivi.
   14. Ripetere i test tre volte per ratto.

2. Analisi dei dati

1. Rivedi il video registrato e determina l'acuità visiva di ciascun ratto trovando le frequenze spaziali a cui il ratto ha risposto.
2. Registra tutte le risposte (presenza o assenza di un chiaro tracciamento della testa) in un foglio di calcolo.
3. Trova la frequenza spaziale più alta a cui un ratto ha risposto dai tre test. Questa è considerata l'acuità visiva finale.
   NOTA: Poiché la misurazione dell'acuità visiva è soggettiva, i dati saranno valutati da due membri del personale di studio indipendente per confermare il punteggio dell'acuità visiva per ciascun ratto¹². I risultati vengono sottoposti a controlli incrociati fino a quando non viene concordato il punteggio finale. Una risposta OKN positiva è definita come la presenza di un'attività di tracciamento della testa chiara e sostenuta. L'inseguimento casuale della testa (non correlato agli stimoli visivi OKN) o l'assenza di qualsiasi movimento della testa è considerata una risposta OKN negativa.
4. Condurre analisi statistiche per confrontare gruppi o tra i due occhi (occhio sinistro vs occhio destro).
   NOTA: Rivedere le registrazioni video per chiarire che le risposte positive o negative vengono condotte secondo necessità.

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Risultati

Il test OKN è stato eseguito utilizzando ratti degenerati retinici (RD) del Royal College of Surgeons (RCS) e ratti Long Evans (LE) normali di pari età. I ratti LE (n = 4) sono stati utilizzati per stabilire i dati di base per determinare i punteggi di acuità visiva nei ratti normali utilizzando la nuova configurazione. L'analisi statistica è stata effettuata utilizzando Microsoft Excel (media ± deviazione standard). I ratti LE hanno mostrato un robusto tracciamento della testa a fr...

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Discussione

L'OKN è un movimento riflessivo degli occhi a dente di sega in risposta a uno stimolo alla deriva, che viene utilizzato come strumento per valutare l'acuità visiva nei soggetti umani³. Negli animali, compresi i primati e i roditori, il test OKN viene utilizzato come misura quantitativa della funzione visiva. Il presente studio descrive un nuovo apparato OKN poco costoso che può essere facilmente installato nei laboratori di ricerca per i test comportamentali OK...

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Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
iPad Mini	Apple	A1489	Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software.
Micro-camera/Micro-Camera Attachment	Lanon	B097H6WWDS	The micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions.
Plexiglass Tube/Rat Holder	Best Acrylics	B07KMF31MC	The Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab.
Plexiglass Tube Attachment	Best Acrylics	B07KMF31MC	This attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated.
Screen Holders	Kabcon	B08JLRPKQ1	Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat.
OKN Stripes Visualization Web Application	The MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushin	https://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/	This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies