Une nouvelle méthode de test optocinétique pour mesurer la vision du rat

Résumé

La méthode de test comportemental Optokinetic Nystagmus (OKN) est utilisée pour l’évaluation de l’acuité visuelle chez les rongeurs. Ici, une méthode simple est démontrée qui peut être facilement mise en place dans les laboratoires de recherche pour une évaluation fiable de la fonction visuelle chez les rats normaux et expérimentaux.

Résumé

Le nystagmus optocinétique (OKN) est un mouvement oculaire réflexe initié par le mouvement de stimuli visuels dans le champ de vision. Le mouvement de suivi de la tête associé à l’OKN est couramment utilisé comme mesure de la fonction visuelle chez les rongeurs. Pour enregistrer les réponses OKN chez des rats normaux et expérimentaux, un appareil simple et peu coûteux a été développé. Cette configuration utilise deux écrans de tablette pour afficher le stimulus visuel OKN composé de bandes noires et blanches à contraste élevé générées à l’aide de l’application Web de visualisation OKN Stripes, un logiciel disponible gratuitement. Le rat est placé à l’intérieur d’un support en plexiglas transparent qui limite les mouvements, de sorte que la tête du rat fait continuellement face à l’écran d’affichage de l’OKN. La position du support de rat peut être modifiée pour ajuster la distance entre le rat et l’écran d’affichage. Une micro-caméra placée au-dessus du rat est utilisée pour enregistrer les activités visuelles du rat. Ces enregistrements peuvent être utilisés pour des évaluations quantitatives. Sur la base de la présence ou de l’absence d’un suivi de tête clair, les réponses OKN à différentes fréquences spatiales peuvent être déterminées. Les données recueillies démontrent une nouvelle technique de mesure fiable de l’acuité visuelle chez les rats normaux et dégénérés rétiniens.

Introduction

Lorsque l’œil est exposé à un mouvement visuel soutenu sur tout le champ, un modèle distinct de mouvements oculaires rapides et fluides et de mouvements de la tête à faible accélération émerge dans la direction du mouvement visuel, appelé nystagmus optocinétique (OKN)^1,2. La voie neurologique de l’OKN passe de la rétine au corps géniculé latéral, au lobe occipital et au flocculus cérébelleux et se connecte aux motoneurones oculaires³. Des lésions neuronales n’importe où le long de ces voies neuronales peuvent entraîner des changements dans les réponses OKN. La réponse OKN est utilisée comme outil pour évaluer la symétrie cérébrale, la cécité psychogène et l’acuité visuelle chez les patients humains ^4,5. L’acuité visuelle est évaluée en quantifiant les réponses fonctionnelles, qui peuvent faire partie intégrante de la détermination du succès des traitements et des expériences centrés sur la restauration de la vision perdue en raison de maladies neurodégénératives ^3,6,7. Chez les animaux, les réponses OKN peuvent être utilisées pour évaluer avec précision l’acuité visuelle, ce qui permet aux chercheurs de collecter des données quantitatives et qualitatives concernant la fonction visuelle. Chez les rongeurs, il est possible de mesurer l’acuité visuelle de l’œil gauche et de l’œil droit indépendamment en fonction du sens de rotation des bandes dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre⁸. Ce mouvement dans le sens inverse des aiguilles d’une montre et dans le sens des aiguilles d’une montre expose chaque œil au mouvement naso-temporal (N-T) ou tempo-nasal (T-N)⁹, respectivement. Le stimulus T-N entraîne une réponse nettement plus élevée par rapport au stimulus N-T, car les rongeurs sont plus sensibles aux dangers venant de l’arrière ou du côté.

Auparavant, la fonction visuelle chez des rats de laboratoire normaux et des rats dégénérés rétiniens a été testée à l’aide de différentes méthodes de test OKN 6,10,11,12,13. Cependant, certaines variabilités dans les scores d’acuité visuelle sont observées entre les différentes études, y compris les données présentées dans la présente étude. Cette variabilité peut être principalement attribuée aux différences dans la configuration de test utilisée. Les différences dans la taille de l’arène de test et le type de stimuli visuels OKN utilisés ^6,10 peuvent être les principaux facteurs. Les stimuli utilisés dans ces expériences comprennent des réseaux sinusoïdaux pour l’apparition d’un cylindre virtuel¹⁴, des cylindres rotatifs interchangeables¹⁵ et des bandes à contraste élevé (noir et blanc) affichées sur quatre écrans d’ordinateur¹⁰. Les principales limitations associées à ces appareils et méthodes d’essai OKN comprennent la grande taille de l’équipement, le mouvement des animaux dans l’arène d’essai et l’incidence fréquente des chutes de l’animal de la plate-forme d’essai ^7,11,12.

Pour minimiser les limitations ci-dessus, un nouvel appareil pour les tests OKN chez le rat a été développé. Cet appareil est relativement peu coûteux, s’est avéré efficace, facile à utiliser et permet d’évaluer la fonction visuelle (Figure 1). L’appareil utilise deux écrans de tablette pour afficher les stimuli visuels OKN (logiciel de visualisation) à différentes fréquences spatiales. Une micro-caméra est utilisée pour enregistrer les activités de l’animal pendant les tests afin d’analyser ultérieurement les données. Dans le but de fabriquer un appareil OKN facile à installer dans les laboratoires de recherche, cette nouvelle configuration décrit les modifications critiques apportées à l’appareil de test OKN existant. Les stimuli OKN utilisés ici sont constitués de bandes noires et blanches à différentes fréquences spatiales et différentes directions de rotation (de gauche à droite ou de droite à gauche). Le composant principal de l’appareil de test OKN comprend deux écrans de tablette à écran tactile (7,9 pouces) utilisés pour afficher les stimuli OKN (Figure 2). Deux supports réglables sont utilisés pour maintenir les écrans de la tablette dans la position souhaitée. Les supports sont solidement fixés au bord d’une table d’intervention qui permet d’ajuster sa hauteur et son angle. Les rats sont placés dans un support à rats qui fait face aux écrans d’affichage. Les supports à rats sont fabriqués en tube de plastique transparent (polyméthacrylate de méthyle). Le support est fixé à un piédestal et à un support métallique pour assurer un placement stable sur la table d’intervention. La taille des tubes de retenue varie de 4 à 6 pouces de longueur et de 2,5 à 3 pouces de diamètre, selon la taille des rats utilisés. La distance entre le rat et l’écran d’affichage est ajustée en changeant la position du support pour rat. Le support pour rats aide à maintenir une exposition continue de la tête du rat vers les écrans d’affichage et réduit ses mouvements pendant les tests. Une micro-caméra est utilisée pour enregistrer les réponses de suivi de la tête. Les défauts de cette nouvelle configuration incluent des taux de rafraîchissement différents pour l’écran et la possibilité d’illusions d’optique lors de l’utilisation de bandes étroites. Cependant, ces problèmes peuvent être considérés comme courants associés à une configuration OKN sur ordinateur. En plus des problèmes ci-dessus, dans la configuration actuelle, les rats ne sont pas testés à l’aide d’un cylindre virtuel¹⁴ qui influence la réponse optimale de l’OKN. La nouveauté de cette méthode réside dans la technique et l’appareil dans lesquels la méthode est employée. Cette technique peut être facilement mise en place dans les laboratoires de recherche pour une mesure fiable de l’acuité visuelle chez les rongeurs.

Protocole

Toutes les procédures sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives expérimentales approuvées par les autorités régionales et acceptées par l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) de l’Université de Californie du Sud (USC), et conformément à la déclaration de l’Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) pour l’utilisation des animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et à la directive européenne 2010/63/UE sur la protection des animaux utilisés à des fins scientifiques.

REMARQUE : Les rats utilisés dans cette étude sont des rats pigmentés dégénérés de la rétine du Royal College of Surgeons (RCS) et des rats Long Evans (LE). La figure 3 montre une illustration schématique montrant les différentes étapes des tests et de l’analyse OKN.

1. Procédures

1. Préparation de la configuration
   1. Gardez le rat dans la cage et pendant 30 minutes à l’intérieur de la salle de test avec les lumières de la pièce éteintes.
      REMARQUE : Cela permet de minimiser le stress qui se produit pendant le transport et fournit des conditions d’éclairage uniformes pour toutes les expériences.
   2. Réglez la position des écrans de la tablette face à face à 155° pour afficher l’application Web de visualisation OKN Stripes.
   3. Placez le support de rat au milieu de deux écrans de tablette à 4,5 pouces du centre.
      REMARQUE : À cette position, la tête du rat sera à environ 3.5 pouces de l’écran d’affichage.
   4. Cliquez sur OKN Stripes Visualization Web Application depuis le bureau de la tablette pour afficher les stimuli visuels (bandes noires et blanches) en commençant par la fréquence spatiale la plus basse.
      REMARQUE : Les fréquences spatiales 0,08, 0,15, 0,2, 0,24, 0,28, 0,33, 0,38 cycles par degrés (c/d) sont utilisées, en commençant par la fréquence spatiale la plus basse (0,08 c/d) et en passant à des fréquences spatiales plus élevées (jusqu’à 0,38 c/d). À chaque fréquence spatiale, les rats sont testés dans le sens des aiguilles d’une montre et dans le sens inverse des aiguilles d’une montre en rotation des bandes (1 min chacune).
2. Procédure de test OKN
   1. Sélectionnez un porte-rat d’une taille appropriée.
   2. Amenez le rat vers l’ouverture du support pour rats et guidez-le soigneusement vers l’intérieur.
   3. Laissez le rat se déposer à l’intérieur du support (1 à 2 min) avant de tester.
      REMARQUE : Avec une manipulation appropriée, il est possible de maintenir le rat à l’intérieur du support dans la plupart des cas ; Si nécessaire, le support de rat est tenu haut (jusqu’à 2 pieds au-dessus de la table) pendant quelques secondes jusqu’à ce que le rat se calme. La peur de la hauteur réduit la tendance du rat à descendre du rat de son porte-rat. Un temps supplémentaire (1 à 2 min) est accordé au rat pour s’installer, si nécessaire.
   4. Insérez le piédestal du support rat dans le support métallique pour son placement stable.
      REMARQUE : Cette configuration permet de modifier la distance de visualisation du rat depuis l’écran de la tablette.
   5. Allumez l’appareil photo pour démarrer l’enregistrement vidéo.
   6. Cliquez sur OKN Stripes Visualization Web Application depuis le bureau de l’écran de la tablette et lancez l’exécution du programme.
   7. Exécutez les stimuli OKN dans le sens de gauche à droite ou de droite à gauche.
      REMARQUE : La rotation des bandes dans le sens des aiguilles d’une montre active l’œil gauche, tandis que la rotation dans le sens inverse des aiguilles d’une montre active l’œil droit. Le sens de rotation initial a été choisi au hasard pour éviter une éventuelle accoutumance.
   8. Observez le comportement de suivi de la tête du rat.
   9. Commencez à tester en utilisant la fréquence spatiale la plus basse (0,08 c/j), puis augmentez la fréquence spatiale dans un ordre progressif (croissant).
   10. Notez la présence ou l’absence de réponses OKN.
   11. Continuez les tests, aucune période de repos n’est donnée entre les différentes fréquences spatiales.
   12. Arrêtez l’enregistrement vidéo après avoir terminé toutes les fréquences spatiales et enregistrez les données à l’aide du numéro d’identification du rat.
   13. Sortez le rat de son support et placez-le dans la cage pendant environ 30 minutes de repos entre deux tests consécutifs.
   14. Répétez les tests trois fois par rat.

2. Analyse des données

1. Examinez la vidéo enregistrée et déterminez l’acuité visuelle de chaque rat en trouvant les fréquences spatiales auxquelles le rat a réagi.
2. Enregistrez toutes les réponses (présence ou absence d’un suivi clair de la tête) dans une feuille de calcul.
3. Trouvez la fréquence spatiale la plus élevée à laquelle un rat a réagi à partir des trois tests. Ceci est considéré comme l’acuité visuelle finale.
   REMARQUE : Étant donné que la mesure de l’acuité visuelle est subjective, les données seront évaluées par deux membres du personnel d’étude indépendants pour confirmer le score d’acuité visuelle de chaque rat¹². Les résultats sont recoupés jusqu’à ce que la note finale soit convenue. Une réponse OKN positive est définie comme la présence d’une activité de suivi de la tête claire et soutenue. Le suivi aléatoire de la tête (sans rapport avec les stimuli visuels de l’OKN) ou l’absence de tout mouvement de la tête est considéré comme une réponse négative de l’OKN.
4. Effectuez une analyse statistique pour comparer les groupes ou entre les deux yeux (œil gauche vs œil droit).
   REMARQUE : Examinez les enregistrements vidéo pour préciser si des réponses positives ou négatives sont apportées au besoin.

Résultats

Le test OKN a été effectué sur des rats dégénérés de la rétine (RD) du Royal College of Surgeons (RCS) et des rats normaux Long Evans (LE) appariés selon l’âge. Les rats LE (n = 4) ont été utilisés pour établir les données de base afin de déterminer les scores d’acuité visuelle chez les rats normaux à l’aide de la nouvelle configuration. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide de Microsoft Excel (moyenne ± écart-type). Les rats LE ont montré un s...

Discussion

L’OKN est un mouvement réflexe en dents de scie des yeux en réponse à un stimulus dérivant, qui est utilisé comme outil pour évaluer l’acuité visuelle chez les sujets humains³. Chez les animaux, y compris les primates et les rongeurs, le test OKN est utilisé comme mesure quantitative de la fonction visuelle. La présente étude décrit un nouvel appareil OKN peu coûteux qui peut être facilement installé dans les laboratoires de recherche pour les te...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
iPad Mini	Apple	A1489	Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software.
Micro-camera/Micro-Camera Attachment	Lanon	B097H6WWDS	The micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions.
Plexiglass Tube/Rat Holder	Best Acrylics	B07KMF31MC	The Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab.
Plexiglass Tube Attachment	Best Acrylics	B07KMF31MC	This attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated.
Screen Holders	Kabcon	B08JLRPKQ1	Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat.
OKN Stripes Visualization Web Application	The MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushin	https://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/	This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies