Eine neue optokinetische Testmethode zur Messung des Sehvermögens von Ratten

Zusammenfassung

Die Verhaltenstestmethode des optokinetischen Nystagmus (OKN) wird zur Beurteilung der Sehschärfe bei Nagetieren eingesetzt. Hier wird eine einfache Methode demonstriert, die leicht in Forschungslaboratorien eingesetzt werden kann, um die Sehfunktion sowohl bei normalen als auch bei experimentellen Ratten zuverlässig beurteilen zu können.

Zusammenfassung

Der optokinetische Nystagmus (OKN) ist eine reflexive Augenbewegung, die durch die Bewegung visueller Reize im Gesichtsfeld ausgelöst wird. Die mit OKN verbundene Head-Tracking-Bewegung wird häufig als Maß für die visuelle Funktion bei Nagetieren verwendet. Um OKN-Antworten bei normalen und experimentellen Ratten aufzuzeichnen, wurde eine einfache und kostengünstige Apparatur entwickelt. Dieses Setup verwendet zwei Tablet-Bildschirme, um den visuellen Stimulus von OKN anzuzeigen, der aus kontrastreichen schwarzen und weißen Streifen besteht, die mit der OKN Stripes Visualization Web Application, einer frei verfügbaren Software, generiert wurden. Die Ratte befindet sich in einem durchsichtigen Plexiglashalter, der die Bewegung begrenzt, so dass der Kopf der Ratte ständig auf den OKN-Bildschirm zeigt. Die Position des Rattenhalters kann geändert werden, um den Abstand zwischen der Ratte und dem Bildschirm einzustellen. Eine Mikrokamera, die über dem Rattenhalter positioniert ist, wird verwendet, um die visuellen Aktivitäten der Ratte aufzuzeichnen. Diese Aufzeichnungen können für quantitative Bewertungen verwendet werden. Basierend auf dem Vorhandensein oder Fehlen von klarem Head-Tracking können die OKN-Antworten bei unterschiedlichen Ortsfrequenzen bestimmt werden. Die gesammelten Daten zeigen eine neuartige Technik zur zuverlässigen Messung der Sehschärfe bei normalen und netzhautdegenerierten Ratten.

Einleitung

Wenn das Auge einer anhaltenden vollflächigen visuellen Bewegung ausgesetzt ist, entsteht in Richtung der visuellen Bewegung ein deutliches Muster aus schnellen und gleichmäßigen Augenbewegungen und Kopfbewegungen mit geringer Beschleunigung, das als optokinetischer Nystagmus (OKN^{) bezeichnet wird1,2}. Der neurologische Signalweg der OKN verläuft von der Netzhaut zum lateralen Genikulatkörper, zum Okzipitallappen und zum Kleinhirnflocken und verbindet sich mit den okulären Motoneuronen³. Neuronale Schäden an einer beliebigen Stelle entlang dieser neuronalen Bahnen können zu Veränderungen in den OKN-Antworten führen. Das OKN-Ansprechen wird als Instrument zur Beurteilung der zerebralen Symmetrie, der psychogenen Blindheit und der Sehschärfe bei menschlichen Patienten verwendet ^4,5. Die Sehschärfe wird durch die Quantifizierung funktioneller Reaktionen bewertet, die für den Erfolg von Behandlungen und Experimenten zur Wiederherstellung des aufgrund neurodegenerativer Erkrankungen verlorenen Sehvermögens eine wesentliche Rolle spielen^{können 3,6,7}. Bei Tieren können OKN-Antworten verwendet werden, um die Sehschärfe genau zu beurteilen, was den Forschern die Möglichkeit gibt, sowohl quantitative als auch qualitative Daten zur Sehfunktion zu sammeln. Bei Nagetieren ist es möglich, die Sehschärfe des linken und des rechten Auges unabhängig voneinander anhand der Drehrichtung der Streifen sowohl im Uhrzeigersinn als auch gegen den Uhrzeigersinn zu messen⁸. Diese Bewegung gegen den Uhrzeigersinn und im Uhrzeigersinn setzt jedes Auge entweder einer nasotemporalen (N-T) bzw. einer tempo-nasalen (T-N) Bewegung⁹ aus. Der T-N-Stimulus führt zu einer signifikant höheren Reaktion im Vergleich zum N-T-Stimulus, da Nagetiere empfindlicher auf die Gefahren reagieren, die von hinten oder von der Seite kommen.

Zuvor wurde die Sehfunktion bei normalen Laborratten und netzhautdegenerierten Ratten mit verschiedenen OKN-Testmethoden getestet 6,10,11,12,13. Gewisse Variabilitäten in den Sehschärfewerten werden jedoch zwischen verschiedenen Studien beobachtet, einschließlich der Daten, die in der vorliegenden Untersuchung gezeigt werden. Diese Variabilität ist vor allem auf die Unterschiede im verwendeten Testaufbau zurückzuführen. Unterschiede in der Größe der Testarena und der Art der verwendeten visuellen OKN-Reize ^6,10 können die Hauptfaktoren sein. Die in diesen Experimenten verwendeten Stimuli umfassen Sinuswellengitter für das Erscheinungsbild eines virtuellen Zylinders¹⁴, austauschbare rotierende Zylinder¹⁵ und kontrastreiche (schwarz-weiße) Streifen, die auf vier Computermonitoren¹⁰ angezeigt werden. Zu den wichtigsten Einschränkungen im Zusammenhang mit diesen OKN-Testgeräten und -methoden gehören die Größe der Ausrüstung, die Bewegung der Tiere in der Testarena und das häufige Auftreten, dass das Tier von der Testplattform fällt ^7,11,12.

Um die oben genannten Einschränkungen zu minimieren, wurde ein neues Gerät für OKN-Tests an Ratten entwickelt. Dieses Gerät ist vergleichsweise kostengünstig, hat sich als effizient und einfach zu bedienen erwiesen und ermöglicht die Beurteilung der Sehfunktion (Abbildung 1). Das Gerät verwendet zwei Tablet-Bildschirme, um die visuellen Reize von OKN (Visualisierungssoftware) in unterschiedlichen Raumfrequenzen anzuzeigen. Eine Mikrokamera wird verwendet, um die Aktivitäten des Tieres während der Tests aufzuzeichnen und die Daten später zu analysieren. Mit dem Ziel, ein einfach einzurichtendes OKN-Gerät in Forschungslabors zu schaffen, beschreibt dieses neue Setup kritische Änderungen an dem bestehenden OKN-Prüfgerät. Die hier verwendeten OKN-Stimuli bestehen aus schwarzen und weißen Streifen mit unterschiedlichen Ortsfrequenzen und unterschiedlichen Drehrichtungen (von links nach rechts oder von rechts nach links). Die Hauptkomponente der OKN-Testvorrichtung besteht aus zwei Touchscreen-Tablet-Bildschirmen (7,9 Zoll), die zur Anzeige der OKN-Stimuli verwendet werden (Abbildung 2). Zwei verstellbare Halterungen dienen dazu, die Tablet-Bildschirme in der gewünschten Position zu halten. Die Halterungen sind sicher an der Kante des Eingriffstisches befestigt, wodurch die Höhe und der Winkel eingestellt werden können. Die Ratten werden in einen Rattenhalter gelegt, der den Bildschirmen zugewandt ist. Die Rattenhalter sind aus transparentem Kunststoffrohr (Polymethylmethacrylat) gefertigt. Der Halter ist an einem Sockel und einem Metallständer befestigt, um einen stabilen Platz auf dem Eingriffstisch zu gewährleisten. Die Größe der Halteröhrchen variiert zwischen 4 und 6 Zoll in der Länge und 2,5 bis 3 Zoll im Durchmesser, abhängig von der Größe der verwendeten Ratten. Der Abstand zwischen der Ratte und dem Bildschirm wird durch Ändern der Position des Rattenhalters eingestellt. Der Rattenhalter trägt dazu bei, dass der Kopf der Ratte kontinuierlich den Bildschirmen ausgesetzt ist und ihre Bewegungen während des Tests reduziert werden. Eine Mikrokamera wird verwendet, um die Head-Tracking-Antworten aufzuzeichnen. Zu den Mängeln dieses neuen Setups gehören unterschiedliche Bildwiederholraten für den Bildschirm und die Möglichkeit optischer Täuschungen bei der Verwendung von schmalen Streifen. Dies kann jedoch als häufige Probleme im Zusammenhang mit einem computerbasierten OKN-Setup angesehen werden. Zusätzlich zu den oben genannten Problemen werden Ratten in der aktuellen Konfiguration nicht mit einem virtuellen Zylinder¹⁴ getestet, der die optimale OKN-Reaktion beeinflusst. Die Neuheit dieses Verfahrens liegt in der Technik und der Vorrichtung, in der das Verfahren angewendet wird. Diese Technik kann leicht in Forschungslabors für eine zuverlässige Sehschärfemessung bei Nagetieren eingesetzt werden.

Protokoll

Alle Tierversuche wurden in Übereinstimmung mit den von den regionalen Behörden genehmigten und vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) an der University of Southern California (USC) akzeptierten Versuchsrichtlinien durchgeführt und entsprachen der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Ophthalmologie- und Sehforschung und der europäischen Richtlinie 2010/63/EU zum Schutz der für wissenschaftliche Zwecke verwendeten Tiere.

HINWEIS: Bei den in dieser Studie verwendeten Ratten handelt es sich um pigmentierte, netzhautdegenerierte Ratten des Royal College of Surgeons (RCS) und der Long Evans (LE) Ratten. Abbildung 3 zeigt eine schematische Darstellung, die die verschiedenen Phasen der OKN-Tests und -Analyse zeigt.

1. Verfahren

1. Vorbereitung des Setups
   1. Halten Sie die Ratte im Käfig und 30 Minuten lang bei ausgeschalteter Raumbeleuchtung im Testraum.
      HINWEIS: Dies trägt dazu bei, die während des Transports auftretenden Belastungen zu minimieren und sorgt für gleichmäßige Lichtverhältnisse bei allen Experimenten.
   2. Legen Sie die Position der Tablet-Bildschirme in einem Winkel von 155° fest, um die OKN Stripes Visualization Webanwendung anzuzeigen.
   3. Platzieren Sie den Rattenhalter in der Mitte von zwei Tablet-Bildschirmen in einem Abstand von 4,5 Zoll von der Mitte.
      HINWEIS: In dieser Position ist der Kopf der Ratte etwa 3,5 Zoll vom Bildschirm entfernt.
   4. Klicken Sie auf dem Desktop des Tablets auf OKN Stripes Visualization Web Application , um visuelle Reize (schwarze und weiße Streifen) beginnend mit der niedrigsten Ortsfrequenz anzuzeigen.
      HINWEIS: Es werden Ortsfrequenzen von 0,08, 0,15, 0,2, 0,24, 0,28, 0,33, 0,38 Zyklen pro Grad (c/d) verwendet, beginnend bei der niedrigsten Ortsfrequenz (0,08c/d) und wechselnd zu höheren Ortsfrequenzen (bis zu 0,38 c/d). Bei jeder Ortsfrequenz werden die Ratten sowohl im Uhrzeigersinn als auch gegen den Uhrzeigersinn in Rotation der Streifen (jeweils 1 min) getestet.
2. OKN Prüfverfahren
   1. Wählen Sie einen Rattenhalter in einer geeigneten Größe.
   2. Bringen Sie die Ratte zur Öffnung des Rattenhalters und führen Sie die Ratte vorsichtig ins Innere.
   3. Lassen Sie die Ratte vor dem Test in der Halterung einwirken (1-2 Minuten).
      HINWEIS: Bei sachgemäßer Handhabung ist es in den meisten Fällen möglich, die Ratte in der Halterung zu halten; Bei Bedarf wird der Rattenhalter einige Sekunden lang hoch gehalten (bis zu 2 Fuß über dem Tisch), bis sich die Ratte beruhigt hat. Es wurde festgestellt, dass die Angst vor der Höhe die Tendenz der Ratte verringert, vom Rattenhalter herunterzuklettern. Bei Bedarf wird der Ratte zusätzliche Zeit (1-2 Minuten) gegeben, um sich zu beruhigen.
   4. Setzen Sie den Sockel des Rattenhalters in den Metallständer ein, um ihn stabil zu platzieren.
      HINWEIS: Mit diesem Setup können Sie den Betrachtungsabstand der Ratte vom Tablet-Bildschirm aus ändern.
   5. Schalten Sie die Kamera ein, um die Videoaufnahme zu starten.
   6. Klicken Sie auf dem Desktop des Tablet-Bildschirms auf OKN Stripes Visualization Web Application und starten Sie die Ausführung des Programms.
   7. Lassen Sie die OKN-Stimuli von links nach rechts oder von rechts nach links laufen.
      HINWEIS: Durch die Drehung der Streifen im Uhrzeigersinn wird das linke Auge aktiviert, während durch die Drehung gegen den Uhrzeigersinn das rechte Auge aktiviert wird. Die anfängliche Drehrichtung wurde zufällig gewählt, um eine mögliche Gewöhnung zu vermeiden.
   8. Beobachte das Head-Tracking-Verhalten der Ratte.
   9. Beginnen Sie den Test mit der niedrigsten Ortsfrequenz (0,08 c/d) und erhöhen Sie dann die Ortsfrequenz schrittweise (in aufsteigender Reihenfolge).
   10. Beachten Sie das Vorhandensein oder Fehlen von OKN-Antworten.
   11. Weiter testen, es ist keine Ruhezeit zwischen verschiedenen Ortsfrequenzen angegeben.
   12. Stoppen Sie die Videoaufzeichnung, nachdem Sie alle Ortsfrequenzen ausgefüllt haben, und speichern Sie die Daten unter Verwendung der Rattenidentifikationsnummer.
   13. Nehmen Sie die Ratte aus der Halterung und legen Sie sie für ca. 30 Minuten Ruhezeit zwischen aufeinanderfolgenden Tests in den Käfig.
   14. Wiederholen Sie die Tests dreimal pro Ratte.

2. Datenanalyse

1. Überprüfen Sie das aufgezeichnete Video und bestimmen Sie die Sehschärfe jeder Ratte, indem Sie die räumlichen Frequenzen ermitteln, bei denen die Ratte reagiert hat.
2. Erfassen Sie alle Antworten (Vorhandensein oder Fehlen eines klaren Head-Trackings) in einer Tabelle.
3. Ermitteln Sie die höchste Ortsfrequenz, auf die eine Ratte aus den drei Tests reagiert hat. Dies gilt als endgültige Sehschärfe.
   HINWEIS: Da die Messung der Sehschärfe subjektiv ist, werden die Daten von zwei unabhängigen Studienmitarbeitern ausgewertet, um den Sehschärfewert für jede Ratte¹² zu bestätigen. Die Ergebnisse werden gegengeprüft, bis das Endergebnis vereinbart ist. Eine positive OKN-Reaktion ist definiert als das Vorhandensein einer klaren und anhaltenden Head-Tracking-Aktivität. Zufälliges Head-Tracking (unabhängig von den visuellen Reizen von OKN) oder das Fehlen jeglicher Kopfbewegung wird als negative OKN-Reaktion angesehen.
4. Führen Sie statistische Analysen durch, um Gruppen oder zwischen den beiden Augen (linkes Auge vs. rechtes Auge) zu vergleichen.
   HINWEIS: Überprüfen Sie die Videoaufzeichnungen, um klarzustellen, dass bei Bedarf positive oder negative Antworten durchgeführt werden.

Ergebnisse

Der OKN-Test wurde an retinalen degenerierten (RD) Ratten des Royal College of Surgeons (RCS) und altersgleichen normalen Long Evans (LE) Ratten durchgeführt. Die LE-Ratten (n = 4) wurden verwendet, um die Ausgangsdaten zur Bestimmung der Sehschärfewerte bei normalen Ratten unter Verwendung des neuen Setups zu ermitteln. Die statistische Auswertung erfolgte mit Microsoft Excel (Mittelwert ± Standardabweichung). LE-Ratten zeigten ein robustes Head-Tracking bei Ortsfrequenzen von 0,15 c...

Diskussion

OKN ist eine reflexive Sägezahnbewegung der Augen als Reaktion auf einen driftenden Reiz, die als Werkzeug zur Beurteilung der Sehschärfe bei menschlichen Probanden verwendet wird³. Bei Tieren, einschließlich Primaten und Nagetieren, wird der OKN-Test als quantitative Messung der Sehfunktion eingesetzt. Die vorliegende Studie beschreibt eine neuartige, kostengünstige OKN-Apparatur, die einfach in Forschungslabors für OKN-Verhaltenstests an Ratten aufgestellt ...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
iPad Mini	Apple	A1489	Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software.
Micro-camera/Micro-Camera Attachment	Lanon	B097H6WWDS	The micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions.
Plexiglass Tube/Rat Holder	Best Acrylics	B07KMF31MC	The Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab.
Plexiglass Tube Attachment	Best Acrylics	B07KMF31MC	This attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated.
Screen Holders	Kabcon	B08JLRPKQ1	Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat.
OKN Stripes Visualization Web Application	The MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushin	https://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/	This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies