JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

שיטת הבדיקה ההתנהגותית ניסטגמוס אופטוקינטית (OKN) משמשת להערכת חדות הראייה במכרסמים. כאן מודגמת שיטה פשוטה שניתן להגדיר בקלות במעבדות מחקר להערכה אמינה של תפקוד הראייה בחולדות רגילות וניסיוניות כאחד.

Abstract

ניסטגמוס אופטוקינטי (OKN) היא תנועת עיניים רפלקסיבית המופעלת על ידי תנועה של גירויים חזותיים בשדה הראייה. תנועת מעקב הראש הקשורה ל-OKN משמשת בדרך כלל כמדד לתפקוד הראייה במכרסמים. כדי לתעד תגובות OKN בחולדות רגילות וניסיוניות, פותח מכשיר פשוט וזול. הגדרה זו משתמשת בשני מסכי טאבלט כדי להציג את הגירוי החזותי של OKN המורכב מפסים שחורים ולבנים בעלי ניגודיות גבוהה שנוצרו באמצעות יישום האינטרנט OKN Stripes Visualization, תוכנה זמינה בחינם. החולדה ממוקמת בתוך מחזיק פרספקס שקוף המגביל את התנועה כך שראש החולדה פונה ברציפות למסך התצוגה OKN. ניתן לשנות את מיקום מחזיק החולדה כדי להתאים את המרחק בין החולדה למסך התצוגה. מיקרו-מצלמה הממוקמת מעל מחזיק החולדה משמשת להקלטת הפעילויות החזותיות של החולדה. ניתן להשתמש בהקלטות אלה להערכות כמותיות. בהתבסס על נוכחות או היעדר מעקב ראש ברור, ניתן לקבוע את תגובות ה-OKN בתדרים מרחביים שונים. הנתונים שנאספו מדגימים טכניקה חדשה למדידה אמינה של חדות הראייה בחולדות נורמליות ומנוונות רשתית.

Introduction

כאשר העין נחשפת לתנועה חזותית מתמשכת בשדה מלא, דפוס מובהק של מעקב אחר תנועות עיניים מהירות וחלקות ותנועות ראש בתאוצה נמוכה מופיע בכיוון התנועה החזותית, הנקרא ניסטגמוס אופטוקינטי (OKN)1,2. המסלול הנוירולוגי של OKN עובר מהרשתית לגוף הגניקולט הרוחבי, האונה העורפית ופקק המוח הקטן ומתחבר לנוירונים המוטוריים של העין3. נזק עצבי בכל מקום לאורך מסלולים עצביים אלה עלול להוביל לשינויים בתגובות OKN. תגובת OKN משמשת ככלי להערכת סימטריה מוחית, עיוורון פסיכוגני וחדות ראייה בחולים אנושיים 4,5. חדות הראייה מוערכת על ידי כימות תגובות תפקודיות, שיכולות להיות חלק בלתי נפרד בקביעת הצלחת הטיפולים והניסויים המתמקדים בשיקום הראייה שאבדה עקב מחלות ניווניות 3,6,7. בבעלי חיים, ניתן להשתמש בתגובות OKN כדי להעריך במדויק את חדות הראייה, מה שמספק לחוקרים את היכולת לאסוף נתונים כמותיים ואיכותיים לגבי תפקוד הראייה. במכרסמים ניתן למדוד את חדות הראייה של העין השמאלית והימנית באופן עצמאי על סמך כיוון הסיבוב של הפסים הן בכיוון השעון והן נגד כיוון השעון8. תנועה זו נגד כיוון השעון ועם כיוון השעון חושפת כל עין לתנועה אף-טמפורלית (N-T) או טמפו-אף(T-N) 9, בהתאמה. גירוי ה-T-N מביא לתגובה גבוהה משמעותית בהשוואה לגירוי N-T מכיוון שמכרסמים רגישים יותר לסכנות המגיעות מאחור או מהצד.

בעבר, תפקוד הראייה בחולדות מעבדה רגילות ובחולדות מנוונות ברשתית נבדק באמצעות שיטות בדיקה שונות של OKN 6,10,11,12,13. עם זאת, שונות מסוימת בציוני חדות הראייה נצפות בין מחקרים שונים, כולל הנתונים המוצגים במחקר הנוכחי. ניתן לייחס שונות זו בעיקר להבדלים במערך הבדיקה בו נעשה שימוש. הבדלים בגודל זירת הבדיקה ובסוג הגירויים החזותיים של OKN בשימוש 6,10 יכולים להיות הגורמים העיקריים. הגירויים ששימשו בניסויים אלה כוללים סורגי גלי סינוס להופעת גליל וירטואלי14, גלילים מסתובבים מתחלפים15 ופסים בעלי ניגודיות גבוהה (שחור ולבן) המוצגים על ארבעה צגי מחשב10. המגבלות העיקריות הקשורות למכשירי ושיטות הבדיקה הללו של OKN כוללות את הגודל הגדול של הציוד, תנועת בעלי החיים בזירת הניסוי ושכיחות תכופה של נפילת בעל חיים מפלטפורמת הבדיקה 7,11,12.

כדי למזער את המגבלות הנ"ל, פותח מנגנון חדש לבדיקת OKN בחולדות. מכשיר זה הוא זול יחסית, הוכח כיעיל, קל לתפעול ומאפשר הערכה של תפקוד הראייה (איור 1). המכשיר משתמש בשני מסכי טאבלט כדי להציג את הגירויים החזותיים OKN (תוכנת הדמיה) בתדרים מרחביים שונים. מיקרו-מצלמה משמשת לתיעוד פעילויות החיה במהלך הבדיקה לניתוח מאוחר יותר של הנתונים. במטרה ליצור מכשיר OKN קל להתקנה במעבדות מחקר, הגדרה חדשה זו מתארת שינויים קריטיים במנגנון הבדיקה הקיים של OKN. גירוי ה-OKN המשמש כאן מורכב מפסים שחורים ולבנים בתדרים מרחביים שונים וכיווני סיבוב שונים (משמאל לימין או מימין לשמאל). המרכיב העיקרי של מכשיר הבדיקה OKN כולל שני מסכי טאבלט עם מסך מגע (7.9 אינץ') המשמשים להצגת גירוי OKN (איור 2). שני מחזיקים מתכווננים משמשים להחזקת מסכי הטאבלט במיקום הרצוי. המחזיקים מחוברים היטב לקצה שולחן הליכים המאפשר התאמת גובהו וזוויתו. החולדות מונחות במחזיק חולדות הפונה למסכי התצוגה. מחזיקי החולדות עשויים צינור פלסטיק שקוף (פולימתיל מתאקרילט). המחזיק מחובר לכן ולמעמד מתכת כדי להבטיח מיקום יציב על שולחן ההליכים. גודל צינורות האחיזה נע בין 4 ל-6 אינץ' אורך וקוטר 2.5 עד 3 אינץ', תלוי בגודל החולדות המשמשות. המרחק בין החולדה למסך התצוגה מותאם על ידי שינוי המיקום של מחזיק החולדה. מחזיק החולדה מסייע בשמירה על חשיפה רציפה של ראש החולדה לעבר מסכי התצוגה ומפחית את תנועותיה במהלך הבדיקה. מיקרו-מצלמה משמשת להקלטת תגובות מעקב הראש. החסרונות של הגדרה חדשה זו כוללים קצבי רענון שונים למסך ואפשרות לאשליות אופטיות בעת שימוש בפסים צרים. עם זאת, ניתן להתייחס לבעיות אלה כבעיות נפוצות הקשורות להגדרת OKN מבוססת מחשב. בנוסף לבעיות לעיל, בהגדרה הנוכחית, חולדות אינן נבדקות באמצעות גליל וירטואלי14 המשפיע על תגובת OKN האופטימלית. החידוש בשיטה זו טמון בטכניקה ובמנגנון שבהם משתמשים בשיטה. ניתן להגדיר טכניקה זו בקלות במעבדות מחקר למדידת חדות ראייה אמינה במכרסמים.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

כל ההליכים בבעלי חיים בוצעו בהתאם להנחיות הניסוי שאושרו על ידי הרשויות האזוריות והתקבלו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת דרום קליפורניה (USC), ותואמות את הצהרת האגודה לחקר הראייה והעיניים (ARVO) לשימוש בבעלי חיים במחקר עיניים וראייה וההנחיה האירופית 2010/63/EU בנושא הגנה על בעלי חיים המשמשים למטרות מדעיות.

הערה: החולדות ששימשו במחקר זה הן חולדות מנוונות רשתית פיגמנטיות (RCS) וחולדות Long Evans (LE). איור 3 מציג איור סכמטי המציג שלבים שונים של בדיקה וניתוח OKN.

1. נהלים

  1. הכנת ההתקנה
    1. שמור את החולדה בכלוב ולמשך 30 דקות בתוך חדר הבדיקה כשאורות החדר כבויים.
      הערה: זה עוזר למזער את הלחץ המתרחש במהלך ההובלה ומספק תנאי תאורה אחידים לכל הניסויים.
    2. הגדר את המיקום של מסכי הטאבלט זה מול זה ב-155° כדי להציג את OKN Stripes Visualization Web Application.
    3. הנח את מחזיק החולדה באמצע שני מסכי טאבלט במרחק של 4.5 אינץ' מהמרכז.
      הערה: במצב זה, ראש החולדה יהיה במרחק של כ-3.5 אינץ' ממסך התצוגה.
    4. לחץ על OKN Stripes Visualization Web Application משולחן העבודה של הטאבלט כדי להציג גירויים חזותיים (פסים בשחור ולבן) החל מהתדר המרחבי הנמוך ביותר.
      הערה: נעשה שימוש בתדרים מרחביים 0.08, 0.15, 0.2, 0.24, 0.28, 0.33, 0.38 מחזורים למעלות (c/d), החל מהתדר המרחבי הנמוך ביותר (0.08c/d) ומשתנה לתדרים מרחביים גבוהים יותר (עד 0.38 c/d). בכל תדר מרחבי, חולדות נבדקות הן בכיוון השעון והן נגד כיוון השעון בסיבוב של פסים (דקה אחת כל אחד).
  2. נוהל בדיקת OKN
    1. בחר מחזיק חולדה בגודל מתאים.
    2. הביאו את החולדה לכיוון פתח מחזיק החולדה והובילו בזהירות את החולדה פנימה.
    3. אפשר לחולדה להתיישב בתוך המחזיק (1-2 דקות) לפני הבדיקה.
      הערה: על ידי טיפול נכון, ניתן לשמור על החולדה בתוך המחזיק ברוב המקרים; במידת הצורך, מחזיק החולדה מוחזק גבוה (עד 2 רגל מעל השולחן) למשך מספר שניות עד שהחולדה מתייצבת. נמצא כי הפחד מהגובה מפחית את הנטייה של החולדה לרדת ממחזיק החולדה. זמן נוסף (1-2 דקות) ניתן לחולדה להתיישב, במידת הצורך.
    4. הכנס את הדום של מחזיק החולדה למעמד המתכת למיקומו היציב.
      הערה: הגדרה זו מאפשרת לשנות את החולדה viewמרחק ממסך הטאבלט.
    5. הפעל את המצלמה כדי להתחיל בהקלטת וידאו.
    6. לחץ על OKN Stripes Visualization Web Application משולחן העבודה של מסך הטאבלט והתחל להפעיל את התוכנית.
    7. הפעל את גירוי ה-OKN בכיוון שמאל לימין או מימין לשמאל.
      הערה: סיבוב הפסים בכיוון השעון מפעיל את העין השמאלית, ואילו סיבוב נגד כיוון השעון מפעיל את העין הימנית. כיוון הסיבוב הראשוני נבחר באופן אקראי כדי למנוע התרגלות פוטנציאלית.
    8. שימו לב להתנהגות מעקב הראש של החולדה.
    9. התחל לבדוק באמצעות התדר המרחבי הנמוך ביותר (0.08 c/d), ולאחר מכן הגדל את התדר המרחבי בסדר צעד (בסדר עולה).
    10. שים לב לנוכחות או היעדר תגובות OKN.
    11. המשך בדיקה, לא ניתנת תקופת מנוחה בין תדרים מרחביים שונים.
    12. הפסק את הקלטת הווידאו לאחר השלמת כל התדרים המרחביים, ושמור את הנתונים באמצעות מספר זיהוי החולדה.
    13. הוציאו את החולדה מהמחזיק והניחו אותה בכלוב למשך כ-30 דקות מנוחה בין בדיקות עוקבות.
    14. חזור על הבדיקות שלוש פעמים לכל חולדה.

2. ניתוח נתונים

  1. סקור את הסרטון המוקלט וקבע את חדות הראייה של כל חולדה על ידי מציאת התדרים המרחביים שבהם החולדה הגיבה.
  2. רשום את כל התגובות (נוכחות או היעדר מעקב ברור אחר הראש) בגיליון אלקטרוני.
  3. מצאו את התדירות המרחבית הגבוהה ביותר שאליה הגיבה חולדה משלושת הבדיקות. זה נחשב לחדות הראייה הסופית.
    הערה: מכיוון שמדידת חדות הראייה היא סובייקטיבית, הנתונים יוערכו על ידי שני אנשי מחקר עצמאיים כדי לאשר את ציון חדות הראייה עבור כל חולדה12. התוצאות נבדקות עד להסכמה על הציון הסופי. תגובת OKN חיובית מוגדרת כנוכחות של פעילות מעקב ראש ברורה ומתמשכת. מעקב ראש אקראי (שאינו קשור לגירויים החזותיים של OKN) או היעדר תנועת ראש כלשהי נחשבים לתגובת OKN שלילית.
  4. לבצע ניתוח סטטיסטי להשוואה בין קבוצות או בין שתי העיניים (עין שמאל לעומת עין ימין).
    הערה: סקור את הקלטות הווידאו כדי להבהיר שתגובות חיוביות או שליליות מתבצעות לפי הצורך.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

בדיקת OKN בוצעה באמצעות חולדות מנוונות רשתית (RD) של הקולג' המלכותי למנתחים (RCS) וחולדות לונג אוונס (LE) רגילות תואמות גיל. חולדות LE (n = 4), שימשו לקביעת נתוני הבסיס לקביעת ציוני חדות הראייה בחולדות רגילות באמצעות ההגדרה החדשה. הניתוח הסטטיסטי בוצע באמצעות מיקרוסופט אקסל (ממוצע ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

OKN היא תנועת שן מסור רפלקסיבית של העיניים בתגובה לגירוי נסחף, המשמש ככלי להערכת חדות הראייה אצל נבדקים אנושיים3. בבעלי חיים, כולל פרימטים ומכרסמים, בדיקת OKN משמשת כמדידה כמותית של תפקוד הראייה. המחקר הנוכחי מתאר מכשיר OKN חדשני וזול שניתן להקים בקלות במעבדות מח...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Disclosures

למחברים אין ניגודי אינטרסים לדווח.

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי מענקי CIRM (המכון לרפואה רגנרטיבית של קליפורניה) (DISC1-09912 PI- Thomas, DR3-07438- PI- Humayun), מענק בלתי מוגבל למחלקת העיניים ממחקר למניעת עיוורון, ניו יורק, ניו יורק, ותמיכה מקרן Bright Focus (M2016186, Thomas, PI). המחקר המדווח בפרסום זה נתמך על ידי מכון העיניים הלאומי של המכונים הלאומיים לבריאות תחת פרס מספר P30EY029220.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
iPad MiniAppleA1489Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software.
Micro-camera/Micro-Camera AttachmentLanonB097H6WWDSThe micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions. 
Plexiglass Tube/Rat HolderBest AcrylicsB07KMF31MCThe Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab.
Plexiglass Tube AttachmentBest AcrylicsB07KMF31MCThis attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated. 
Screen HoldersKabconB08JLRPKQ1Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat. 
OKN Stripes Visualization Web ApplicationThe MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushinhttps://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies

References

  1. Mustari, M. J., Ono, S. Optokinetic eye movements. Encyclopedia of Neuroscience. , Academic Press. 285-293 (2009).
  2. Gottlob, I. Ups and downs of optokinetic nystagmus. British Journal of Ophthalmology. 84, 445-447 (2000).
  3. Wester, S. T., Rizzo, J. F., Balkwill, M. D., Wall, C. Optokinetic nystagmus as a measure of visual function in severely visually impaired patients. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (10), 4542-4548 (2007).
  4. Daroff, R., Aminoff, M. Encyclopedia of the Neurological Sciences. , Elsevier, Academic Press. (2014).
  5. Squire, L., et al. Fundamental Neuroscience. , Elsevier, Academic Press. Amsterdam, Boston. (2008).
  6. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  7. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLOS One. 3 (4), 2055(2008).
  8. Segura, F., et al. Development of optokinetic tracking software for objective evaluation of visual function in rodents. Scientific Reports. 8, 10009(2018).
  9. Lev-Ari, T., Katz, H., Lustig, A., Katzir, G. Visual acuity and optokinetic directionality in the common chameleon (Chamaeleo chamaeleon). , Available from: https://www.semanticscholar.org/paper/Visual-Acuity-and-Optokinetic-Directionality-in-the-Lev-Ari-Katz/7bae131729f31f005cf64516ad7285904363c2e9 (2017).
  10. Thomas, B. B., Shi, D., Khine, K., Kim, L. A., Sadda, S. R. Modulatory influence of stimulus parameters on optokinetic head-tracking response. Neuroscience Letters. 479 (2), 92-96 (2010).
  11. Shi, D. S., et al. Characterization of optokinetic response in normal and retinal degenerate rats and mice using a computer-based testing apparatus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (13), 4422(2008).
  12. Thomas, B. B., et al. Co-grafts of human embryonic stem cell derived retina organoids and retinal pigment epithelium for retinal reconstruction in immunodeficient retinal degenerate royal college of surgeons rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 752958(2021).
  13. Thomas, B. B., et al. A new immunodeficient retinal dystrophic rat model for transplantation studies using human-derived cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (11), 2113-2125 (2018).
  14. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  15. Cameron, D., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), e50832(2013).
  16. Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 13(2010).
  17. Huang, Y. -Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 1899-1916 (2008).
  18. Sirkin, D. W., Hess, B. J., Precht, W. Optokinetic nystagmus in albino rats depends on stimulus pattern. Experimental Brain Research. 61 (1), 218-221 (1985).
  19. Dietrich, M., et al. Using optical coherence tomography and optokinetic response as structural and functional visual system readouts in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (143), e58571(2019).
  20. Rajendran Nair, D. S., et al. Long-term transplant effects of iPSC-RPE monolayer in immunodeficient RCS rats. Cells. 10 (11), 2951(2021).
  21. Kretschmer, F., Sajgo, S., Kretschmer, V., Badea, T. C. A system to measure the Optokinetic and optomotor response in mice. Journal of Neuroscience Methods. 256, 91-105 (2015).
  22. Lin, T. -C., et al. Assessment of safety and functional efficacy of stem cell-based therapeutic approaches using retinal degenerative animal models. Stem Cells International. 2017, 9428176(2017).
  23. Ryals, R. C., et al. Long-term characterization of retinal degeneration in Royal College of Surgeons Rats using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1378-1386 (2017).
  24. Di Pierdomenico, J., et al. Early events in retinal degeneration caused by rhodopsin mutation or pigment epithelium malfunction: Differences and similarities. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 14(2017).
  25. McGill, T. J., Douglas, R. M., Lund, R. D., Prusky, G. T. Quantification of spatial vision in the Royal College of Surgeons Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 932-936 (2004).
  26. Hetherington, L., Benn, M., Coffey, P., Lund, R. Sensory capacity of the Royal College of Surgeons rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3979-3983 (2000).
  27. Sauvé, Y., Pinilla, I., Lund, R. D. Partial preservation of rod and cone ERG function following subretinal injection of ARPE-19 cells in RCS rats. Vision Research. 46 (8), 1459-1472 (2006).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

OKN

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved