JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Kemirgenlerde görme keskinliğinin değerlendirilmesi için Optokinetik Nistagmus (OKN) davranışsal test yöntemi kullanılır. Burada, hem normal hem de deneysel sıçanlarda görsel fonksiyonun güvenilir bir şekilde değerlendirilmesi için araştırma laboratuvarlarında kolayca kurulabilecek basit bir yöntem gösterilmiştir.

Özet

Optokinetik nistagmus (OKN), görme alanındaki görsel uyaranların hareketi ile başlatılan refleksif bir göz hareketidir. OKN ile ilişkili kafa izleme hareketi, kemirgenlerde görsel işlevin bir ölçüsü olarak yaygın olarak kullanılır. Normal ve deneysel sıçanlarda OKN yanıtlarını kaydetmek için basit ve ucuz bir aparat geliştirilmiştir. Bu kurulum, ücretsiz olarak kullanılabilen bir yazılım olan OKN Stripes Visualization Web Uygulaması kullanılarak oluşturulan yüksek kontrastlı siyah beyaz çizgilerden oluşan OKN görsel uyaranını görüntülemek için iki tablet ekranı kullanır. Sıçan, sıçanın kafası sürekli olarak OKN ekranına bakacak şekilde hareketi sınırlayan şeffaf bir Pleksiglas tutucunun içine yerleştirilir. Sıçan tutucunun konumu, sıçan ile görüntü ekranı arasındaki mesafeyi ayarlamak için değiştirilebilir. Sıçan tutucunun üzerine yerleştirilmiş bir mikro kamera, sıçanın görsel aktivitelerini kaydetmek için kullanılır. Bu kayıtlar nicel değerlendirmeler için kullanılabilir. Net kafa izlemenin varlığına veya yokluğuna bağlı olarak, farklı uzamsal frekanslardaki OKN yanıtları belirlenebilir. Toplanan veriler, normal ve retinal dejenere sıçanlarda görme keskinliğinin güvenilir ölçümü için yeni bir teknik göstermektedir.

Giriş

Göz, sürekli tam alan görsel harekete maruz kaldığında, görsel hareket yönünde optokinetik nistagmus (OKN) adı verilen, hızlı ve düzgün izleyen göz hareketleri ve düşük ivmeli kafa hareketlerinden oluşan belirgin bir model ortaya çıkar1,2. OKN'nin nörolojik yolu retinadan lateral genikülat cisim, oksipital lob ve serebellar floküle geçer ve oküler motor nöronlarabağlanır 3. Bu nöral yolların herhangi bir yerindeki nöral hasar, OKN yanıtlarında değişikliklere yol açabilir. OKN yanıtı, insan hastalarda serebral simetri, psikojenik körlük ve görme keskinliğini değerlendirmek için bir araç olarak kullanılır 4,5. Görme keskinliği, nörodejeneratif hastalıklar 3,6,7 nedeniyle kaybedilen görmenin geri kazanılmasına odaklanan tedavilerin ve deneylerin başarısını belirlemede ayrılmaz olabilen fonksiyonel yanıtların ölçülmesiyle değerlendirilir. Hayvanlarda, OKN yanıtları görme keskinliğini doğru bir şekilde değerlendirmek için kullanılabilir, bu da araştırmacılara görsel işlevle ilgili hem nicel hem de nitel veri toplama yeteneği sağlar. Kemirgenlerde, sol ve sağ gözlerin görme keskinliğini, şeritlerin hem saat yönünde hem de saat yönünün tersine dönme yönüne bağlı olarak bağımsız olarak ölçmek mümkündür8. Bu saat yönünün tersine ve saat yönünde hareket, her bir gözü sırasıyla nazo-temporal (NT) veya tempo-nazal (TN) hareket9'a maruz bırakır. T-N uyaranı, N-T uyaranına kıyasla önemli ölçüde daha yüksek tepkiye neden olur, çünkü kemirgenler arkadan veya yandan gelen tehlikelere karşı daha hassastır.

Daha önce, normal laboratuvar sıçanlarında ve retinal dejenere sıçanlarda görme işlevi, farklı OKN test yöntemleri 6,10,11,12,13 kullanılarak test edilmiştir. Bununla birlikte, bu araştırmada gösterilen veriler de dahil olmak üzere, farklı çalışmalar arasında görme keskinliği skorlarında belirli farklılıklar gözlenmektedir. Bu değişkenlik çoğunlukla kullanılan test kurulumundaki farklılıklara bağlanabilir. Test alanının büyüklüğü ve kullanılan OKN görsel uyaranlarınıntüründeki farklılıklar 6,10 ana faktörler olabilir. Bu deneylerde kullanılan uyaranlar, sanal bir silindirin14 görünümü için sinüs dalgası ızgaralarını, değiştirilebilir dönen silindirleri15 ve dört bilgisayar monitöründe10 görüntülenen yüksek kontrastlı (siyah beyaz) şeritleri içerir. Bu OKN test aparatı ve yöntemleriyle ilişkili başlıca sınırlamalar arasında ekipmanın büyük boyutu, hayvanların test alanındaki hareketi ve hayvanın test platformundandüşme sıklığı yer alır 7,11,12.

Yukarıdaki sınırlamaları en aza indirmek için, sıçanlarda OKN testi için yeni bir cihaz geliştirilmiştir. Bu cihaz nispeten ucuzdur, verimli olduğu kanıtlanmıştır, kullanımı kolaydır ve görsel işlevin değerlendirilmesini sağlar (Şekil 1). Cihaz, OKN görsel uyaranlarını (görselleştirme yazılımı) farklı uzamsal frekanslarda görüntülemek için iki tablet ekranı kullanır. Verilerin daha sonra analiz edilmesi için test sırasında hayvanın aktivitelerini kaydetmek için bir mikro kamera kullanılır. Araştırma laboratuvarlarında kurulumu kolay bir OKN cihazı yapmak amacıyla, bu yeni kurulum, mevcut OKN test cihazında yapılan kritik değişiklikleri özetlemektedir. Burada kullanılan OKN uyaranları, farklı uzamsal frekanslarda ve farklı dönme yönlerinde (soldan sağa veya sağdan sola) siyah beyaz çizgilerden oluşur. OKN test cihazının ana bileşeni, OKN uyaranlarını görüntülemek için kullanılan iki dokunmatik tablet ekranını (7,9 inç) içerir (Şekil 2). Tablet ekranlarını istenilen pozisyonda tutmak için iki adet ayarlanabilir tutucu kullanılmaktadır. Tutucular, yüksekliğinin ve açısının ayarlanmasına izin veren bir prosedür masasının kenarına güvenli bir şekilde tutturulmuştur. Sıçanlar, ekranlara bakan bir sıçan tutucusuna yerleştirilir. Sıçan tutucular şeffaf plastik (polimetil metakrilat) tüpten yapılmıştır. Tutucu, prosedür masasına sabit bir şekilde yerleştirilmesini sağlamak için bir kaide ve metal bir standa tutturulmuştur. Tutma tüplerinin boyutu, kullanılan sıçanların boyutuna bağlı olarak 4 ila 6 inç uzunluğunda ve 2,5 ila 3 inç çapında değişir. Sıçan ile ekran arasındaki mesafe, sıçan tutucunun konumu değiştirilerek ayarlanır. Sıçan tutucu, sıçanın kafasının ekranlara sürekli olarak maruz kalmasına yardımcı olur ve test sırasında hareketlerini azaltır. Kafa izleme yanıtlarını kaydetmek için bir mikro kamera kullanılır. Bu yeni kurulumun eksiklikleri arasında ekran için farklı yenileme hızları ve dar şeritler kullanıldığında optik yanılsama olasılığı yer alıyor. Ancak bunlar, bilgisayar tabanlı bir OKN kurulumuyla ilişkili yaygın sorunlar olarak kabul edilebilir. Yukarıdaki sorunlara ek olarak, mevcut kurulumda sıçanlar, optimum OKN yanıtını etkileyen sanal bir silindir14 kullanılarak test edilmemektedir. Bu yöntemin yeniliği, yöntemin uygulandığı teknik ve aparatta yatmaktadır. Bu teknik, kemirgenlerde güvenilir görme keskinliği ölçümü için araştırma laboratuvarlarında kolayca kurulabilir.

Protokol

Tüm hayvan prosedürleri, bölgesel yetkililer tarafından onaylanan ve Güney Kaliforniya Üniversitesi'ndeki (USC) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından kabul edilen deneysel kılavuzlara uygun olarak gerçekleştirildi ve Görme ve Oftalmoloji Araştırmaları Derneği (ARVO) Oftalmik ve Görme Araştırmalarında Hayvanların Kullanımı Beyanı ve bilimsel amaçlarla kullanılan hayvanların korunmasına ilişkin 2010/63/EU sayılı Avrupa direktifine uygun olarak gerçekleştirildi.

NOT: Bu çalışmada kullanılan sıçanlar, pigmentli retinal dejenere Royal College of Surgeons (RCS) sıçanları ve Long Evans (LE) sıçanlarıdır. Şekil 3 , OKN test ve analizinin farklı aşamalarını gösteren şematik bir çizimi göstermektedir.

1. Prosedürler

  1. Kurulumun hazırlanması
    1. Fareyi kafeste ve oda ışıkları kapalıyken 30 dakika boyunca sınav salonunun içinde tutun.
      NOT: Bu, nakliye sırasında oluşan stresi en aza indirmeye yardımcı olur ve tüm deneyler için tek tip bir aydınlatma koşulu sağlar.
    2. OKN Stripes Görselleştirme Web Uygulamasını görüntülemek için tablet ekranlarının birbirine bakacak konumunu 155° olarak ayarlayın.
    3. Fare tutucuyu, merkezden 4,5 inç uzakta iki tablet ekranının ortasına yerleştirin.
      NOT: Bu konumda, farenin kafası ekrandan yaklaşık 3.5 inç uzakta olacaktır.
    4. En düşük uzamsal frekanstan başlayarak görsel uyaranları (siyah beyaz çizgiler) görüntülemek için tabletin masaüstünden OKN Stripes Visualization Web Uygulamasına tıklayın.
      NOT: Uzamsal frekanslar 0.08, 0.15, 0.2, 0.24, 0.28, 0.33, 0.38 derece başına döngü (c/d) kullanılır, en düşük uzamsal frekanstan (0.08c/d) başlayarak ve daha yüksek uzamsal frekanslara (0.38 c/d'ye kadar) değişir. Her uzamsal frekansta, sıçanlar, şeritlerin dönüşünde (her biri 1 dakika) hem saat yönünde hem de saat yönünün tersine test edilir.
  2. OKN test prosedürü
    1. Uygun boyutta bir fare tutucu seçin.
    2. Fareyi fare tutucusunun açıklığına doğru getirin ve fareyi dikkatlice içeriye doğru yönlendirin.
    3. Testten önce farenin tutucunun içine yerleşmesine izin verin (1-2 dakika).
      NOT: Uygun kullanımla, çoğu durumda fareyi tutucunun içinde tutmak mümkündür; Gerektiğinde, sıçan tutucusu, sıçan yerleşene kadar birkaç saniye yüksekte (masanın 2 fit yukarısına kadar) tutulur. Yükseklik korkusunun, sıçanın sıçan tutucusundan aşağı inme eğilimini azalttığı bulunmuştur. Gerekirse sıçanın yerleşmesi için ek süre (1-2 dakika) verilir.
    4. Sabit yerleşimi için fare tutucunun kaidesini metal standın içine yerleştirin.
      NOT: Bu kurulum, farenin tablet ekranından görüş mesafesinin değiştirilmesine izin verir.
    5. Video kaydına başlamak için kamerayı açın.
    6. Tablet ekranının masaüstünden OKN Stripes Visualization Web Uygulamasına tıklayın ve programı çalıştırmaya başlayın.
    7. OKN uyaranlarını soldan sağa veya sağdan sola yönde çalıştırın.
      NOT: Şeritlerin saat yönünde döndürülmesi sol gözü etkinleştirirken, saat yönünün tersine döndürülmesi sağ gözü etkinleştirir. Potansiyel alışkanlığı önlemek için ilk dönme yönü rastgele seçildi.
    8. Farenin kafa izleme davranışını gözlemleyin.
    9. En düşük uzamsal frekansı (0,08 c/d) kullanarak teste başlayın ve ardından uzamsal frekansı adım adım (artan) sırada artırın.
    10. OKN yanıtlarının varlığına veya yokluğuna dikkat edin.
    11. Teste devam edin, farklı uzamsal frekanslar arasında dinlenme süresi verilmez.
    12. Tüm uzamsal frekansları tamamladıktan sonra video kaydını durdurun ve sıçan kimlik numarasını kullanarak verileri kaydedin.
    13. Fareyi tutucudan çıkarın ve ardışık testler arasında yaklaşık 30 dakikalık dinlenme süresi boyunca kafese yerleştirin.
    14. Testleri sıçan başına üç kez tekrarlayın.

2. Veri analizi

  1. Kaydedilen videoyu gözden geçirin ve sıçanın yanıt verdiği uzamsal frekansları bularak her bir sıçanın görme keskinliğini belirleyin.
  2. Tüm yanıtları (net bir kafa izlemenin varlığı veya yokluğu) bir elektronik tabloya kaydedin.
  3. Bir sıçanın üç testten yanıt verdiği en yüksek uzamsal frekansı bulun. Bu son görme keskinliği olarak kabul edilir.
    NOT: Görme keskinliği ölçümü subjektif olduğundan, veriler her sıçan12 için görme keskinliği skorunu doğrulamak için iki bağımsız çalışma personeli tarafından değerlendirilecektir. Sonuçlar, nihai skor üzerinde anlaşmaya varılana kadar çapraz kontrol edilir. Olumlu bir OKN yanıtı, net ve sürekli bir kafa izleme faaliyetinin varlığı olarak tanımlanır. Rastgele kafa takibi (OKN görsel uyaranlarıyla ilgisi olmayan) veya herhangi bir kafa hareketinin olmaması olumsuz bir OKN yanıtı olarak kabul edilir.
  4. Grupları veya iki göz arasında (sol göz ve sağ göz) karşılaştırmak için istatistiksel analiz yapın.
    NOT: Olumlu veya olumsuz yanıtların gerektiği gibi yürütüldüğünü netleştirmek için video kayıtlarını inceleyin.

Sonuçlar

OKN testi, retinal dejenere (RD) Royal College of Surgeons (RCS) sıçanları ve yaşa uygun normal Long Evans (LE) sıçanları kullanılarak gerçekleştirildi. LE sıçanları (n = 4), yeni kurulum kullanılarak normal sıçanlarda görme keskinliği skorlarını belirlemek için temel verileri oluşturmak için kullanıldı. İstatistiksel analiz Microsoft excel (ortalama ± standart sapma) kullanılarak yapıldı. LE sıçanları, 0.15 c / d ila 0.33 c / d arasındaki uzamsal frekan...

Tartışmalar

OKN, insan deneklerde görme keskinliğini değerlendirmek için bir araç olarak kullanılan, sürüklenen bir uyarana yanıt olarak gözlerin refleksif bir testere dişi hareketidir3. Primatlar ve kemirgenler dahil olmak üzere hayvanlarda, OKN testi görsel fonksiyonun kantitatif bir ölçümü olarak kullanılır. Bu çalışma, sıçanlarda OKN davranış testi için araştırma laboratuvarlarında kolayca kurulabilen yeni, ucuz bir OKN cihazını tanımlamak...

Açıklamalar

Yazarların bildirecek herhangi bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışma, CIRM (California Rejeneratif Tıp Enstitüsü) hibeleri (DISC1-09912 PI- Thomas, DR3-07438- PI- Humayun), Körlüğü Önleme Araştırmaları'ndan Oftalmoloji Bölümü'ne Sınırsız Hibe, New York, NY ve Bright Focus Vakfı'nın (M2016186, Thomas, PI) desteği ile desteklenmiştir. Bu yayında bildirilen araştırmalar, Ulusal Sağlık Enstitüleri Ulusal Göz Enstitüsü tarafından P30EY029220 Numaralı Ödül altında desteklenmiştir.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
iPad MiniAppleA1489Two iPad Minis are used to display the OKN Stripes Visualization Software.
Micro-camera/Micro-Camera AttachmentLanonB097H6WWDSThe micro-camera is used to record the experiment. The micro-camera attachment connects to the desk and holds the camera facing the rat. The head tracking responses are recorded and assessed at varying distances, spatial frequencies, and directions. 
Plexiglass Tube/Rat HolderBest AcrylicsB07KMF31MCThe Plexiglass Tube is used to restrain the rat, with their head exposed, for the duration of the experiment. The tube is attached to another vertical plexiglass tube attachment to stabilize the rat holder during the experiment. The entire apparatus was designed and constructed in the lab.
Plexiglass Tube AttachmentBest AcrylicsB07KMF31MCThis attachment holds the rat holder in front of the iPad screens, and allows the distance between the rat and iPads to be manipulated. 
Screen HoldersKabconB08JLRPKQ1Two screen holders are used to hold the iPads up in order to display the OKN Stripes Visualization Software to the rat. 
OKN Stripes Visualization Web ApplicationThe MIT License (MIT) Copyright (c) 2016 Anton Yakushinhttps://antonyakushin.github.io/okn-stripes-visualization/This application is a freely available softeware to display visual stimuli (black and white stripes) at different frequencies

Referanslar

  1. Mustari, M. J., Ono, S. Optokinetic eye movements. Encyclopedia of Neuroscience. , 285-293 (2009).
  2. Gottlob, I. Ups and downs of optokinetic nystagmus. British Journal of Ophthalmology. 84, 445-447 (2000).
  3. Wester, S. T., Rizzo, J. F., Balkwill, M. D., Wall, C. Optokinetic nystagmus as a measure of visual function in severely visually impaired patients. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 48 (10), 4542-4548 (2007).
  4. Daroff, R., Aminoff, M. . Encyclopedia of the Neurological Sciences. , (2014).
  5. Squire, L., et al. . Fundamental Neuroscience. , (2008).
  6. Thomas, B. B., Seiler, M. J., Sadda, S. R., Coffey, P. J., Aramant, R. B. Optokinetic test to evaluate visual acuity of each eye independently. Journal of Neuroscience Methods. 138 (1-2), 7-13 (2004).
  7. Cahill, H., Nathans, J. The optokinetic reflex as a tool for quantitative analyses of nervous system function in mice: Application to genetic and drug-induced variation. PLOS One. 3 (4), 2055 (2008).
  8. Segura, F., et al. Development of optokinetic tracking software for objective evaluation of visual function in rodents. Scientific Reports. 8, 10009 (2018).
  9. Lev-Ari, T., Katz, H., Lustig, A., Katzir, G. . Visual acuity and optokinetic directionality in the common chameleon (Chamaeleo chamaeleon). , (2017).
  10. Thomas, B. B., Shi, D., Khine, K., Kim, L. A., Sadda, S. R. Modulatory influence of stimulus parameters on optokinetic head-tracking response. Neuroscience Letters. 479 (2), 92-96 (2010).
  11. Shi, D. S., et al. Characterization of optokinetic response in normal and retinal degenerate rats and mice using a computer-based testing apparatus. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 49 (13), 4422 (2008).
  12. Thomas, B. B., et al. Co-grafts of human embryonic stem cell derived retina organoids and retinal pigment epithelium for retinal reconstruction in immunodeficient retinal degenerate royal college of surgeons rats. Frontiers in Neuroscience. 15, 752958 (2021).
  13. Thomas, B. B., et al. A new immunodeficient retinal dystrophic rat model for transplantation studies using human-derived cells. Graefe's Archive for Clinical and Experimental Ophthalmology. 256 (11), 2113-2125 (2018).
  14. Prusky, G. T., Alam, N. M., Beekman, S., Douglas, R. M. Rapid quantification of adult and developing mouse spatial vision using a virtual optomotor system. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (12), 4611-4616 (2004).
  15. Cameron, D., et al. The optokinetic response as a quantitative measure of visual acuity in zebrafish. Journal of Visualized Experiments. (80), e50832 (2013).
  16. Tabata, H., Shimizu, N., Wada, Y., Miura, K., Kawano, K. Initiation of the optokinetic response (OKR) in mice. Journal of Vision. 10 (1), 13 (2010).
  17. Huang, Y. -. Y., Neuhauss, S. C. F. The optokinetic response in zebrafish and its applications. Frontiers in Bioscience: A Journal and Virtual Library. 13, 1899-1916 (2008).
  18. Sirkin, D. W., Hess, B. J., Precht, W. Optokinetic nystagmus in albino rats depends on stimulus pattern. Experimental Brain Research. 61 (1), 218-221 (1985).
  19. Dietrich, M., et al. Using optical coherence tomography and optokinetic response as structural and functional visual system readouts in mice and rats. Journal of Visualized Experiments. (143), e58571 (2019).
  20. Rajendran Nair, D. S., et al. Long-term transplant effects of iPSC-RPE monolayer in immunodeficient RCS rats. Cells. 10 (11), 2951 (2021).
  21. Kretschmer, F., Sajgo, S., Kretschmer, V., Badea, T. C. A system to measure the Optokinetic and optomotor response in mice. Journal of Neuroscience Methods. 256, 91-105 (2015).
  22. Lin, T. -. C., et al. Assessment of safety and functional efficacy of stem cell-based therapeutic approaches using retinal degenerative animal models. Stem Cells International. 2017, 9428176 (2017).
  23. Ryals, R. C., et al. Long-term characterization of retinal degeneration in Royal College of Surgeons Rats using spectral-domain optical coherence tomography. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 58 (3), 1378-1386 (2017).
  24. Di Pierdomenico, J., et al. Early events in retinal degeneration caused by rhodopsin mutation or pigment epithelium malfunction: Differences and similarities. Frontiers in Neuroanatomy. 11, 14 (2017).
  25. McGill, T. J., Douglas, R. M., Lund, R. D., Prusky, G. T. Quantification of spatial vision in the Royal College of Surgeons Rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 45 (3), 932-936 (2004).
  26. Hetherington, L., Benn, M., Coffey, P., Lund, R. Sensory capacity of the Royal College of Surgeons rat. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 41, 3979-3983 (2000).
  27. Sauvé, Y., Pinilla, I., Lund, R. D. Partial preservation of rod and cone ERG function following subretinal injection of ARPE-19 cells in RCS rats. Vision Research. 46 (8), 1459-1472 (2006).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Optokinetik NistagmusG rsel UyaranlarKafa zleme HareketiG rsel FonksiyonNormal S anlarDeney S anlarl m Tekni iPleksiglas TutucuOKN izgili G rselle tirme Web UygulamasMikro KameraG rsel AktivitelerKantitatif De erlendirmelerUzamsal FrekanslarG rme Keskinli iRetina Dejenerasyonu

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır