从mRNA中去除内部翻译起始位点，同时保留全长蛋白的表达

摘要

本方案描述了Gja1中的单个M213L突变，该突变保留了全长Connexin43生成，但阻止了较小的GJA1-20k内部翻译亚型的翻译。

摘要

CRISPR-Cas9基因编辑系统基于基因组修复机制，与传统的同源重组相比，可以更快，更轻松地生成基因修饰的小鼠模型。CRISPR-Cas9系统在需要单点突变时特别有吸引力。间隙连接蛋白Connexin 43（Cx43）由基因Gja1编码，该基因具有单个编码外显子并且无法剪接。然而，Gja1不仅产生全长Cx43蛋白，而且通过称为内部翻译的过程产生多达六个N-末端截断亚型，这是内部AUG（蛋氨酸）起始位点核糖体翻译启动的结果。GJA1-20k是Cx43最常生成的截断亚型，在Gja1 mRNA的213位置的AUG密码子处引发。由于残基213发生在Cx43的最后一个跨膜结构域的末端，因此GJA1-20k实际上是Cx43的20 kDa C末端尾部，作为独立的蛋白质。先前的研究者在细胞中发现，GJA1-20k的关键作用是促进全长Cx43间隙连接半透明体到质膜的运输。为了 在体内检查这种现象，产生了具有Gja1点突变的突变小鼠，该突变用TTA（亮氨酸，M213L突变）替换残基213处的ATG（蛋氨酸）。M213L的结果是Gja1 mRNA和全长Cx43仍然产生，但Gja1-20k的翻译显着降低。本报告重点介绍如何选择限制性内切酶位点来开发一种氨基酸突变（Gja1^M213L/M213L）小鼠模型。该协议描述了通过CRISPR-Cas9系统进行的转基因小鼠，以及通过结合PCR和限制性内切酶治疗进行快速基因分型。

引言

全长连接蛋白43（Cx43）和N-末端截断亚型GJA1-20k，由相同的GJA1 mRNA编码，但利用不同的起始密码子¹来启动翻译。Cx43翻译发生在第一个AUG起始密码子，而GJA1-20k翻译发生在残基213的AUG开始。先前发现GJA1-20k对全身Cx43运输，肌动蛋白稳定和体外线粒体形态调节^1，2，3具有重要作用。

为了了解GJA1-20k 在体内的作用，生成了GJA1-20k"敲除"小鼠模型，该模型保留了创建全长Cx43的能力。方法是使用CRISPR-Cas9系统将213的单个残基从蛋氨酸（M）替换为亮氨酸（L）（Gja1^{M213L / M213L}）⁴。内部M至L突变大大降低了发生内部翻译的可能性，但保留了全长蛋白⁴的翻译和功能。由于野生型（WT）和突变等位基因具有相同的大小和几乎相同的mRNA产物，因此在小鼠中确认基因型存在相当大的困难。DNA测序可以识别突变，但对于常规使用来说太昂贵和耗时。通常，已经建立了几种更快的基因分型方法，例如实时聚合酶链反应（RT-PCR），微调序列连接，高分辨率熔解分析和四引物扩增难治性突变系统PCR（ARMS-PCR）^{5，6，7，8}。然而，这些替代方法需要多个步骤，独特的资源和/或几个特定的引物集，可以诱导非特异性PCR产物。

该协议通过CRISPR-Cas9引入了详细的基因靶向和编辑方法，以创建单个氨基酸突变，并提出快速基因分型以确认突变。基因型鉴定涉及创造性地使用限制性内切酶，仅使用一组引物来鉴定靶基因。读者参考参考文献⁴ ，以观察由一个残基Gja1^{M213L / M213L} 取代突变引起的心源性猝死的深刻电生理效应，该突变仍然产生全长蛋白质，但未能产生较小的内部翻译截断亚型。该方案将有助于使其他小鼠模型使用点突变来降低目标亚型的内部翻译，同时保留内源性全长蛋白的表达。

研究方案

"所有动物护理和研究方案都得到了Cedars-Sinai医疗中心和犹他大学的机构动物护理和使用委员会的批准。在8-9周龄时从商业来源获得的C57BL / 6J雌性小鼠（参见 材料表）用于实验。

1. 基因靶向的准备

1. 使用CRISPR网络算法^4，9，10 选择编码M213的靶向突变位点周围的引导靶标序列（参见 材料表）。
   注意:在与GJA1编码序列相反的链中，选择了20碱基引导序列（ATTCAGAGCGAGAGACACCA），其MIT评分^为11 /62，其中潜在的裂解位点位于待突变密码子下游的16个碱基之后（ATG）（图1;整个crRNA序列如 表1所示）。
2. 合成与Cas9相互作用的crRNA和tracrRNA作为指导RNA¹²。
   注意:尽管引导RNA的MIT评分为62，但只有一个潜在的脱靶突变，其中四个错配距离PAM超过12个碱基。因此，该指南RNA被认为是安全的。
3. 设计与引导序列互补的供体寡核苷酸，以引入单个氨基酸取代（ATG到TTA;M213L）分别在5'和3'侧具有60和48个碱基同源臂。
   注意:该供体寡核苷酸包括通过引入沉默突变（TCC到TCG;S217S）以避免在CRISPR同源定向修复（HDR）¹³ 之后重新编辑，以引入预期的突变（图1 和 表1）。
4. 使用NaCl（200 mM终浓度）沉淀10μg寡核苷酸，以尽量减少盐残留到原核显微注射缓冲液（10mM的Tris-HCl，pH 7.5; 0.1mM的EDTA和100mM的NaCl，不含精胺和亚精胺¹⁴）。
   注意:不要用70%乙醇洗涤DNA沉淀，因为沉淀可以溶解到溶液中。
5. 混合50ng / μL供体寡核苷酸，60ng / μL crRNA / tracrRNA混合物（1:1摩尔比）（来自步骤1.2）和50ng / μL eSpCas9蛋白（参见 材料表），使CRISPR混合物最终体积为20μL（表2）。如果观察到高毒性（例如，25 ng/μL），则降低供体寡核苷酸的浓度。

2. 诱导超排卵、收获卵子、CRISPR混合物原核显微注射、囊胚筛选

注意:此过程遵循以前发布的通用协议¹⁴。

1. 在8周龄时通过腹膜内入路向5-10只小鼠注射5IU的PMSG（怀孕母马的血清促性腺激素）（见 材料表）在100μL无菌水中，约3:00 p.m（第1天）。
2. 在PMSG注射（第3天）后46-48小时，通过腹膜内入路将5IU的hCG（人绒毛膜促性腺激素）（见 材料表）在100μL无菌水中注射给卵子供体。与雄性种马建立1:1的繁殖。
3. 在M2培养基中用透明质酸酶收获受精卵，在100μL M2培养基中洗涤三次，大约.m 10:00，然后保持在mWM¹⁵ 或KSOM¹⁶ 培养基中（第4天）（见 材料表）。
4. 将CRISPR混合物（步骤1.3）引入通过原核显微注射¹⁴ 在100μL覆盖有石蜡油的塑料培养皿中从小鼠收获的1细胞阶段胚胎中，在倒置显微镜上，在下午早些时候至傍晚使用增强对比度的光学元件（视频1）。
   注意:在后 14 - 16 小时对 1 细胞阶段胚胎进行 CRISPR 混合物的原核显微注射（ p . c . ）。注射的胚胎在5%CO₂ 培养箱中培养数小时，并以18-20小时p.c.手术转移到同一天早上具有交配塞的受体ICR小鼠中。
5. 将20-30个2细胞胚胎转移到每个受体中以产生重组动物。
   注意:遵循一般方案¹⁴ 或在mWM或KSOM培养基中培养这些胚胎4天，以验证效率并检查毒性。当至少三分之一的注射胚胎早期达到完全扩增的囊胚阶段并含有多种重组物时，CRISPR混合物的毒性是可以接受的。同时，超过90%的未操纵胚胎在平行培养中达到相同的囊胚阶段。按照步骤2.6-2.9进行囊肿筛查，这不是必需的，但如果愿意，可以这样做来量化HDR的成功率。
6. 使用带有微量滴管的堵塞细移液器尖端，用2μL培养基单独拾取早期至完全扩增的囊胚到单个PCR管中（第8天; 视频 2）。
7. 在8μL消化混合物中裂解囊胚（与步骤3.2相同;参见 材料表），并在75°C下处理10分钟，95°C处理5分钟，然后冷却至4°C储存。使用2μL裂解物作为总15μL PCR混合物中的PCR模板（步骤3）。
8. 在用NlaIII进行限制性酶切后，通过琼脂糖凝胶电泳¹⁷ 检查PCR样品的HDR的功效（步骤3-5）。
9. 通过在创始人和随后的后代中对668 bp扩增子¹⁷ 进行测序来确认靶向重组的状态，以确认突变的完整性。

3. DNA提取

注意:由于出生后2-4周左右GJA1-20k敲除小鼠猝死，因此在出生后第10天使用小鼠进行本实验⁴。更通用的协议也可以在先前发布的报告¹⁸之后应用。

1. 用干净的剪刀切下1-3毫米的脚趾或尾尖，并将其转移到0.2 mL 8条PCR管中。为避免脚趾或尾巴样品中的污染，请使用预先清洁的剪刀或每只小鼠一片刀片，或在每次样品之前使用70%乙醇或10%漂白剂清洁。如果取样后尾部出血，请用纱布施加短暂的压力以阻止出血。将尾部样品储存在-20°C直至提取长达约一周。
2. 在100μL /管中加入组织裂解溶液（参见 材料表）并充分混合，然后用台式小型离心机（室温下2，200× g ，持续10秒）旋转。确保尾部样品浸没在溶液中。
3. 将管子设置到由以下程序设置的热循环仪上;75°C持续10分钟（组织裂解），95°C持续5分钟（灭活）和4°C（保温）。如果不能立即进行PCR，则将组织裂解物在4°C下储存长达一周。

4. 通过PCR进行DNA扩增

1. 将含有5μL无核酸酶H₂O，0.75μL10μM正向和反向引物以及7.5μLPCR预混液（参见 材料表）的PCR溶液制备到新的PCR管中（引物序列见 表1 ）。如果有多个样品，则将内容物缩放至每管等分14μL。
2. 向步骤3.1中制备的PCR溶液中加入1μL组织裂解物。注意不要碰到尾巴。
3. 充分混合并用台式小型离心机（室温下2，200× g ，持续10秒）旋转。
4. 将管子设置到由以下程序设置的热循环仪上。将PCR产物在4°C下储存1-2个月或在-20°C下储存〜1年。
   注意:95°C 3分钟（步骤1，初始变性），95°C15秒（步骤2，变性），60°C15秒（步骤2，退火），72°C45秒（步骤2，延伸），重复步骤235个周期，72°C10分钟（步骤3，最终延伸）和4°C（步骤4，保持）。

5. 与限制性内切酶一起孵育

1. 制备含有7μL无核酸酶H₂O，2μL10x CutSmart缓冲液和1μLNlaIII限制性内切酶的酶溶液（参见 材料表）。如果有多个样品，则将每种含量相乘以制成混合物，并等分试样每管10μL。
2. 每管向酶溶液中加入步骤3中获得的10μLPCR产物。
3. 充分混合并用台式小型离心机（室温下2，200× g ，持续10秒）旋转。
4. 将管子设置到由以下程序设置的热循环仪或加热块上。将产品在4°C孵育后在-2°C下孵育1-2个月或〜1年。
   注意:37°C保存16小时（至少2小时;孵育时间短可能导致裂解不足）和4°C保持。

6. DNA条带检测

1. 制备含有DNA凝胶染色剂的1.5%琼脂糖凝胶进行电泳。
   1. 在50mL 1x TAE缓冲液中加入0.75g琼脂糖，然后在微波炉中混合并加热，直到琼脂糖完全溶解。冷却后，加入5μLDNA染色剂并轻轻混合。
   2. 倒入凝胶模具（每个模具25 mL）中，让凝胶固化。为了获得更好的分辨率和分离，根据需要将琼脂糖浓度提高到2.5%-4%。
2. 将10μL消化的PCR产物加载到孔中。如有必要，混合6x上样缓冲液。
3. 用100 V电泳凝胶35分钟。
   注意:这些参数可能需要优化。
4. 紫外光（302 nm 波长）下的图像。

结果

CRISPR/ Cas9基因编辑系统在小鼠10号染色体上分别产生ATG至TTA突变和56，264，279至56，264，281和56，264，291至56，264，293的ATG至TCG突变和TCG的沉默TCC突变，或在Gja1 mRNA上分别产生869至871和881至883的TCC至TCG突变。这些突变导致GJA1蛋白上的蛋氨酸213到亮氨酸（M213L）突变，并且TTC到TTG突变破坏了附近的PAM序列以避免不需要的基因版本（图1）。突变的细节在上一份报告⁴

讨论

基因修饰小鼠模型是了解基因功能的常用方法。然而，由于GJA1-20k内部翻译的同种型是从与全长Cx43相同的 Gja1 mRNA翻译而来的，因此设计了一种创造性的策略来保留全长Cx43表达，同时抑制GJA1-20k表达。该方法基于GJA1-20k内部起始密码子的突变。通过单点突变，M213在 Gja1 mRNA上切换为L，成功抑制GJA1-20k表达，但保留了全长Cx43表达⁴。

然而，单个内部?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL 8-Strip PCR tube	Thomas Scientific	1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575-038	For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027	For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer	Invitrogen	24710-030
96-well Thermal cycler	Applied Biosystems	Model # 9902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	mouse strain
Chemidoc MP imaging system	Bio-rad		To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein	MilliporeSigma	ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S	Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)	MilliporeSigma	23-073-425G
Hyaluronidase	MilliporeSigma	H3884-100MG
Image Lab software	Bio-rad		To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC	Zeiss	Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits	Roche Diagnostics	KK7352	For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM	LifeGlobal	ZEKS-050	embryo culture medium
Lab coart
M2 medium	MilliporeSigma	MR015D
NlaIII	New England Biolabs	R0125S	To digest PCR product
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937	To dilute reagents
Paraffin oil	Nacalai USA	2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip	FisherScientific	02-707-171	To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)	ProSpec-Tany	HOR-272
Sodium Chloride	Invitrogen	AM9760G	For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	To detect bands in gel
tracrRNA	Dharmacon	U-002000-120	Guid RNA