Remoção de um local de início de tradução interna do mRNA enquanto retém a expressão da proteína de comprimento completo

Resumo

O presente protocolo descreve uma única mutação M213L em Gja1 que retém a geração Connexin43 em comprimento completo, mas impede a tradução do isoforme traduzido internamente GJA1-20k.

Resumo

O sistema de edição de genes CRISPR-Cas9, baseado em mecanismos de reparação de genomas, permite a geração de modelos de camundongos modificados por genes de forma mais rápida e fácil em relação à recombinação homologous tradicional. O sistema CRISPR-Cas9 é particularmente atraente quando uma mutação de um ponto é desejada. A proteína de junção de lacunas, Connexin 43 (Cx43), é codificada pelo gene Gja1, que tem um único exon de codificação e não pode ser emendado. No entanto, Gja1 produz não apenas proteína Cx43 de comprimento completo, mas até seis isoformas truncados N-terminus por um processo conhecido como tradução interna, o resultado da iniciação da tradução ribossômica em locais de partida internos de AUG (Methionine). GJA1-20k é o isóforme truncado mais comumente gerado do Cx43 iniciado no codon AUG na posição 213 de Gja1 mRNA. Como o resíduo 213 ocorre no final do último domínio transmembrano de Cx43, GJA1-20k é efetivamente a cauda C-terminus de 20 kDa C de Cx43 como uma proteína independente. Investigadores anteriores identificaram, em células, que um papel crítico do GJA1-20k é facilitar o tráfico de hemicanais de junção de lacunas Cx43 de comprimento completo à membrana plasmática. Para examinar esse fenômeno in vivo, foi gerado um rato mutante com mutação de ponto Gja1 que substitui o ATG (Methionine) no resíduo 213 por TTA (leucemia, mutação M213L). O resultado do M213L é que Gja1 mRNA e Cx43 de comprimento completo ainda são gerados, mas a tradução de Gja1-20k é significativamente reduzida. Este relatório se concentra na escolha do local da enzima de restrição para desenvolver um modelo de mouse de um aminoácido mutado (Gja1^M213L/M213L). Este protocolo descreve camundongos geneticamente modificados pelo sistema CRISPR-Cas9 e genotipagem rápida combinando tratamentos de PCR e enzimas de restrição.

Introdução

O Connexin 43 (Cx43) e o isoforme truncado N-terminus, GJA1-20k, codificados pelo mesmo GJA1 mRNA, mas utilizam códons de início diferentes¹ para iniciar a tradução. A tradução Cx43 ocorre no primeiro códon de início de AUG, enquanto a tradução GJA1-20k inicia-se no AUG no resíduo 213. Foi previamente constatado que o GJA1-20k tem funções essenciais para o tráfico de Cx43 em comprimento total, estabilização de actin e regulação da morfologia mitocondrial in vitro ^1,2,3.

Para entender o papel do GJA1-20k in vivo, foi gerado um modelo de mouse "knock-out" GJA1-20k que manteve a capacidade de criar Cx43 de comprimento completo. A abordagem foi utilizar o sistema CRISPR-Cas9 para substituir o resíduo único em 213 de uma methionina (M) a uma leucina (L) (Gja1^M213L/M213L)⁴. Uma mutação interna de M a L diminui drasticamente a probabilidade de a tradução interna ocorrer, mas mantém a tradução e a função da proteína de comprimento total⁴. Como o tipo selvagem (WT) e o alelo mutado têm tamanhos idênticos e produtos mRNA quase idênticos, há uma dificuldade considerável em confirmar genótipo nos camundongos. O sequenciamento de DNA pode identificar a mutação, mas é muito caro e demorado para uso rotineiro. Em geral, vários métodos de genotipagem mais rápido foram estabelecidos, como reação de cadeia de polimerase em tempo real (RT-PCR), minisequenciamento-ligation, análise de fusão de alta resolução e sistema de mutação refratário tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. No entanto, esses métodos alternativos requerem múltiplas etapas, recursos exclusivos e/ou vários conjuntos de primer específicos que podem induzir produtos PCR não específicos.

Este protocolo introduz uma abordagem detalhada de segmentação e edição de genes pelo CRISPR-Cas9 para criar uma única mutação de aminoácidos, e genotipagem rápida é apresentada para confirmar a mutação. A identificação do genótipo envolve o uso criativo de enzimas de restrição utilizando apenas um único conjunto de primers para identificar o gene alvo. Os leitores são encaminhados à Referência⁴ para observar o profundo efeito eletrofisiológico da morte cardíaca súbita causada por uma mutação de substituição Gja1^M213L/M213L que ainda gera proteína de comprimento total e não consegue gerar uma isoforma de truncação ingenuamente traduzida internamente menor. Este protocolo ajudará a fazer com que outros modelos de camundongos usem uma mutação pontual para diminuir a tradução interna de uma isoforme de interesse, mantendo a expressão da proteína endógena de comprimento total.

Protocolo

Todos os protocolos de cuidados e estudos para animais foram aprovados pelos Comitês Institucionais de Cuidados e Uso de Animais do Cedars-Sinai Medical Center e da Universidade de Utah. Camundongos fêmeas C57BL/6J obtidos de fontes comerciais com 8-9 semanas de idade (ver Tabela de Materiais) foram utilizados para os experimentos.

1. Preparação para direcionamento genético

1. Selecione a sequência de destino guia em torno do site de mutação alvo codificando M213 usando o algoritmo web CRISPOR ^4,9,10 (ver Tabela de Materiais).
   NOTA: Uma sequência de guia de 20 bases (ATTCAGAGCGAGACACCA), no fio oposto da sequência de codificação GJA1, com uma pontuação do MIT¹¹ de 62 foi selecionada na qual o potencial local de decote está localizado após 16 bases a jusante do códon a ser mutado (ATG) (Figura 1; toda a sequência de crRNA é mostrada na Tabela 1).
2. Sintetizar o crRNA e tracrRNA que interagem com o Cas9 como guia RNA¹².
   NOTA: Embora a pontuação do MIT do RNA guia seja de 62, há apenas uma mutação potencial fora do alvo com quatro incompatibilidades a mais de 12 bases do PAM. Portanto, este guia RNA é considerado seguro.
3. Projetar um oligo doador complementar à sequência guia para introduzir uma única substituição de aminoácido (ATG para TTA; M213L) com 60 e 48 bases de armas de ílogo nos lados de 5'e 3', respectivamente.
   NOTA: Este oligo doador inclui uma mutação pontual para interrupção do PAM (AGG to ACG) introduzindo uma mutação silenciosa (TCC to TCG; S217S) para evitar a reeditação após o reparo direcionado à bralogia crispr (HDR)¹³ para a introdução das mutações pretendidas (Figura 1 e Tabela 1).
4. Use NaCl (concentração final de 200 mM) para precipitar 10 μg de oligos para minimizar o transporte de sal em tampão de microinjeção pronuclear (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM de EDTA, e 100 mM de NaCl sem espermatozoide e espermidina¹⁴).
   NOTA: Não lave a pelota de DNA com 70% de etanol, pois a pelota pode ser dissolvida na solução.
5. Misture 50 ng/μL de oligo doador, 60 ng/μL de mistura de crRNA/tracrRNA (razão molar 1:1) (a partir da etapa 1,2) e 50 ng/μL de proteína eSpCas9 (ver Tabela de Materiais) para fazer mistura CRISPR no volume final 20 μL (Tabela 2). Diminua a concentração do oligo doador se for observada alta toxicidade (por exemplo, 25 ng/μL).

2. Indução de superovulação, colheita de ovos, microinjeção pronuclear de mistura CRISPR e triagem de blastocisto

NOTA: Este procedimento segue um protocolo geral publicado anteriormente¹⁴.

1. Injete 5 UI de PMSG (gonadotropina soro da égua grávida) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril a 5-10 camundongos com 8 semanas de idade por uma abordagem intraperitoneal por volta das 3:00 p.m. (dia 1).
2. Injete 5 UI de hCG (gonadotropina coriônica humana) (ver Tabela de Materiais) em 100 μL de água estéril aos doadores de óvulos por uma abordagem intraperitoneal 46-48 h após a injeção de PMSG (dia 3). Configurar 1:1 reprodução com machos garanhão.
3. Colher ovos fertilizados em m2 médio com hialuronidase, lavar três vezes em 100 μL de m2 médio por volta das 10:00 a.m., em seguida, manter em mWM¹⁵ ou KSOM¹⁶ médio (dia 4) (ver Tabela de Materiais).
4. Introduza a mistura CRISPR (passo 1.3) em embriões de estágio 1 colhidos dos camundongos pela microinjeção pronuclear¹⁴ em 100 μL de M2 coberto com óleo de parafina em um prato plástico em um microscópio invertido com uma óptica que melhora o contraste no início da tarde (Vídeo 1).
   NOTA: A microinjeção pronuclear da mistura CRISPR foi realizada em embriões de estágio de 1 células em 14-16 h póscoitum (p.c.). Os embriões injetados foram cultivados em uma incubadora de CO₂ de 5% por algumas horas e transferidos cirurgicamente a 18-20 h p.c. para camundongos receptores ICR que tinham um plugue de copulação na mesma manhã.
5. Transfira 20-30 embriões de 2 células para cada receptor para produzir animais recombinantes.
   NOTA: Siga o protocolo geral¹⁴ ou cultue os embriões no mWM ou no meio KSOM por 4 dias para validar a eficiência e examinar a toxicidade. A toxicidade da mistura CRISPR é aceitável quando pelo menos um terço dos embriões injetados chegam cedo ao estágio blastocisto totalmente expandido com múltiplos recombinantes entre eles. Ao mesmo tempo, mais de 90% dos embriões não domesticados atingem o mesmo estágio blastocisto em uma cultura paralela. Siga o passo 2.6-2.9 para a triagem do blastcyst que não é essencial, mas pode ser feito se preferir quantificar a taxa de sucesso do HDR.
6. Captar individualmente blastocistos totalmente expandidos com 2 μL de meio de cultura usando uma ponta de pipeta fina plugada com uma micropipetter em tubos PCR únicos (dia 8; Vídeo 2).
7. Blastocistos de lyse em 8 μL de mistura de digestão (mesmo que passo 3.2; ver Tabela de Materiais) e processo a 75 °C por 10 min, 95 °C por 5 min, depois esfrie até 4 °C para armazenamento. Use 2 μL do lysate como modelo para PCR em uma mistura total de 15 μL PCR (passo 3).
8. Examine a eficácia do HDR por eletroforese de gel agarose¹⁷ das amostras pcr após a digestão de restrição com NlaIII (passo 3-5).
9. Confirme o estado da recombinação direcionada sequenciando o amplicon¹⁷ de 668 bp nos fundadores e prole subsequente para confirmar a integridade da mutação.

3. Extração de DNA

NOTA: Camundongos no pós-natal dia 10 foram usados para este experimento devido à morte súbita do rato nocaute GJA1-20k cerca de 2-4 semanas após o nascimento⁴. Um protocolo mais geral também pode ser aplicado após o relatório publicado anteriormente¹⁸.

1. Corte 1-3 mm do dedo do dedo ou da ponta da cauda com uma tesoura limpa e transfira-a para um tubo PCR de 0,2 mL de 8 Tiras. Para evitar contaminação entre as amostras do dedo do pé ou da cauda, use uma tesoura pré-limpa ou uma lâmina por mouse ou limpe antes de cada amostra usando 70% de etanol ou 10% de alvejante. Se a cauda sangrar após a amostragem, aplique uma breve pressão com gaze para parar o sangramento. Armazene as amostras da cauda a -20 °C até a extração por até cerca de uma semana.
2. Adicione a solução de lise tecidual (ver Tabela de Materiais) em um tubo de 100 μL/e misture bem, seguido de spin-down com uma minicentrífuda de mesa (2.200 x g para 10 s à temperatura ambiente). Certifique-se de que as amostras da cauda estão submersas na solução.
3. Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa a seguir; 75 °C para 10 min (lise tecidual), 95 °C para 5 min (inativação) e 4 °C (segurando). Armazene o tecido a 4 °C por até uma semana se os PCRs não puderem ser realizados imediatamente.

4. Amplificação de DNA por PCR

1. Prepare uma solução PCR contendo 5 μL de H₂O sem nuclease, 0,75 μL de 10 μM para frente e primers invertidos e 7,5 μL de mix mestre PCR (ver Tabela de Materiais) por amostra em novo tubo PCR (ver Tabela 1 para sequências de primer). Se houver várias amostras, dimensione o conteúdo para alíquota de 14 μL por tubo.
2. Adicione 1 μL do tecido à solução PCR preparada na etapa 3.1. Tenha cuidado para não tocar na cauda.
3. Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).
4. Coloque os tubos em um cicloviário térmico definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene os produtos PCR a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C.
   NOTA: 95 °C por 3 min (etapa 1, Denaturação inicial), 95 °C para 15 s (etapa 2, Denaturação), 60 °C para 15 s (etapa 2, Annealing), 72 °C para 45 s (etapa 2, Extensão), repetição do passo 2 para 35 ciclos, 72 °C para 10 min (etapa 3, Extensão Final) e 4 °C (etapa 4, Holding).

5. Incubação com enzima de restrição

1. Prepare a solução enzimápica contendo 7 μL de H₂O sem nuclease, 2 μL de tampão CutSmart de 10x e 1 μL de enzima de restrição NlaIII (ver Tabela de Materiais). Se houver várias amostras, multiplique cada conteúdo para fazer a mistura e alíquota de 10 μL por tubo.
2. Adicione 10 μL de produto PCR obtido na etapa 3 à solução enzimápica por tubo.
3. Misture bem e gire para baixo com uma mini centrífuga de mesa (2.200 x g para 10 s em temperatura ambiente).
4. Coloque os tubos em um cicloviário térmico ou bloco de calor definido pelo programa abaixo mencionado. Armazene o produto após a incubação a 4 °C por 1-2 meses ou ~1 ano a -20 °C.
   NOTA: 37 °C para 16 h (pelo menos 2 h; tempo curto de incubação pode resultar em decote insuficiente) e 4 °C para realização.

6. Detecção de banda de DNA

1. Prepare um gel de 1,5% de agarose contendo mancha de gel de DNA para eletroforese.
   1. Adicione 0,75 g de agarose em 50 mL de tampão TAE 1x seguido de mistura e calor no micro-ondas até que a agarose se dissolva completamente. Depois de esfriar, adicione 5 μL de mancha de DNA e misture suavemente.
   2. Despeje no molde de gel (25 mL por molde) e deixe o gel solidificar. Para obter melhor resolução e separação, aumente a concentração de ágarose para 2,5%-4% conforme necessário.
2. Carregue 10 μL do produto PCR digerido até o poço. Misture 6x tampão de carregamento, se necessário.
3. Execute o gel com 100 V por 35 min.
   NOTA: Esses parâmetros podem precisar de otimização.
4. Imagem sob luz UV (comprimento de onda de 302 nm).

Resultados

O sistema de edição de genes CRISPR/Cas9 produz uma mutação ATG para TTA e uma mutação silenciosa de TCC para TCG entre 56.264.279 a 56.264.281 e de 56.264.291 a 56.264.293 no cromossomo do rato 10, ou em 869 a 871 e 881 a 883 em Gja1 mRNA, respectivamente. Essa mutação resulta em uma mutação de Methionina 213 a Leucina (M213L) na proteína GJA1 e a mutação TTC para TTG interrompe uma sequência PAM próxima para evitar edição genética indesejada (Figura 1). Os detalhes da mut...

Discussão

Um modelo de rato modificado por genes é uma abordagem comum para entender a função genética. No entanto, uma vez que o isoform traduzido internamente GJA1-20k é traduzido do mesmo Gja1 mRNA como Cx43 de comprimento completo, uma estratégia criativa foi concebida para manter a expressão Cx43 de comprimento completo, mas suprimir a expressão GJA1-20k. A abordagem é baseada em uma mutação do códon inicial interno de GJA1-20k. Com uma mutação de um único ponto, M213 foi trocado para L em Gja1

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL 8-Strip PCR tube	Thomas Scientific	1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575-038	For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027	For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer	Invitrogen	24710-030
96-well Thermal cycler	Applied Biosystems	Model # 9902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	mouse strain
Chemidoc MP imaging system	Bio-rad		To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein	MilliporeSigma	ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S	Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)	MilliporeSigma	23-073-425G
Hyaluronidase	MilliporeSigma	H3884-100MG
Image Lab software	Bio-rad		To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC	Zeiss	Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits	Roche Diagnostics	KK7352	For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM	LifeGlobal	ZEKS-050	embryo culture medium
Lab coart
M2 medium	MilliporeSigma	MR015D
NlaIII	New England Biolabs	R0125S	To digest PCR product
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937	To dilute reagents
Paraffin oil	Nacalai USA	2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip	FisherScientific	02-707-171	To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)	ProSpec-Tany	HOR-272
Sodium Chloride	Invitrogen	AM9760G	For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	To detect bands in gel
tracrRNA	Dharmacon	U-002000-120	Guid RNA