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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Das vorliegende Protokoll beschreibt eine einzelne M213L-Mutation in Gja1, die die Connexin43-Generation in voller Länge beibehält, aber die Translation der kleineren GJA1-20k-intern übersetzten Isoform verhindert.

Zusammenfassung

Das Gen-Editing-System CRISPR-Cas9, das auf Genomreparaturmechanismen basiert, ermöglicht die schnellere und einfachere Generierung genmodifizierter Mausmodelle im Vergleich zur traditionellen homologen Rekombination. Das CRISPR-Cas9-System ist besonders attraktiv, wenn eine Einzelpunktmutation gewünscht wird. Das Gap-Junction-Protein, Connexin 43 (Cx43), wird vom Gen Gja1 kodiert, das ein einzelnes kodierendes Exon hat und nicht gespleißt werden kann. Gja1 produziert jedoch nicht nur Cx43-Protein in voller Länge, sondern bis zu sechs N-terminus-abgeschnittene Isoformen durch einen Prozess, der als interne Translation bekannt ist, das Ergebnis der ribosomalen Translationsinitiierung an internen AUG-Startstellen (Methionin). GJA1-20k ist die am häufigsten erzeugte abgeschnittene Isoform von Cx43, die am AUG-Codon an Position 213 der Gja1-mRNA initiiert wurde. Da der Rest 213 am Ende der letzten Transmembrandomäne von Cx43 auftritt, ist GJA1-20k effektiv der 20 kDa C-Terminus-Schwanz von Cx43 als unabhängiges Protein. Frühere Forscher identifizierten in Zellen, dass eine entscheidende Rolle von GJA1-20k darin besteht, den Handel von Cx43-Gap-Junction-Hemikanälen in voller Länge zur Plasmamembran zu erleichtern. Um dieses Phänomen in vivo zu untersuchen, wurde eine mutierte Maus mit einer Gja1-Punktmutation erzeugt, die das ATG (Methionin) am Rest 213 durch TTA (Leucin, M213L-Mutation) ersetzt. Das Ergebnis von M213L ist, dass Gja1 mRNA und Cx43 in voller Länge immer noch erzeugt werden, die Translation von Gja1-20k jedoch signifikant reduziert ist. Dieser Bericht konzentriert sich auf die Auswahl der Restriktionsenzymstelle, um ein mit einer Aminosäure mutiertes (Gja1 M213L/ M213L) Mausmodell zu entwickeln. Dieses Protokoll beschreibt genetisch veränderte Mäuse durch das CRISPR-Cas9-System und die schnelle Genotypisierung durch Kombination von PCR- und Restriktionsenzymbehandlungen.

Einleitung

Das Connexin 43 (Cx43) in voller Länge und die abgeschnittene Isoform N-Terminus, GJA1-20k, kodiert durch dieselbe GJA1-mRNA, verwenden jedoch unterschiedliche Start-Codons1, um die Translation zu initiieren. Die Cx43-Translation erfolgt beim ersten AUG-Startcodon, während die GJA1-20k-Translation am AUG bei Rest 213 beginnt. Es wurde zuvor festgestellt, dass GJA1-20k eine wesentliche Rolle für den Cx43-Transport in voller Länge, die Stabilisierung von Aktin und die Regulation der mitochondrialen Morphologie in vitro 1,2,3 spielt.

Um die Rolle von GJA1-20k in vivo zu verstehen, wurde ein GJA1-20k "Knock-out" -Mausmodell generiert, das die Fähigkeit beibehielt, Cx43 in voller Länge zu erstellen. Der Ansatz bestand darin, das CRISPR-Cas9-System zu verwenden, um den einzelnen Rückstand bei 213 von einem Methionin (M) zu einem Leucin (L) (Gja1M213L/M213L)4 zu ersetzen. Eine interne M-zu-L-Mutation verringert die Wahrscheinlichkeit einer internen Translation dramatisch, behält jedoch die Translation und Funktion des Proteins 4 in voller Längebei. Da der Wildtyp (WT) und das mutierte Allel identische Größen und nahezu identische mRNA-Produkte aufweisen, gibt es erhebliche Schwierigkeiten, den Genotyp in den Mäusen zu bestätigen. Die DNA-Sequenzierung kann die Mutation identifizieren, ist aber für den routinemäßigen Gebrauch zu teuer und zeitaufwendig. Im Allgemeinen haben sich mehrere schnellere Genotypisierungsmethoden etabliert, wie z. B. die Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (RT-PCR), die Minisequenzierungs-Ligation, die hochauflösende Schmelzanalyse und das refraktäre Mutationssystem PCR (ARMS-PCR) 5,6,7,8. Diese alternativen Methoden erfordern jedoch mehrere Schritte, einzigartige Ressourcen und / oder mehrere spezifische Primer-Sets, die unspezifische PCR-Produkte induzieren können.

Dieses Protokoll führt einen detaillierten Gen-Targeting- und Editing-Ansatz von CRISPR-Cas9 ein, um eine einzelne Aminosäuremutation zu erzeugen, und eine schnelle Genotypisierung wird vorgestellt, um die Mutation zu bestätigen. Die Identifizierung des Genotyps beinhaltet die kreative Verwendung von Restriktionsenzymen, bei denen nur ein einziger Satz von Primern verwendet wird, um das Zielgen zu identifizieren. Die Leser werden auf Referenz 4 verwiesen, um die tiefgreifende elektrophysiologische Wirkung des plötzlichen Herztodes zu beobachten, der durch eine Gja1M213L/M213L-Substitutionsmutation mit einem Rückstand verursacht wird, die immer noch ein Protein in voller Länge erzeugt, aber keine kleinere intern übersetzte Trunkierungsisoform erzeugt. Dieses Protokoll wird dazu beitragen, dass andere Mäusemodelle eine Punktmutation verwenden, um die interne Translation einer Isoform von Interesse zu verringern und gleichzeitig die Expression des endogenen Protein in voller Länge beizubehalten.

Protokoll

"Alle Tierpflege- und Studienprotokolle wurden von den Institutional Animal Care and Use Committees des Cedars-Sinai Medical Center und der University of Utah genehmigt. Für die Experimente wurden weibliche C57BL/6J-Mäuse verwendet, die im Alter von 8-9 Wochen aus kommerziellen Quellen gewonnen wurden (siehe Materialtabelle).

1. Vorbereitung auf Gen-Targeting

  1. Wählen Sie die Leitzielsequenz um die Zielmutationsstelle herum aus, die M213 kodiert, indem Sie den CRISPOR-Webalgorithmus 4,9,10 verwenden (siehe Materialverzeichnis).
    HINWEIS: Es wurde eine 20-Basen-Führungssequenz (ATTCAGAGCGAGAGACACCA) im gegenüberliegenden Strang der GJA1-Kodierungssequenz mit einem MIT-Score 11 von 62 ausgewählt, bei der sich die potenzielle Spaltungsstelle nach16 Basen stromabwärts des zu mutierenden Codons (ATG) befindet (Abbildung 1; die gesamte crRNA-Sequenz ist in Tabelle 1 dargestellt).
  2. Synthetisieren Sie die crRNA und tracrRNA, die mit Cas9 als Leit-RNA12 interagieren.
    HINWEIS: Obwohl der MIT-Score der Leit-RNA 62 beträgt, gibt es nur eine potenzielle Off-Target-Mutation mit vier Mismatches, die mehr als 12 Basen vom PAM entfernt sind. Daher gilt diese Leitfaden-RNA als sicher.
  3. Entwerfen Sie ein Spenderoligo komplementär zur Leitsequenz, um eine einzelne Aminosäuresubstitution (ATG zu TTA; M213L) mit 60 bzw. 48 Basen-Homologiearmen auf der 5'- bzw. 3'-Seite.
    HINWEIS: Dieser Spenderoligo beinhaltet eine Punktmutation zur Störung des PAM (AGG zu ACG) durch Einführung einer stillen Mutation (TCC zu TCG; S217S), um eine erneute Bearbeitung nach CRISPR-homologiegerichteter Reparatur (HDR)13 für die Einführung der beabsichtigten Mutationen zu vermeiden (Abbildung 1 und Tabelle 1).
  4. Verwenden Sie NaCl (200 mM Endkonzentration), um 10 μg Oligos auszufällen, um den Salzübertrag in den pronukleären Mikroinjektionspuffer zu minimieren (10 mM Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM EDTA und 100 mM NaCl ohne Spermin undSpermidin 14).
    HINWEIS: Waschen Sie das DNA-Pellet nicht mit 70% Ethanol, da das Pellet in der Lösung gelöst werden kann.
  5. Mischen Sie 50 ng/μL Donor-Oligo, 60 ng/μL crRNA/tracrRNA-Mix (1:1-Molverhältnis) (aus Schritt 1.2) und 50 ng/μL eSpCas9-Protein (siehe Materialtabelle), um eine CRISPR-Mischung im Endvolumen 20 μL herzustellen (Tabelle 2). Verringern Sie die Konzentration des Spenderoligos, wenn eine hohe Toxizität beobachtet wird (z. B. 25 ng/μL).

2. Induktion des Superovulations, Ernte von Eiern, pronukleare Mikroinjektion von CRISPR-Mischung und Blastozysten-Screening

HINWEIS: Dieses Verfahren folgt einem zuvor veröffentlichten allgemeinen Protokoll14.

  1. Injizieren Sie 5 IE PMSG (Serumgonadotropin der trächtigen Stute) (siehe Materialtabelle) in 100 μL steriles Wasser an 5-10 Mäuse im Alter von 8 Wochen durch einen intraperitonealen Ansatz bei etwa 3:00 p.m. (Tag 1).
  2. Injizieren Sie 5 IE hCG (humanes Choriongonadotropin) (siehe Materialtabelle) in 100 μL steriles Wasser an die Eizellspenderinnen durch einen intraperitonealen Ansatz 46-48 h nach PMSG-Injektion (Tag 3). Richten Sie eine 1:1-Zucht mit Deckrüden ein.
  3. Befruchtete Eier in M2-Medium mit Hyaluronidase ernten, dreimal in 100 μL M2-Medium gegen 10:00 Uhr .m waschen und dann in mWM15 oder KSOM16 Medium (Tag 4) aufbewahren (siehe Materialtabelle).
  4. Die CRISPR-Mischung (Schritt 1.3) wird in Embryonen im 1-Zell-Stadium eingeführt, die von den Mäusen durch pronukleäre Mikroinjektion14 in 100 μL M2, bedeckt mit Paraffinöl, in einer Plastikschale auf einem inversen Mikroskop mit kontrastverstärkender Optik am frühen bis späten Nachmittag entnommen wurden (Video 1).
    HINWEIS: Die pronukleäre Mikroinjektion der CRISPR-Mischung wurde an Embryonen im 1-Zellstadium bei 14-16 h postcoitum durchgeführt (S.c.). Die injizierten Embryonen wurden in einem 5% CO2-Inkubator für einige Stunden kultiviert und bei 18-20 h p.c. chirurgisch in Empfänger-ICR-Mäuse übertragen, die am selben Morgen einen Kopulationstopfen hatten.
  5. Übertragen Sie 20-30 2-zellige Embryonen in jeden Empfänger, um rekombinante Tiere zu produzieren.
    HINWEIS: Befolgen Sie das allgemeine Protokoll14 oder kultivieren Sie diese Embryonen 4 Tage lang in mWM- oder KSOM-Medium, um die Effizienz zu validieren und die Toxizität zu untersuchen. Die Toxizität der CRISPR-Mischung ist akzeptabel, wenn mindestens ein Drittel der injizierten Embryonen früh in das vollständig expandierte Blastozystenstadium mit mehreren Rekombinanten unter ihnen gelangt. Gleichzeitig erreichen mehr als 90% der nicht manipulierten Embryonen in einer Parallelkultur das gleiche Blastozystenstadium. Befolgen Sie die Schritte 2.6-2.9 für das Blastzysten-Screening, das nicht unbedingt erforderlich ist, aber durchgeführt werden kann, wenn es vorgezogen wird, um die Erfolgsrate von HDR zu quantifizieren.
  6. Individuelle Aufnahme von frühen bis vollständig expandierten Blastozysten mit 2 μL Kulturmedium unter Verwendung einer verstopften feinen Pipettenspitze mit einem Mikropipetter in einzelne PCR-Röhrchen (Tag 8; Video 2).
  7. Lyseblastozysten in 8 μL Aufschlussmischung (wie Schritt 3.2; siehe Materialtabelle) und bei 75 °C für 10 min, 95 °C für 5 min verarbeiten, dann zur Lagerung auf 4 °C abkühlen. Verwenden Sie 2 μL des Lysats als Vorlage für die PCR in einer insgesamt 15 μL PCR-Mischung (Schritt 3).
  8. Untersuchen Sie die Wirksamkeit der HDR durch Agarosegelelektrophorese17 der PCR-Proben nach Restriktionsaufschluss mit NlaIII (Schritt 3-5).
  9. Bestätigen Sie den Status der gezielten Rekombination, indem Sie das 668 bp Amplicon17 bei den Gründern und nachfolgenden Nachkommen sequenzieren, um die Integrität der Mutation zu bestätigen.

3. DNA-Extraktion

HINWEIS: Mäuse am postnatalen Tag 10 wurden für dieses Experiment aufgrund des plötzlichen Todes der GJA1-20k Knock-out-Maus etwa 2-4 Wochen nach der Geburt4 verwendet. Ein allgemeineres Protokoll kann auch nach dem zuvor veröffentlichten Bericht18 angewendet werden.

  1. Schneiden Sie 1-3 mm der Zehen- oder Schwanzspitze mit einer sauberen Schere ab und geben Sie sie in einen 0,2 ml 8-Streifen-PCR-Schlauch. Um eine Kontamination zwischen den Zehen- oder Schwanzproben zu vermeiden, verwenden Sie eine vorgereinigte Schere oder eine Klinge pro Maus oder reinigen Sie vor jeder Probe mit 70% Ethanol oder 10% Bleichmittel. Wenn der Schwanz nach der Probenahme blutet, üben Sie kurzen Druck mit Gaze aus, um die Blutung zu stoppen. Lagern Sie die Schwanzproben bei -20 °C bis zur Extraktion für bis zu etwa eine Woche.
  2. Fügen Sie eine Gewebelyselösung (siehe Materialtabelle) in eine 100 μL/Tube und mischen Sie gut, gefolgt von einem Spin-Down mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.200 x g für 10 s bei Raumtemperatur). Stellen Sie sicher, dass die Schwanzproben in die Lösung eingetaucht sind.
  3. Stellen Sie die Rohre auf einen Thermocycler ein, der nach dem folgenden Programm eingestellt ist; 75 °C für 10 min (Gewebelyse), 95 °C für 5 min (Inaktivierung) und 4 °C (Halten). Lagern Sie das Gewebelysat bei 4 °C bis zu einer Woche, wenn PCRs nicht sofort durchgeführt werden können.

4. DNA-Amplifikation durch PCR

  1. Es wird eine PCR-Lösung mit 5 μL nukleasefreiemH2O, 0,75 μL 10 μM Vorwärts- und Rückwärtsprimern und 7,5 μL PCR-Mastermix (siehe Materialtabelle) pro Probe in ein neues PCR-Röhrchen (siehe Tabelle 1 für Primersequenzen) hergestellt. Wenn es mehrere Proben gibt, skalieren Sie den Inhalt auf aliquot 14 μL pro Röhrchen.
  2. 1 μL des Gewebelysats in die in Schritt 3.1 hergestellte PCR-Lösung geben. Achten Sie darauf, den Schwanz nicht zu berühren.
  3. Gut mischen und mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.200 x g für 10 s bei Raumtemperatur) nach unten drehen.
  4. Stellen Sie die Rohre auf einen Thermocycler, der vom unten genannten Programm eingestellt wurde. Lagern Sie die PCR-Produkte bei 4 °C für 1-2 Monate oder ~1 Jahr bei -20 °C.
    HINWEIS: 95 °C für 3 min (Schritt 1, Erstdenaturierung), 95 °C für 15 s (Schritt 2, Denaturierung), 60 °C für 15 s (Schritt 2, Glühen), 72 °C für 45 s (Schritt 2, Verlängerung), Wiederholungsschritt 2 für 35 Zyklen, 72 °C für 10 min (Schritt 3, Endverlängerung) und 4 °C (Schritt 4, Halten).

5. Inkubation mit Restriktionsenzym

  1. Bereiten Sie die Enzymlösung vor, die 7 μL nukleasefreiesH2O, 2 μL 10x CutSmart-Puffer und 1 μL NlaIII-Restriktionsenzym enthält (siehe Materialtabelle). Wenn es mehrere Proben gibt, multiplizieren Sie jeden Inhalt zu der Mischung und aliquot 10 μL pro Röhrchen.
  2. 10 μL PCR-Produkt, das in Schritt 3 erhalten wurde, pro Röhrchen in die Enzymlösung geben.
  3. Gut mischen und mit einer Tisch-Minizentrifuge (2.200 x g für 10 s bei Raumtemperatur) nach unten drehen.
  4. Stellen Sie die Rohre auf einen Thermocycler oder Wärmeblock, der vom unten genannten Programm eingestellt wurde. Lagern Sie das Produkt nach der Inkubation bei 4 °C für 1-2 Monate oder ~1 Jahr bei -20 °C.
    HINWEIS: 37 °C für 16 h (mindestens 2 h; kurze Inkubationszeit kann zu unzureichender Spaltung führen) und 4 °C für das Halten.

6. DNA-Bandennachweis

  1. Bereiten Sie ein 1,5% iges Agarosegel mit DNA-Gel-Färbung für die Elektrophorese vor.
    1. Fügen Sie 0,75 g Agarose in 50 ml 1x TAE-Puffer hinzu, gefolgt von Mischung und Hitze in der Mikrowelle, bis sich Agarose vollständig auflöst. Nach dem Abkühlen 5 μL DNA-Fleck hinzufügen und vorsichtig mischen.
    2. Gießen Sie in die Gelform (25 ml pro Form) und lassen Sie das Gel erstarren. Um eine bessere Auflösung und Trennung zu erhalten, erhöhen Sie die Agarosekonzentration bei Bedarf auf 2,5% -4%.
  2. Laden Sie 10 μL verdautes PCR-Produkt in die Vertiefung. Mischen Sie bei Bedarf 6x Ladepuffer.
  3. Lassen Sie das Gel mit 100 V für 35 Minuten laufen.
    HINWEIS: Diese Parameter müssen möglicherweise optimiert werden.
  4. Bild unter UV-Licht (302 nm Wellenlänge).

Ergebnisse

Das CRISPR/Cas9-Gen-Editing-System erzeugt eine ATG-zu-TTA-Mutation und eine stille TCC-zu-TCG-Mutation bei 56.264.279 bis 56.264.281 und bei 56.264.291 bis 56.264.293 auf Mauschromosom 10 bzw. bei 869 bis 871 bzw. 881 bis 883 auf Gja1-mRNA. Diese Mutation führt zu einer Mutation von Methionin 213 zu Leucin (M213L) auf dem GJA1-Protein, und die TTC-zu-TTG-Mutation stört eine nahe gelegene PAM-Sequenz, um eine unerwünschte Genedition zu vermeiden (Abbildung 1). Die Details der Mutation sin...

Diskussion

Ein genmodifiziertes Mausmodell ist ein gängiger Ansatz zum Verständnis der Genfunktion. Da jedoch die intern übersetzte Isoform GJA1-20k aus derselben Gja1-mRNA wie die Cx43 in voller Länge übersetzt wird, wurde eine kreative Strategie entwickelt, um die Cx43-Expression in voller Länge beizubehalten und dennoch die GJA1-20k-Expression zu unterdrücken. Der Ansatz basiert auf einer Mutation des internen Startcodons von GJA1-20k. Mit einer Einzelpunktmutation wurde M213 auf L auf Gja1 mRNA umgestellt, wodur...

Offenlegungen

Die Autoren haben nichts offenzulegen.

Danksagungen

Das Projekt wurde durch Zuschüsse der National Institutes of Health (R01HL152691, R01HL138577 und R01HL159983) an RMS unterstützt.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL 8-Strip PCR tubeThomas Scientific1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0Invitrogen15575-038For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart bufferNew England BiolabsB7204SDigestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE BufferInvitrogen24710-030
96-well Thermal cyclerApplied BiosystemsModel # 9902
AgaroseSigma-AldrichA9539
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664mouse strain
Chemidoc MP imaging systemBio-radTo take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 proteinMilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024SLoading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)MilliporeSigma23-073-425G
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3884-100MG
Image Lab softwareBio-radTo analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDICZeissAxiovert A1
KAPA Mouse Genotyping KitsRoche DiagnosticsKK7352For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOMLifeGlobalZEKS-050embryo culture medium
Lab coart
M2 mediumMilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125STo digest PCR product
Nuclease-Free WaterAmbionAM9937To dilute reagents
Paraffin oilNacalai USA2613785
Plugged 20 μL fine pipette tipFisherScientific02-707-171To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)ProSpec-TanyHOR-272
Sodium ChlorideInvitrogenAM9760GFor pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel StainInvitrogenS33102To detect bands in gel
tracrRNADharmaconU-002000-120Guid RNA

Referenzen

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