전장 단백질의 발현을 유지하면서 mRNA로부터 내부 번역 개시 부위의 제거

요약

본 프로토콜은 Gja1에서 전장 Connexin43 생성을 유지하지만 더 작은 GJA1-20k 내부 번역 이소형의 번역을 방지하는 단일 M213L 돌연변이를 기술한다.

초록

게놈 복구 메카니즘에 기초한 CRISPR-Cas9 유전자 편집 시스템은 전통적인 상동성 재조합에 비해 유전자 변형된 마우스 모델을 보다 빠르고 쉽게 생성할 수 있게 한다. CRISPR-Cas9 시스템은 단일 점 돌연변이가 필요할 때 특히 매력적입니다. 갭 접합 단백질인 Connexin 43 (Cx43)은 유전자 Gja1에 의해 코딩되며, 유전자 Gja1은 단일 코딩 엑손을 가지며 접합될 수 없다. 그러나 Gja1은 전장 Cx43 단백질뿐만 아니라 내부 번역으로 알려진 과정에 의해 최대 여섯 개의 N 말단 절단 이소형을 생산하며, 이는 내부 AUG (메티오닌) 시작 부위에서 리보솜 번역 개시의 결과입니다. GJA1-20k는 Gja1 mRNA의 위치 213에서 AUG 코돈에서 개시되는 Cx43의 가장 일반적으로 생성된 절단된 이소형이다. 잔기 213은 Cx43의 마지막 막횡단 도메인의 끝에서 발생하기 때문에, GJA1-20k는 독립적인 단백질로서 Cx43의 20 kDa C 말단 꼬리이다. 이전의 연구자들은 세포에서 GJA1-20k의 중요한 역할이 원형질막으로의 전장 Cx43 갭 접합 반원로의 밀매를 촉진하는 것임을 확인했다. 생체내에서 이러한 현상을 조사하기 위해, 잔기 213에서 ATG(메티오닌)를 TTA(류신, M213L 돌연변이)로 대체하는 Gja1 점 돌연변이를 갖는 돌연변이 마우스가 생성되었다. M213L의 결과는 Gja1 mRNA와 전장 Cx43이 여전히 생성되지만 Gja1-20k의 번역은 현저히 감소한다는 것이다. 이 보고서는 하나의 아미노산 돌연변이 (Gja1^{M213L / M213L}) 마우스 모델을 개발하기 위해 제한 효소 부위를 선택하는 데 중점을 둡니다. 이 프로토콜은 CRISPR-Cas9 시스템에 의한 유전자 변형 마우스와 PCR 및 제한 효소 처리를 결합하여 신속한 유전자형을 기술한다.

서문

전장 코넥신 43 (Cx43) 및 N 말단 절단된 이소형, GJA1-20k는 동일한 GJA1 mRNA에 의해 코딩되지만 번역을 개시하기 위해 상이한 시작 코돈¹을 이용한다. Cx43 번역은 제1 AUG 개시 코돈에서 발생하는 반면, GJA1-20k 번역은 잔기 213에서 AUG에서 개시된다. GJA1-20k는 전장 Cx43 밀매, 액틴 안정화 및 시험관 내 미토콘드리아 형태학의 조절에 필수적인 역할을한다는 것이 이전에 발견되었습니다 ^1,2,3.

생체내에서 GJA1-20k의 역할을 이해하기 위해, 전장 Cx43을 생성하는 능력을 유지하는 GJA1-20k "녹아웃" 마우스 모델이 생성되었다. 접근법은 CRISPR-Cas9 시스템을 사용하여 213의 단일 잔기를 메티오닌 (M)에서 류신 (L) (Gja1^{M213L / M213L})⁴로 대체하는 것이 었습니다. 내부 M 내지 L 돌연변이는 내부 번역이 발생할 가능성을 극적으로 감소시키면서도 전장 단백질⁴의 번역 및 기능을 유지한다. 야생형(WT)과 돌연변이된 대립유전자는 크기가 동일하고 mRNA 산물이 거의 동일하기 때문에, 마우스에서 유전자형을 확인하는 데 상당한 어려움이 있다. DNA 시퀀싱은 돌연변이를 확인할 수 있지만 일상적인 사용에는 너무 비싸고 시간이 많이 걸립니다. 일반적으로, 실시간 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR), 미니시퀀싱-라이게이션, 고분해능 용융 분석, 및 테트라-프라이머 증폭 난 치성 돌연변이 시스템 PCR(ARMS-PCR)5,6,7,8과 같은 몇 가지 더 빠른 지노타이핑 방법이 확립되었다. 그러나 이러한 대안적인 방법에는 비특이적 PCR 산물을 유도할 수 있는 여러 단계, 고유한 자원 및/또는 몇 가지 특정 프라이머 세트가 필요합니다.

이 프로토콜은 단일 아미노산 돌연변이를 만들기 위해 CRISPR-Cas9에 의한 상세한 유전자 표적화 및 편집 접근법을 소개하고, 돌연변이를 확인하기 위해 신속한 지노타이핑이 제시된다. 유전자형 동정은 표적 유전자를 확인하기 위해 단 하나의 프라이머 세트만을 활용하는 제한 효소의 창조적 사용을 포함한다. 독자는 1 잔기 Gja1^{M213L / M213L} 치환 돌연변이로 인한 갑작스런 심장 사망의 심오한 전기 생리 학적 효과를 관찰하기 위해 참조⁴를 참조합니다.이 돌연변이는 여전히 전장 단백질을 생성하지만 더 작은 내부 번역 절단 이소형을 생성하지 못합니다. 이 프로토콜은 다른 마우스 모델이 내인성 전장 단백질의 발현을 유지하면서 관심있는 이소형의 내부 번역을 줄이기 위해 점 돌연변이를 사용하도록 하는 데 도움이 될 것이다.

프로토콜

"모든 동물 관리 및 연구 프로토콜은 Cedars-Sinai Medical Center와 University of Utah의 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 8-9주령에 상업적 공급원으로부터 얻은 C57BL/6J 암컷 마우스( 표 자료 참조)를 실험에 사용하였다.

1. 유전자 표적화를 위한 준비

1. CRISPOR 웹 알고리즘 4,9,10을 사용하여 M213을 코딩하는 표적화된 돌연변이 부위 주위의 가이드 표적 서열을 선택하십시오(자료의 표 참조).
   참고: GJA1 코딩 서열로부터의 반대 가닥에 있는 20-염기 가이드 서열(ATTCAGAGCGAGAGAGACACCA)을, MIT 스코어¹¹ 의 62로 돌연변이될 코돈(ATG)의 하류의 16개 염기 이후에 잠재적인 절단 부위가 위치하는 것을 선택하였다(도 1; 전체 crRNA 서열은 표 1에 도시됨).
2. Cas9와 상호작용하는 crRNA 및 tracrRNA를 가이드 RNA¹²로서 합성한다.
   참고: 가이드 RNA의 MIT 스코어는 62이지만, PAM으로부터 12개 이상의 염기 떨어져 있는 네 개의 미스매치를 갖는 단 하나의 잠재적인 오프 타겟 돌연변이가 있다. 따라서, 이러한 가이드 RNA는 안전한 것으로 간주된다.
3. 가이드 서열에 상보적인 올리고노어 설계는 단일 아미노산 치환(ATG를 TTA로; M213L)을 각각 5'- 및 3'-측에 60 및 48개의 염기 상동성 암을 갖는다.
   참고: 이러한 공여체 올리고는 침묵 돌연변이(TCC를 TCG에 도입함)를 도입함으로써 PAM(AGG 내지 ACG)의 파괴를 위한 점 돌연변이를 포함한다. S217S) 후 CRISPR 상동성 지시 복구(HDR)¹³ 후 의도된 돌연변이의 도입을 위한 재편집을 피한다(도 1 및 표 1).
4. NaCl (200 mM 최종 농도)을 사용하여 10 μg의 올리고를 침전시켜 염의 운반을 전핵 미세주입 완충액 (10 mM의 Tris-HCl, pH 7.5; 0.1 mM의 EDTA, 및 스페르민 및 스페르미딘¹⁴가 없는 100 mM의 NaCl)으로 운반하는 것을 최소화한다.
   참고 : 펠렛이 용액에 용해 될 수 있으므로 DNA 펠렛을 70 % 에탄올로 씻지 마십시오.
5. 50 ng/μL의 공여체 올리고, 60 ng/μL의 crRNA/tracrRNA 믹스(1:1 몰비)(단계 1.2부터) 및 50 ng/μL의 eSpCas9 단백질(물질 표 참조)을 혼합하여 최종 부피 20μL 의 CRISPR 혼합물을 만듭니다(표 2). 높은 독성이 관찰되는 경우 기증자 올리고의 농도를 감소시키십시오 (예를 들어, 25 ng / μL).

2. 과배란 유도, 계란 수확, CRISPR 믹스의 전핵 미세 주사 및 배반포 스크리닝

참고: 이 절차는 이전에 게시된 일반 프로토콜¹⁴를 따릅니다.

1. 100 μL의 멸균수에 5 IU의 PMSG (임신 한 mare의 혈청 성선 자극 호르몬) ( 물질 표 참조)를 약 3:00 p.m.에서 복강 내 접근에 의해 8 주령의 5-10 마우스에게 주사하십시오 (1 일째).
2. PMSG 주사 후 46-48 h 후에 복강내 접근에 의해 난자 공여자에게 100 μL의 멸균수에 hCG (인간 융모 성 성선 자극 호르몬) 5 IU를 주입하십시오 (3 일째). 스터드 수컷과 함께 1:1 번식을 설정하십시오.
3. 히알루로니다아제로 M2 배지에서 수정란을 수확하고, 100 μL의 M2 배지에서 10:00 a.m.에 3회 세척한 다음, mWM¹⁵ 또는 KSOM¹⁶ 배지(4일째) 에 보관한다(표 참조).
4. CRISPR 혼합물(단계 1.3)을 플라스틱 접시에 파라핀 오일로 덮인 M2¹⁰⁰ μL의 전핵 미세주입에 의해 마우스로부터 수확한 1-세포 단계 배아 내로 조만간 내지 늦은 오후에 대조-증강 광학 장치를 갖는 거꾸로 현미경 상에 도입한다(비디오 1).
   주: CRISPR 혼합물의 전핵 미세주입은 14-16 h 후코이툼에서 1-세포 단계 배아 상에서 수행되었다 (p.c.). 주입된 배아를 5%_CO2 인큐베이터에서 몇 시간 동안 배양하고, 같은 날 아침 18-20 h p.c.에서 외과적으로 복사플러그를 갖는 수용자 ICR 마우스로 옮겼다.
5. 20-30개의 2-세포 배아를 각 수용자 내로 옮겨 재조합 동물을 생산한다.
   참고: 일반적인 프로토콜¹⁴ 에 따르거나 이들 배아를 mWM 또는 KSOM 배지에서 4일 동안 배양하여 효율을 검증하고 독성을 검사한다. CRISPR 혼합물의 독성은 주입된 배아의 적어도 삼분의 일이 그들 사이에 다수의 재조합체와 함께 완전히 팽창된 배반포 단계에 일찍 도달할 때 허용가능하다. 동시에, 조작되지 않은 배아의 90 % 이상이 평행 배양에서 동일한 배반포 단계에 도달합니다. 배낭 스크리닝을 위해 2.6-2.9 단계를 따르십시오.이 단계는 필수적이지는 않지만 HDR의 성공률을 정량화하는 데 선호되는 경우 수행 할 수 있습니다.
6. 마이크로피펫터가 있는 플러그형 미세 피펫 팁을 사용하여 2 μL의 배양 배지로 완전히 팽창된 배반포를 단일 PCR 튜브로 개별적으로 조기에 픽업한다(8일째; 비디오 2).
7. 용해물 배반포를 8 μL의 소화 혼합물 (단계 3.2와 동일함; 표 표 참조)에 처리하고, 75°C에서 10분 동안, 95°C에서 5분 동안 처리하고, 이어서 저장을 위해 4°C로 냉각시킨다. 총 15 μL PCR 혼합물에서 2 μL의 용해물을 PCR용 주형으로 사용한다(단계 3).
8. NlaIII로 제한 소화한 후 PCR 샘플의 아가로스 겔 전기영동에 의해 HDR^{의 효능} 을 조사한다(단계 3-5).
9. 돌연변이의 완전성을 확인하기 위해 설립자 및 후속 자손에서 668 bp 앰플리콘¹⁷ 을 시퀀싱하여 표적 재조합의 상태를 확인한다.

3. DNA 추출

참고: 출생 후 10일째에 마우스는 출생 후 2-4주 경에 GJA1-20k 녹아웃 마우스의 갑작스런 사망으로 인해 이 실험에 사용되었다⁴. 보다 일반적인 프로토콜은 또한 이전에 공개된 보고서⁽¹⁸)에 따라 적용될 수 있다.

1. 깨끗한 가위로 발가락 또는 꼬리 끝 1-3mm를 자르고 0.2 mL 8-Strip PCR 튜브로 옮깁니다. 발가락 또는 꼬리 샘플 간의 오염을 방지하려면 미리 세척한 가위 또는 마우스당 하나의 블레이드를 사용하거나 70% 에탄올 또는 10% 표백제를 사용하여 각 샘플 전에 청소하십시오. 꼬리가 샘플링 후 피를 흘리면 거즈로 짧은 압력을 가하여 출혈을 막으십시오. 꼬리 샘플을 추출될 때까지 -20°C에서 약 일주일 동안 보관한다.
2. 조직 용해 용액 ( 재료 표 참조)을 100 μL / 튜브에 넣고 잘 섞은 다음 탁상 미니 원심 분리기 (실온에서 10 초 동안 2,200 x g )로 스핀 다운하십시오. 꼬리 샘플이 용액에 잠겨 있는지 확인하십시오.
3. 튜브를 다음 프로그램에 의해 설정된 열 사이클러 위에 놓으십시오. 10분 동안 75°C(조직 용해), 5분 동안 95°C(불활성화), 및 4°C(유지). PCRs가 즉시 수행될 수 없는 경우에 조직 용해물을 최대 일주일 동안 4°C에서 저장한다.

4. PCR에 의한 DNA 증폭

1. 시료당 5 μL의 뉴클레아제가 없는_H2O, 0.75 μL의 10 μM 정방향 및 역방향 프라이머, 및 7.5 μL의 PCR 마스터 믹스( 물질표 참조)를 포함하는 PCR 용액을 새로운 PCR 튜브에 넣었다(프라이머 서열에 대해서는 표 1 참조). 샘플이 여러 개 있는 경우, 내용물을 튜브 당 분취량 14 μL로 스케일링한다.
2. 조직 용해물 1 μL를 단계 3.1에서 제조된 PCR 용액에 첨가한다. 꼬리에 닿지 않도록주의하십시오.
3. 잘 섞어서 탁상용 미니 원심 분리기 (실온에서 10 초 동안 2,200 x g )로 회전하십시오.
4. 튜브를 아래 언급 된 프로그램에 의해 설정된 열 사이클러 위에 놓으십시오. PCR 산물을 4°C에서 1-2개월 동안 또는 -20°C에서 ∼1년 동안 보관한다.
   참고: 3분 동안 95°C(단계 1, 초기 변성), 15초 동안 95°C(단계 2, 변성), 15초 동안 60°C(단계 2, 어닐링), 45초 동안 72°C(단계 2, 확장), 35 사이클 동안 2단계, 10분 동안 72°C(단계 3, 최종 확장) 및 4°C(단계 4, 유지)를 반복합니다.

5. 제한효소를 이용한 배양

1. 7 μL의 뉴클레아제가 없는_{H2O, 2}μL의 10x CutSmart 버퍼 및 1 μL의 NlaIII 제한 효소를 함유하는 효소 용액을 준비 한다(표 참조). 여러 샘플이있는 경우 각 함량을 곱하여 튜브 당 10 μL의 분취량을 혼합하십시오.
2. 단계 3에서 수득한 PCR 산물 10 μL를 튜브당 효소 용액에 첨가한다.
3. 잘 섞어서 탁상용 미니 원심 분리기 (실온에서 10 초 동안 2,200 x g )로 회전하십시오.
4. 튜브를 아래 언급 된 프로그램에 의해 설정된 열 사이클러 또는 열 블록에 설정하십시오. -20°C에서 1-2개월 또는 ∼1년 동안 4°C에서 인큐베이션한 후 생성물을 보관한다.
   참고: 16시간 동안 37°C(최소 2시간; 짧은 인큐베이션 시간으로 인해 불충분한 절단이 발생할 수 있음) 및 유지를 위한 4°C.

6. DNA 밴드 검출

1. 전기영동을 위한 DNA 겔 염색을 함유하는 1.5% 아가로스 겔을 제조하였다.
   1. 0.75 g의 아가로스를 50 mL의 1x TAE 완충액에 넣은 다음, 아가로스가 완전히 용해될 때까지 마이크로파에서 혼합 및 가열하였다. 식힌 후 5 μL의 DNA 염색을 넣고 부드럽게 혼합하십시오.
   2. 겔 몰드 (몰드 당 25 mL)에 붓고 겔이 응고되도록하십시오. 더 나은 분해능과 분리를 얻으려면 필요에 따라 아가로스 농도를 2.5 % -4 %로 늘리십시오.
2. 소화된 PCR 산물 10 μL를 웰에 로딩한다. 필요한 경우 6x 로딩 버퍼를 혼합하십시오.
3. 젤을 35 분 동안 100V로 실행하십시오.
   참고: 이러한 매개 변수는 최적화가 필요할 수 있습니다.
4. UV 광 (302 nm 파장) 아래의 이미지.

결과

CRISPR/Cas9 유전자 편집 시스템은 마우스 염색체 10에서 각각 56,264,279 내지 56,264,281 및 56,264,291에서 56,264,293, 또는 Gja1 mRNA에서 869 내지 871 및 881 내지 883에서 ATG에서 TTA 돌연변이에 대한 ATG 돌연변이 및 침묵하는 TCC 돌연변이를 생성한다. 이러한 돌연변이는 GJA1 단백질에 대한 메티오닌 213 내지 류신 (M213L) 돌연변이를 초래하고, TTC에서 TTG 돌연변이는 바람직하지 않은 유전자 판을 피하기 위해 근처의 P...

토론

유전자 변형 마우스 모델은 유전자 기능을 이해하기위한 일반적인 접근법입니다. 그러나, GJA1-20k 내부적으로 번역된 이소형이 전장 Cx43과 동일한 Gja1 mRNA로부터 번역되기 때문에, GJA1-20k 발현을 억제하면서도 전장 Cx43 발현을 억제하기 위한 창의적인 전략이 고안되었다. 상기 접근법은 GJA1-20k의 내부 시작 코돈의 돌연변이에 기초한다. 단일 점 돌연변이로, M213은 Gja1 mRNA 상에서 L로 전환되었?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL 8-Strip PCR tube	Thomas Scientific	1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575-038	For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027	For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer	Invitrogen	24710-030
96-well Thermal cycler	Applied Biosystems	Model # 9902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	mouse strain
Chemidoc MP imaging system	Bio-rad		To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein	MilliporeSigma	ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S	Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)	MilliporeSigma	23-073-425G
Hyaluronidase	MilliporeSigma	H3884-100MG
Image Lab software	Bio-rad		To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC	Zeiss	Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits	Roche Diagnostics	KK7352	For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM	LifeGlobal	ZEKS-050	embryo culture medium
Lab coart
M2 medium	MilliporeSigma	MR015D
NlaIII	New England Biolabs	R0125S	To digest PCR product
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937	To dilute reagents
Paraffin oil	Nacalai USA	2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip	FisherScientific	02-707-171	To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)	ProSpec-Tany	HOR-272
Sodium Chloride	Invitrogen	AM9760G	For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	To detect bands in gel
tracrRNA	Dharmacon	U-002000-120	Guid RNA