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要約

本プロトコールは、完全長コネキシン43生成を保持するが、より小さなGJA1-20k内部翻訳アイソフォームの翻訳を防止する、Gja1における単一のM213L変異を記載する。

要約

ゲノム修復機構に基づくCRISPR-Cas9遺伝子編集システムは、従来の相同組換えと比較して、遺伝子改変マウスモデルをより迅速かつ容易に生成することを可能にする。CRISPR-Cas9システムは、単一点変異が望まれる場合に特に魅力的である。ギャップ接合タンパク質であるコネキシン43(Cx43)は、単一のコードエクソンを有し、スプライシングできない遺伝子Gja1によってコードされる。しかし、Gja1は、全長Cx43タンパク質だけでなく、内部翻訳として知られるプロセスによって最大6つのN末端切断アイソフォームを産生し、その結果、内部AUG(メチオニン)開始部位でのリボソーム翻訳開始が生じる。GJA1−20kは、Gja1 mRNAの213位のAUGコドンで開始されるCx43の最も一般的に生成されたトランケートアイソフォームである。残基213はCx43の最後の膜貫通ドメインの末端に存在するので、GJA1-20kは、独立したタンパク質として事実上、Cx43の20kDaのC末端尾部である。以前の研究者らは、細胞において、GJA1-20kの重要な役割は、原形質膜への全長Cx43ギャップ接合ヘミチャネルのトラフィッキングを促進することであると同定した。この現象を 生体内で調べるために、残基213のATG(メチオニン)をTTA(ロイシン、M213L変異)で置換するGja1点変異を有する変異マウスを作製した。M213Lの結果、Gja1 mRNAおよび完全長Cx43は依然として生成されているが、Gja1-20kの翻訳は有意に減少している。本報告では、1アミノ酸変異(Gja1 M213L/M213L)マウスモデルを開発するための制限酵素部位の選択に着目した。このプロトコルは、CRISPR-Cas9システムによる遺伝子改変マウスと、PCRと制限酵素処理を組み合わせたラピッドジェノタイピングについて説明しています。

概要

全長コネキシン43(Cx43)およびN末端切断アイソフォームGJA1-20kは、同じGJA1 mRNAによってコードされるが、翻訳を開始するために異なる開始コドン1を利用する。Cx43翻訳は最初のAUG開始コドンで起こり、一方GJA1-20k翻訳は残基213のAUGで開始する。GJA1-20kは、インビトロでの完全長Cx43トラフィッキング、アクチン安定化、およびミトコンドリア形態の調節に不可欠な役割を果たすことが以前に見出された1,2,3。

生体内でのGJA1-20kの役割を理解するために、完全長Cx43を作成する能力を保持したGJA1-20k「ノックアウト」マウスモデルが生成された。このアプローチは、CRISPR-Cas9システムを使用して、213の単一残基をメチオニン(M)からロイシン(L)(Gja1M213L/M213L)4に置換することでした。内部MからLへの変異は、内部翻訳が起こる可能性を劇的に低下させるが、それでも完全長タンパク質4の翻訳および機能を保持する。野生型(WT)と変異対立遺伝子は同一のサイズおよびほぼ同一のmRNA産物を有するため、マウスにおける遺伝子型を確認するのはかなり困難である。DNAシーケンシングは変異を同定できますが、日常的な使用には高価で時間がかかります。一般に、リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応(RT-PCR)、ミニシーケンシングライゲーション、高分解能融解解析、テトラプライマー増幅難治性変異システムPCR(ARMS-PCR)5、6、7、8など、いくつかの高速ジェノタイピング法が確立されています。しかし、これらの代替法は、複数のステップ、独自のリソース、および/または非特異的PCR産物を誘導する可能性のあるいくつかの特異的プライマーセットを必要とする。

このプロトコルは、CRISPR-Cas9による詳細な遺伝子ターゲティングおよび編集アプローチを導入して単一のアミノ酸変異を作成し、その変異を確認するためにラピッドジェノタイピングを提示する。遺伝子型同定は、標的遺伝子を同定するために単一のプライマーセットのみを利用する制限酵素の創造的な使用を含む。読者は参考文献4 を参照し、1残基Gja1 M213L/M213L 置換変異によって引き起こされる突然の心臓死の深遠な電気生理学的効果を観察し、それでもなお完全長タンパク質を生成するが、より小さな内部翻訳切断アイソフォームを生成することができない。このプロトコルは、他のマウスモデルが点突然変異を使用して、内因性完全長タンパク質の発現を維持しながら、目的のアイソフォームの内部翻訳を減少させるのに役立ちます。

プロトコル

「すべての動物ケアと研究プロトコルは、シダーズ・シナイ医療センターとユタ大学の施設動物ケアおよび使用委員会によって承認されました。8〜9週齢で市販の供給源から得られたC57BL/6J雌マウス( 材料表を参照)を実験に使用した。

1. 遺伝子ターゲティングの準備

  1. CRISPOR Webアルゴリズム4、9、10を用いてM213をコードする標的変異部位の周囲のガイド標的配列を選択する(材料表を参照のこと)。
    注:20塩基のガイド配列(ATTCAGAGCGAGAGACAACCA)を、GJA1コード配列から反対側の鎖において、MITスコア11 から62で、変異するコドン(ATG)の16塩基下流の16塩基後に位置する電位切断部位を選択した(図1;crRNA配列全体を 表1に示す)。
  2. Cas9と相互作用するcrRNAおよびtracrRNAをガイドRNA12として合成する。
    注:ガイドRNAのMITスコアは62ですが、PAMから12塩基以上離れた4つのミスマッチを持つ潜在的なオフターゲット変異は1つだけです。したがって、このガイドRNAは安全であると考えられる。
  3. 単一のアミノ酸置換を導入するためのガイド配列に相補的なドナーオリゴを設計する(ATGからTTAへ;M213L)は、それぞれ5'−側および3'辺に60および48塩基相同性アームを有する。
    注:このドナーオリゴは、サイレント変異(TCGからTCGへ)を導入することによってPAMを崩壊させるための点変異(TCCからTCGへ;S217S)は、意図された変異の導入のためのCRISPR相同性指向性修復(HDR)13 後の再編集を回避する(図 1および 表1)。
  4. NaCl(最終濃度200 mM)を使用して10 μgのオリゴを沈殿させ、塩の持ち越しを最小限に抑えて前核マイクロインジェクションバッファー(10 mM のTris-HCl、pH 7.5、0.1 mM のEDTA、およびスペルミンおよびスペルミジンを含まない 100 mM のNaCl14)に沈殿させます。
    注:DNAペレットを溶液に溶解させることができるため、70%エタノールでDNAペレットを洗浄しないでください。
  5. ドナーオリゴ50 ng/μL、crRNA/tracrRNAミックス(1:1モル比)の60 ng/μL(ステップ1.2から)、および50 ng/μLのeSpCas9タンパク質( 材料表を参照)を混合して、最終容量20 μLのCRISPR混合物を作ります(表2)。高い毒性が観察される場合(例えば、25ng/μL)ドナーオリゴの濃度を低下させる。

2. 過排卵の誘導、卵子の採取、CRISPRミックスの前核マイクロインジェクション、胚盤胞スクリーニング

メモ: この手順は、以前に公開された一般プロトコル14 に従います。

  1. 5IUのPMSG(妊娠中の牝馬の血清性腺刺激ホルモン)( 材料表を参照)を100μLの滅菌水で、約3:00p.m(1日目)に腹腔内アプローチにより8週齢で5〜10匹のマウスに注射する。
  2. PMSG注射(3日目)の46〜48時間後に腹腔内アプローチにより、100μLの滅菌水中に5IUのhCG(ヒト絨毛性ゴナドトロピン)( 材料表を参照)を卵子提供者に注射する。スタッドオスとの1:1の繁殖を設定します。
  3. ヒアルロニダーゼを含むM2培地で受精卵を収穫し、午前10時頃に100 μLのM2培地で3回洗浄し.m、次いでmWM15 またはKSOM16 培地に保管する(4日目)( 材料表参照)。
  4. CRISPR混合物(ステップ1.3)を、午後の早い時間から遅くまでコントラスト増強光学を備えた倒立顕微鏡上のプラスチック皿上のパラフィンオイルで覆われた100μLのM2の前核マイクロインジェクション14 によってマウスから採取した1細胞期胚に導入する(ビデオ1)。
    注:CRISPR混合物の核前核マイクロインジェクションを、14〜16時間後性交で1細胞期胚に対して行った(p.c)。注射された胚を5%CO2 インキュベーター内で数時間培養し、同朝に交尾プラグを.cしたレシピエントICRマウスに18〜20時間で外科的に移した。
  5. 20〜30個の2細胞胚を各レシピエントに移し、組換え動物を作製した。
    注:一般的なプロトコル14 に従うか、これらの胚をmWMまたはKSOM培地で4日間培養して効率を検証し、毒性を調べます。CRISPR混合物の毒性は、注入された胚の少なくとも3分の1が、それらの中に複数の組換え体を有する完全に拡張された胚盤胞段階に早期に達する場合に許容される。同時に、操作されていない胚の90%以上が並行培養で同じ胚盤胞期に達する。胚盤胞スクリーニングのステップ2.6-2.9に従ってください、これは必須ではありませんが、HDRの成功率を定量化するために好ましい場合は行うことができます。
  6. マイクロピペッター付きの細いピペットチップを単一のPCRチューブに差し込んだものを使用して、2 μLの培養液で早期に完全に拡張された胚盤胞を個別に拾います(8日目; ビデオ2)。
  7. 8 μLの消化混合物中の胚盤胞を溶解し(ステップ3.2と同じ; 材料表を参照)、75°Cで10分間、95°Cで5分間処理し、次いで4°Cまで冷却して保存する。合計15 μL の PCR 混合物で 2 μL の溶解液を PCR のテンプレートとして使用します (ステップ 3)。
  8. NlaIIIによる制限消化後のPCRサンプルのアガロースゲル電気泳動17 によりHDRの有効性を調べる(工程3-5)。
  9. 創始者およびその後の子孫における668 bpアンプリコン17 をシークエンシングすることにより、標的組換えの状態を確認し、変異の完全性を確認する。

3. DNA抽出

注:生後10日目のマウスは、生後2〜4週間頃にGJA1-20kノックアウトマウスが突然死亡したため、この実験に使用した4。より一般的なプロトコルはまた、以前に公開された報告書18に続いて適用することができる。

  1. つま先または尾の先端を清潔なハサミで 1 ~ 3 mm 切断し、0.2 mL 8-Strip PCR チューブに移します。つま先または尾のサンプル間の汚染を避けるために、事前に洗浄されたはさみまたはマウスごとに1枚のブレードを使用するか、70%エタノールまたは10%漂白剤を使用して各サンプルの前に洗浄してください。サンプリング後に尾部が出血した場合は、ガーゼで短時間圧力をかけて出血を止めます。尾部サンプルを抽出まで-20°Cで約1週間保存する。
  2. 組織溶解溶液( 材料表を参照)を100 μL/チューブに加え、よく混合した後、卓上型小型遠心分離機(室温で10秒間、2,200 x g )でスピンダウンします。テールサンプルが溶液に沈んでいることを確認します。
  3. 以下のプログラムで設定したサーマルサイクラーにチューブをセットします。75°Cで10分間(組織溶解)、95°Cで5分間(不活化)、4°C(保持)した。PCRをすぐに実行できない場合は、組織溶解液を4°Cで最大1週間保存してください。

4. PCRによるDNA増幅

  1. サンプルあたり 5 μL のヌクレアーゼフリーH2O、0.75 μL の 10 μM フォワードプライマーおよびリバースプライマー、および 7.5 μL の PCR マスターミックス ( 材料表を参照) を含む PCR 溶液を新しい PCR チューブに調製します (プライマー配列については 表 1 を参照)。サンプルが複数ある場合は、チューブあたり14 μLのアリコートに内容物をスケールします。
  2. ステップ3.1で調製したPCR溶液に1μLの組織溶解液を加える。しっぽに触れないように注意してください。
  3. よく混ぜ合わせ、卓上ミニ遠心分離機(室温で10秒間2,200 x g )でスピンダウンします。
  4. チューブを下記のプログラムでセットしたサーマルサイクラーにセットします。PCR 産物を 4 °C で -20 °C で 1 ~ 2 か月間、または約 1 年間保存します。
    注:95°Cで3分間(ステップ1、初期変性)、95°Cで15秒(ステップ2、変性)、60°Cで15秒(ステップ2、アニーリング)、72°Cで45秒(ステップ2、伸長)、ステップ2を35サイクル繰り返し、72°Cで10分間(ステップ3、最終変性)、および4°C(ステップ4、保持)。

5. 制限酵素によるインキュベーション

  1. ヌクレアーゼフリーH2O7μL、10x CutSmartバッファー2 μL、およびNlaIII制限酵素1 μLを含む酵素溶液を調製します( 材料表を参照)。サンプルが複数ある場合は、各含有量を掛けて混合物を作り、チューブあたり10 μLをアリコートします。
  2. ステップ3で得られたPCR産物10 μLをチューブあたり酵素液に加える。
  3. よく混ぜ合わせ、卓上ミニ遠心分離機(室温で10秒間2,200 x g )でスピンダウンします。
  4. チューブを、下記のプログラムで設定したサーマルサイクラーまたはヒートブロックにセットします。インキュベーション後の生成物を4°Cで1〜2ヶ月間、または-20°Cで〜1年間保存する。
    注:37°Cで16時間(少なくとも2時間、インキュベーション時間が短いと切断が不十分になる場合があります)、保持するには4°Cです。

6. DNAバンド検出

  1. 5%アガロースゲル含有DNAゲル染色剤を電気泳動用に調製した。
    1. 50 mLの1x TAEバッファーに0.75 gのアガロースを加え、続いて混合し、アガロースが完全に溶解するまでマイクロ波で加熱する。冷却後、5 μLのDNA染色剤を加え、穏やかに混合する。
    2. ゲルモールド(モールドあたり25mL)に注ぎ、ゲルを固化させます。より良い分解能と分離を得るには、必要に応じてアガロース濃度を2.5%〜4%に増やします。
  2. 消化したPCR産物10 μLをウェルにロードします。必要に応じて、6倍のローディングバッファを混ぜます。
  3. ゲルを100Vで35分間実行します。
    メモ: これらのパラメータは最適化が必要な場合があります。
  4. UV光(波長302nm)下での画像。

結果

CRISPR/Cas9遺伝子編集系は、マウス10番染色体上でそれぞれ56,264,279~56,264,281および56,264,291~56,264,293に、またはGja1 mRNA上で869~871および881~883でATGからTTAへの変異およびサイレントTCCからTCGへの変異を生じる。これらの変異は、GJA1タンパク質上のメチオニン213からロイシン(M213L)への変異をもたらし、TTCからTTGへの変異は、望ましくない遺伝子編集を避けるために近くのPAM配列を破壊する(

ディスカッション

遺伝子改変マウスモデルは、遺伝子機能を理解するための一般的なアプローチです。しかし、GJA1-20k内部翻訳アイソフォームは全長Cx43と同じ Gja1 mRNAから翻訳されるため、全長Cx43発現を保持しながらGJA1-20k発現を抑制するための創造的な戦略が考案された。このアプローチは、GJA1-20kの内部開始コドンの変異に基づいている。一点変異により、M213はGja1 mRNA上でLに切り替えられ、 GJA1-2...

開示事項

著者らは開示するものは何もありません。

謝辞

このプロジェクトは、国立衛生研究所のRMSへの助成金(R01HL152691、R01HL138577、およびR01HL159983)によって支援されました。

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
0.2 mL 8-Strip PCR tubeThomas Scientific1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0Invitrogen15575-038For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart bufferNew England BiolabsB7204SDigestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5Invitrogen15567-027For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE BufferInvitrogen24710-030
96-well Thermal cyclerApplied BiosystemsModel # 9902
AgaroseSigma-AldrichA9539
C57BL/6JThe Jackson Laboratory664mouse strain
Chemidoc MP imaging systemBio-radTo take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 proteinMilliporeSigmaESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)New England BiolabsB7024SLoading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)MilliporeSigma23-073-425G
HyaluronidaseMilliporeSigmaH3884-100MG
Image Lab softwareBio-radTo analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDICZeissAxiovert A1
KAPA Mouse Genotyping KitsRoche DiagnosticsKK7352For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOMLifeGlobalZEKS-050embryo culture medium
Lab coart
M2 mediumMilliporeSigmaMR015D
NlaIIINew England BiolabsR0125STo digest PCR product
Nuclease-Free WaterAmbionAM9937To dilute reagents
Paraffin oilNacalai USA2613785
Plugged 20 μL fine pipette tipFisherScientific02-707-171To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)ProSpec-TanyHOR-272
Sodium ChlorideInvitrogenAM9760GFor pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel StainInvitrogenS33102To detect bands in gel
tracrRNADharmaconU-002000-120Guid RNA

参考文献

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