Retrait d’un site de démarrage translationnel interne de l’ARNm tout en conservant l’expression de la protéine pleine longueur

Résumé

Le protocole actuel décrit une seule mutation M213L dans Gja1 qui conserve la génération Connexin43 pleine longueur mais empêche la traduction de l’isoforme GJA1-20k traduite en interne plus petite.

Résumé

Le système d’édition de gènes CRISPR-Cas9, basé sur des mécanismes de réparation du génome, permet la génération de modèles murins modifiés par des gènes plus rapidement et plus facilement par rapport à la recombinaison homologue traditionnelle. Le système CRISPR-Cas9 est particulièrement attrayant lorsqu’une mutation monopoint est souhaitée. La protéine de jonction lacunaire, Connexin 43 (Cx43), est codée par le gène Gja1, qui a un seul exon codant et ne peut pas être épissé. Cependant, Gja1 produit non seulement la protéine Cx43 pleine longueur, mais jusqu’à six isoformes tronquées N-terminus par un processus connu sous le nom de traduction interne, résultat de l’initiation de la traduction ribosomique aux sites de départ internes AUG (méthionine). GJA1-20k est l’isoforme tronquée de Cx43 la plus couramment générée initiée au codon AUG à la position 213 de l’ARNm Gja1. Parce que le résidu 213 se produit à la fin du dernier domaine transmembranaire de Cx43, GJA1-20k est effectivement la queue C-terminus de 20 kDa de Cx43 en tant que protéine indépendante. Des chercheurs antérieurs ont identifié, dans les cellules, qu’un rôle essentiel de GJA1-20k est de faciliter le trafic des hémicanaux de jonction lacunaire Cx43 sur toute la longueur vers la membrane plasmique. Pour examiner ce phénomène in vivo, une souris mutante avec une mutation ponctuelle Gja1 a été générée qui remplace l’ATG (méthionine) au résidu 213 par la TTA (leucine, mutation M213L). Le résultat de M213L est que l’ARNm Gja1 et le Cx43 pleine longueur sont toujours générés, mais la traduction de Gja1-20k est considérablement réduite. Ce rapport se concentre sur le choix du site de l’enzyme de restriction pour développer un modèle murin à un acide aminé muté (^{Gja1 M213L / M213L}). Ce protocole décrit des souris génétiquement modifiées par le système CRISPR-Cas9 et un génotypage rapide en combinant la PCR et les traitements enzymatiques de restriction.

Introduction

La Connexine 43 pleine longueur (Cx43) et l’isoforme tronquée N-terminus, GJA1-20k, codées par le même ARNm GJA1 mais utilisent des codons de départ^{différents 1} pour initier la traduction. La traduction Cx43 se produit au premier codon de début AUG, tandis que la traduction GJA1-20k commence à l’AUG au résidu 213. Il a déjà été constaté que GJA1-20k a des rôles essentiels pour le trafic complet de Cx43, la stabilisation de l’actine et la régulation de la morphologie mitochondriale in vitro ^1,2,3.

Pour comprendre le rôle de GJA1-20k in vivo, un modèle de souris GJA1-20k « knock-out » a été généré qui a conservé la capacité de créer un Cx43 pleine longueur. L’approche consistait à utiliser le système CRISPR-Cas9 pour remplacer le résidu unique à 213 d’une méthionine (M) à une leucine (L) (Gja1^M213L/M213L)⁴. Une mutation interne de M à L diminue considérablement la probabilité de traduction interne tout en conservant la traduction et la fonction de la protéine⁴ pleine longueur. Étant donné que le type sauvage (WT) et l’allèle muté ont des tailles identiques et des produits d’ARNm presque identiques, il est très difficile de confirmer le génotype chez les souris. Le séquençage de l’ADN peut identifier la mutation, mais il est trop coûteux et prend trop de temps pour une utilisation de routine. En général, plusieurs méthodes de génotypage plus rapides ont été établies, telles que la réaction en chaîne par polymérase en temps réel (RT-PCR), la mini-ligature-ligature, l’analyse de fusion à haute résolution et le système de mutation réfractaire par amplification tétra-amorce PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Pourtant, ces méthodes alternatives nécessitent plusieurs étapes, des ressources uniques et / ou plusieurs ensembles d’amorces spécifiques qui peuvent induire des produits de PCR non spécifiques.

Ce protocole introduit une approche détaillée de ciblage et d’édition des gènes par CRISPR-Cas9 pour créer une mutation d’acide aminé unique, et un génotypage rapide est présenté pour confirmer la mutation. L’identification du génotype implique l’utilisation créative d’enzymes de restriction utilisant un seul ensemble d’amorces pour identifier le gène cible. Les lecteurs sont renvoyés à la référence⁴ pour observer l’effet électrophysiologique profond de la mort subite cardiaque causée par une mutation de substitution^{Gja1 M213L/M213L} à un résidu qui génère toujours une protéine pleine longueur mais ne parvient pas à générer une isoforme de troncature traduite en interne plus petite. Ce protocole aidera d’autres modèles de souris à utiliser une mutation ponctuelle pour diminuer la traduction interne d’une isoforme d’intérêt tout en conservant l’expression de la protéine endogène pleine longueur.

Protocole

« Tous les protocoles de soins et d’études sur les animaux ont été approuvés par les comités institutionnels de soins et d’utilisation des animaux du Cedars-Sinai Medical Center et de l’Université de l’Utah. Des souris femelles C57BL/6J obtenues à partir de sources commerciales à l’âge de 8 à 9 semaines (voir tableau des matériaux) ont été utilisées pour les expériences.

1. Préparation au ciblage génique

1. Sélectionnez la séquence cible guide autour du site de mutation ciblé codant M213 à l’aide de ^{l’algorithme} Web CRISPOR ^4,9,10 (voir Tableau des matériaux).
   REMARQUE: Une séquence guide à 20 bases (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), dans le brin opposé de la séquence codante GJA1, avec un score MIT¹¹ sur 62 a été sélectionnée dans laquelle le site de clivage potentiel est situé après 16 bases en aval du codon à muter (ATG) (Figure 1; la séquence complète de l’ARNc est illustrée dans le tableau 1).
2. Synthétisez l’ARNc et le tracrRNA qui interagissent avec Cas9 comme ARN guide¹².
   REMARQUE: Bien que le score MIT de l’ARN guide soit de 62, il n’y a qu’une seule mutation potentielle hors cible avec quatre incohérences à plus de 12 bases du PAM. Par conséquent, cet ARN guide est considéré comme sûr.
3. Concevoir un oligo donneur complémentaire à la séquence guide pour introduire une substitution d’acide aminé unique (ATG à TTA; M213L) avec 60 et 48 bases de bras d’homologie sur les côtés 5' et 3', respectivement.
   REMARQUE: Cet oligo donneur comprend une mutation ponctuelle pour la perturbation du PAM (AGG à ACG) en introduisant une mutation silencieuse (TCC à TCG; S217S) pour éviter de rééditer après réparation dirigée par homologie CRISPR (HDR)¹³ pour l’introduction des mutations prévues (Figure 1 et Tableau 1).
4. Utiliser le NaCl (concentration finale de 200 mM) pour précipiter 10 μg d’oligos afin de minimiser le transfert de sel dans le tampon de micro-injection pronucléaire (10 mM de Tris-HCl, pH 7,5; 0,1 mM d’EDTA et 100 mM de NaCl sans spermine ni spermidine¹⁴).
   REMARQUE: Ne lavez pas la pastille d’ADN avec de l’éthanol à 70%, car la pastille peut être dissoute dans la solution.
5. Mélanger 50 ng/μL d’oligo donneur, 60 ng/μL de mélange aRNc/tracrRNA (rapport molaire 1:1) (à partir de l’étape 1.2) et 50 ng/μL de protéine eSpCas9 (voir Tableau des matériaux) pour obtenir le mélange CRISPR dans le volume final de 20 μL (tableau 2). Diminuer la concentration de l’oligo donneur si une toxicité élevée est observée (p. ex., 25 ng/μL).

2. Induction de la superovulation, récolte des œufs, microinjection pronucléaire du mélange CRISPR et dépistage des blastocystes

REMARQUE : Cette procédure suit un protocole général¹⁴ publié précédemment.

1. Injecter 5 UI de PMSG (gonadotrophine sérique de jument gravide) (voir tableau des matériaux) dans 100 μL d’eau stérile à 5-10 souris à l’âge de 8 semaines par une approche intrapéritonéale vers 3h00 p.m. (jour 1).
2. Injecter 5 UI d’hCG (gonadotrophine chorionique humaine) (voir tableau des matériaux) dans 100 μL d’eau stérile aux donneuses d’ovules par une approche intrapéritonéale 46-48 h après l’injection de PMSG (jour 3). Mettre en place un élevage 1:1 avec des mâles étalons.
3. Récolter les œufs fécondés dans un milieu M2 avec de la hyaluronidase, laver trois fois dans 100 μL de milieu M2 vers 10h00 a.m., puis conserver dans le milieu mWM¹⁵ ou KSOM¹⁶ (jour 4) (voir tableau des matériaux).
4. Introduire le mélange CRISPR (étape 1.3) dans des embryons au stade 1 cellule prélevés sur les souris par microinjection pronucléaire^{14 dans 100} μL de M2 recouverts d’huile de paraffine dans un plat en plastique sur un microscope inversé avec une optique améliorant le contraste en début ou en fin d’après-midi (vidéo 1).
   NOTE: La microinjection pronucléaire du mélange CRISPR a été réalisée sur des embryons au stade 1 cellule à 14-16 h après le coït (p.c.). Les embryons injectés ont été cultivés dans un incubateur à 5% de CO₂ pendant quelques heures et transférés chirurgicalement à 18-20 h p.c. chez des souris ICR receveuses qui avaient un bouchon de copulation le matin même.
5. Transférer 20 à 30 embryons à 2 cellules dans chaque receveur pour produire des animaux recombinants.
   REMARQUE: Suivez le protocole général¹⁴ ou cultivez ces embryons dans un milieu mWM ou KSOM pendant 4 jours pour valider l’efficacité et examiner la toxicité. La toxicité du mélange CRISPR est acceptable lorsqu’au moins un tiers des embryons injectés atteignent tôt le stade de blastocyste complètement expansé avec plusieurs recombinants parmi eux. Dans le même temps, plus de 90% des embryons non manipulés atteignent le même stade de blastocyste dans une culture parallèle. Suivez l’étape 2.6-2.9 pour le dépistage du blastcyste qui n’est pas essentiel mais peut être fait si vous préférez quantifier le taux de réussite du HDR.
6. Prélever individuellement les blastocystes précoces à complètement expansés avec 2 μL de milieu de culture à l’aide d’une pointe de pipette fine bouchée bouchée avec un micropipetter dans des tubes PCR simples (jour 8; Vidéo 2).
7. Lyser les blastocystes dans 8 μL de mélange de digestion (identique à l’étape 3.2; voir tableau des matériaux) et traiter à 75 °C pendant 10 min, 95 °C pendant 5 min, puis refroidir à 4 °C pour le stockage. Utilisez 2 μL de lysat comme modèle pour la PCR dans un mélange PCR total de 15 μL (étape 3).
8. Examiner l’efficacité du HDR par électrophorèse sur gel d’agarose¹⁷ des échantillons PCR après digestion de restriction avec NlaIII (étape 3-5).
9. Confirmer l’état de la recombinaison ciblée en séquençant l’amplicon^{17 de} 668 pb chez les fondateurs et la descendance subséquente pour confirmer l’intégrité de la mutation.

3. Extraction de l’ADN

REMARQUE: Des souris au jour postnatal 10 ont été utilisées pour cette expérience en raison de la mort subite de la souris knock-out GJA1-20k environ 2 à 4 semaines après la naissance⁴. Un protocole plus général peut également être appliqué à la suite du rapport¹⁸ publié précédemment.

1. Coupez 1 à 3 mm de l’extrémité de l’orteil ou de la queue avec des ciseaux propres et transférez-le dans un tube PCR à 8 bandes de 0,2 mL. Pour éviter la contamination parmi les échantillons d’orteils ou de queue, utilisez des ciseaux pré-nettoyés ou une lame par souris ou nettoyez avant chaque échantillon en utilisant 70% d’éthanol ou 10% d’eau de Javel. Si la queue saigne après l’échantillonnage, appliquez une brève pression avec de la gaze pour arrêter le saignement. Conservez les échantillons de queue à -20 °C jusqu’à l’extraction jusqu’à environ une semaine.
2. Ajouter la solution de lyse tissulaire (voir tableau des matériaux) dans un tube de 100 μL et bien mélanger, puis faire tourner avec une mini-centrifugeuse de table (2 200 x g pendant 10 s à température ambiante). Assurez-vous que les échantillons de queue sont immergés dans la solution.
3. Réglez les tubes sur un cycleur thermique réglé par le programme suivant; 75 °C pendant 10 min (lyse tissulaire), 95 °C pendant 5 min (inactivation) et 4 °C (maintien). Conservez le lysat tissulaire à 4 °C jusqu’à une semaine si les PCR ne peuvent pas être effectuées immédiatement.

4. Amplification de l’ADN par PCR

1. Préparer une solution PCR contenant 5 μL de_H2O sans nucléase, 0,75 μL d’amorces avant et arrière de 10 μM et 7,5 μL de mélange maître PCR (voir tableau des matériaux) par échantillon dans un nouveau tube PCR (voir tableau des séquences d’amorce). S’il y a plusieurs échantillons, mettez à l’échelle le contenu jusqu’à aliquote 14 μL par tube.
2. Ajouter 1 μL de lysat tissulaire à la solution PCR préparée à l’étape 3.1. Veillez à ne pas toucher la queue.
3. Bien mélanger et tourner avec une mini-centrifugeuse de table (2 200 x g pendant 10 s à température ambiante).
4. Réglez les tubes sur un cycleur thermique réglé par le programme mentionné ci-dessous. Conservez les produits PCR à 4 °C pendant 1 à 2 mois ou environ 1 an à -20 °C.
   REMARQUE : 95 °C pendant 3 min (étape 1, Dénaturation initiale), 95 °C pendant 15 s (étape 2, Dénaturation), 60 °C pendant 15 s (étape 2, Recuit), 72 °C pendant 45 s (étape 2, Extension), répéter l’étape 2 pendant 35 cycles, 72 °C pendant 10 min (étape 3, Extension finale) et 4 °C (étape 4, Maintien).

5. Incubation avec enzyme de restriction

1. Préparer la solution enzymatique contenant 7 μL de_H2Osans nucléase, 2 μL de tampon CutSmart 10x et 1 μL d’enzyme de restriction NlaIII (voir tableau des matériaux). S’il y a plusieurs échantillons, multipliez chaque contenu pour obtenir le mélange et aliquote 10 μL par tube.
2. Ajouter 10 μL de produit PCR obtenu à l’étape 3 à la solution enzymatique par tube.
3. Bien mélanger et tourner avec une mini-centrifugeuse de table (2 200 x g pendant 10 s à température ambiante).
4. Réglez les tubes sur un cycleur thermique ou un bloc thermique réglé par le programme mentionné ci-dessous. Conserver le produit après l’incubation à 4 °C pendant 1-2 mois ou ~1 an à -20 °C.
   NOTE: 37 °C pendant 16 h (au moins 2 h; un temps d’incubation court peut entraîner un clivage insuffisant) et 4 °C pour la détention.

6. Détection de la bande d’ADN

1. Préparez un gel d’agarose à 1,5% contenant une tache de gel d’ADN pour l’électrophorèse.
   1. Ajouter 0,75 g d’agarose dans 50 mL de tampon TAE 1x, puis mélanger et chauffer au micro-ondes jusqu’à ce que l’agarose se dissolve complètement. Après refroidissement, ajouter 5 μL de tache d’ADN et mélanger doucement.
   2. Verser dans le moule en gel (25 mL par moule) et laisser le gel se solidifier. Pour obtenir une meilleure résolution et séparation, augmentez la concentration d’agarose à 2,5% -4% au besoin.
2. Chargez 10 μL de produit PCR digéré dans le puits. Mélangez 6x tampon de chargement, si nécessaire.
3. Faites fonctionner le gel avec 100 V pendant 35 min.
   REMARQUE : Ces paramètres peuvent nécessiter une optimisation.
4. Image sous lumière UV (longueur d’onde de 302 nm).

Résultats

Le système d’édition de gènes CRISPR/Cas9 produit une mutation ATG en TTA et une mutation silencieuse TCC en TCG à 56 264 279 à 56 264 281 et à 56 264 291 à 56 264 293 sur le chromosome 10 de la souris, ou à 869 à 871 et 881 à 883 sur l’ARNm Gja1, respectivement. Ces mutations entraînent une mutation de la méthionine 213 à la leucine (M213L) sur la protéine GJA1 et la mutation TTC en TTG perturbe une séquence PAM voisine pour éviter une édition génétique indésirable (Figure 1<...

Discussion

Un modèle murin modifié par un gène est une approche courante pour comprendre la fonction des gènes. Cependant, étant donné que l’isoforme GJA1-20k traduite en interne est traduite à partir du même ARNm Gja1 que Cx43 pleine longueur, une stratégie créative a été conçue pour conserver l’expression Cx43 pleine longueur tout en supprimant l’expression GJA1-20k. L’approche est basée sur une mutation du codon de départ interne de GJA1-20k. Avec une mutation ponctuelle unique, M213 a été bascu...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL 8-Strip PCR tube	Thomas Scientific	1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575-038	For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027	For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer	Invitrogen	24710-030
96-well Thermal cycler	Applied Biosystems	Model # 9902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	mouse strain
Chemidoc MP imaging system	Bio-rad		To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein	MilliporeSigma	ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S	Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)	MilliporeSigma	23-073-425G
Hyaluronidase	MilliporeSigma	H3884-100MG
Image Lab software	Bio-rad		To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC	Zeiss	Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits	Roche Diagnostics	KK7352	For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM	LifeGlobal	ZEKS-050	embryo culture medium
Lab coart
M2 medium	MilliporeSigma	MR015D
NlaIII	New England Biolabs	R0125S	To digest PCR product
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937	To dilute reagents
Paraffin oil	Nacalai USA	2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip	FisherScientific	02-707-171	To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)	ProSpec-Tany	HOR-272
Sodium Chloride	Invitrogen	AM9760G	For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	To detect bands in gel
tracrRNA	Dharmacon	U-002000-120	Guid RNA