Eliminación de un sitio de inicio traslacional interno del ARNm mientras se conserva la expresión de la proteína de longitud completa

Resumen

El presente protocolo describe una única mutación M213L en Gja1 que conserva la generación completa de Connexin43 pero evita la traducción de la isoforma GJA1-20k traducida internamente más pequeña.

Resumen

El sistema de edición de genes CRISPR-Cas9, basado en mecanismos de reparación del genoma, permite la generación de modelos de ratón modificados genéticamente de forma más rápida y sencilla en relación con la recombinación homóloga tradicional. El sistema CRISPR-Cas9 es particularmente atractivo cuando se desea una mutación de un solo punto. La proteína de unión de brecha, Connexin 43 (Cx43), está codificada por el gen Gja1, que tiene un solo exón codificante y no se puede empalmar. Sin embargo, Gja1 produce no solo la proteína Cx43 de longitud completa, sino hasta seis isoformas truncadas N-terminales mediante un proceso conocido como traducción interna, el resultado de la iniciación de la traducción ribosómica en los sitios de inicio internos de AUG (metionina). GJA1-20k es la isoforma truncada más comúnmente generada de Cx43 iniciada en el codón AUG en la posición 213 del ARNm Gja1. Debido a que el residuo 213 ocurre al final del último dominio transmembrana de Cx43, GJA1-20k es efectivamente la cola C-terminal de 20 kDa de Cx43 como una proteína independiente. Investigadores anteriores identificaron, en células, que un papel crítico de GJA1-20k es facilitar el tráfico de hemicanales de unión de brecha Cx43 de longitud completa a la membrana plasmática. Para examinar este fenómeno in vivo, se generó un ratón mutante con una mutación puntual Gja1 que reemplaza el ATG (Metionina) en el residuo 213 por TTA (mutación Leucina, M213L). El resultado de M213L es que el ARNm de Gja1 y el Cx43 de longitud completa todavía se generan, pero la traducción de Gja1-20k se reduce significativamente. Este informe se centra en la elección del sitio de la enzima de restricción para desarrollar un modelo de ratón mutado en un aminoácido (^{Gja1 M213L / M213L}). Este protocolo describe ratones modificados genéticamente por el sistema CRISPR-Cas9 y el genotipado rápido mediante la combinación de PCR y tratamientos con enzimas de restricción.

Introducción

La conexina 43 (Cx43) de longitud completa y la isoforma truncada N-terminal, GJA1-20k, codificadas por el mismo ARNm GJA1, pero utilizan diferentes codones de inicio¹ para iniciar la traducción. La traducción de Cx43 se produce en el primer codón de inicio de AUG, mientras que la traducción de GJA1-20k se inicia en el AUG en el residuo 213. Anteriormente se encontró que GJA1-20k tiene funciones esenciales para el tráfico de Cx43 de longitud completa, la estabilización de la actina y la regulación de la morfología mitocondrial in vitro ^1,2,3.

Para comprender el papel de GJA1-20k in vivo, se generó un modelo de ratón GJA1-20k "knock-out" que conservó la capacidad de crear Cx43 de longitud completa. El enfoque consistió en utilizar el sistema CRISPR-Cas9 para sustituir el único residuo en 213 de una metionina (M) a una leucina (L) (Gja1^M213L/M213L)⁴. Una mutación interna de M a L disminuye drásticamente la probabilidad de que ocurra la traducción interna, pero conserva la traducción y la función de la proteína⁴ de longitud completa. Debido a que el tipo salvaje (WT) y el alelo mutado tienen tamaños idénticos y productos de ARNm casi idénticos, existe una dificultad considerable para confirmar el genotipo en los ratones. La secuenciación del ADN puede identificar la mutación, pero es demasiado costosa y requiere demasiado tiempo para el uso rutinario. En general, se han establecido varios métodos de genotipado más rápido, como la reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR), la minisecuenciación-ligadura, el análisis de fusión de alta resolución y el sistema de mutación refractaria de amplificación tetra-primer PCR (ARMS-PCR)5,6,7,8. Sin embargo, estos métodos alternativos requieren múltiples pasos, recursos únicos y / o varios conjuntos de cebadores específicos que pueden inducir productos de PCR no específicos.

Este protocolo introduce un enfoque detallado de selección y edición de genes por parte de CRISPR-Cas9 para crear una sola mutación de aminoácidos, y se presenta un genotipado rápido para confirmar la mutación. La identificación del genotipo implica el uso creativo de enzimas de restricción que utilizan solo un conjunto único de cebadores para identificar el gen objetivo. Se remite a los lectores a la Referencia⁴ para observar el profundo efecto electrofisiológico de la muerte súbita cardíaca causada por una mutación de sustitución^{Gja1 M213L / M213L} de un residuo que aún genera una proteína de longitud completa pero no genera una isoforma de truncamiento traducida internamente más pequeña. Este protocolo ayudará a que otros modelos de ratones utilicen una mutación puntual para disminuir la traducción interna de una isoforma de interés mientras conservan la expresión de la proteína endógena de longitud completa.

Protocolo

"Todos los protocolos de cuidado y estudio de animales fueron aprobados por los Comités Institucionales de Cuidado y Uso de Animales del Centro Médico Cedars-Sinai y la Universidad de Utah. Para los experimentos se utilizaron ratones hembra C57BL/6J obtenidos de fuentes comerciales a las 8-9 semanas de edad (ver Tabla de Materiales).

1. Preparación para la orientación genética

1. Seleccione la secuencia diana guía alrededor del sitio de mutación objetivo que codifica M213 utilizando el algoritmo web CRISPOR ^4,9,10 (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Se seleccionó una secuencia guía de 20 bases (ATTCAGAGCGAGAGACACCA), en la hebra opuesta a la secuencia codificante GJA1, con una puntuación MIT¹¹ de 62 en la que el sitio de escisión potencial se encuentra después de 16 bases aguas abajo del codón a mutar (ATG) (Figura 1; toda la secuencia de CRRNA se muestra en la Tabla 1).
2. Sintetizar el arncr y el arNtra que interactúan con Cas9 como ARN^{guía 12}.
   NOTA: Aunque la puntuación del MIT del ARN guía es de 62, solo hay una posible mutación fuera del objetivo con cuatro desajustes a más de 12 bases del PAM. Por lo tanto, esta guía de ARN se considera segura.
3. Diseñar un oligo donante complementario a la secuencia guía para introducir una única sustitución de aminoácidos (ATG a TTA; M213L) con brazos de homología de 60 y 48 bases en los lados 5' y 3', respectivamente.
   NOTA: Este oligo donante incluye una mutación puntual para la interrupción del PAM (AGG a ACG) mediante la introducción de una mutación silenciosa (TCC a TCG; S217S) para evitar la reedición después de la reparación dirigida por homología CRISPR (HDR)¹³ para la introducción de las mutaciones previstas (Figura 1 y Tabla 1).
4. Use NaCl (concentración final de 200 mM) para precipitar 10 μg de oligos para minimizar el arrastre de sal al tampón de microinyección pronuclear (10 mM de Tris-HCl, pH 7.5; 0.1 mM de EDTA y 100 mM de NaCl sin espermina y espermidina¹⁴).
   NOTA: No lave el pellet de ADN con etanol al 70%, ya que el pellet se puede disolver en la solución.
5. Mezclar 50 ng/μL de oligo donante, 60 ng/μL de mezcla de arncr/artracrRNA (relación molar 1:1) (a partir del paso 1.2) y 50 ng/μL de proteína eSpCas9 (ver Tabla de Materiales) para hacer mezcla CRISPR en volumen final 20 μL (Tabla 2). Disminuir la concentración del oligo donante si se observa una alta toxicidad (por ejemplo, 25 ng/μL).

2. Inducción de superovulación, recolección de huevos, microinyección pronuclear de mezcla CRISPR y detección de blastocistos

NOTA: Este procedimiento sigue un protocolo general¹⁴ publicado anteriormente.

1. Inyecte 5 UI de PMSG (gonadotropina sérica de yegua preñada) (ver Tabla de materiales) en 100 μL de agua estéril a 5-10 ratones a las 8 semanas de edad mediante un enfoque intraperitoneal aproximadamente a las 3:00 p.m. (día 1).
2. Inyectar 5 UI de hCG (gonadotropina coriónica humana) (ver Tabla de Materiales) en 100 μL de agua estéril a las donantes de óvulos mediante un enfoque intraperitoneal 46-48 h después de la inyección de PMSG (día 3). Establezca la cría 1: 1 con machos de sementales.
3. Cosechar los huevos fertilizados en medio M2 con hialuronidasa, lavar tres veces en 100 μL de medio M2 alrededor de las 10:00 a.m., luego mantener en medio mWM¹⁵ o KSOM¹⁶ (día 4) (ver Tabla de Materiales).
4. Introducir la mezcla CRISPR (paso 1.3) en embriones en etapa de 1 célula cosechados de los ratones por microinyección pronuclear¹⁴ en 100 μL de M2 cubiertos con aceite de parafina en un plato de plástico en un microscopio invertido con una óptica que mejora el contraste a primera hora de la tarde (Video 1).
   NOTA: La microinyección pronuclear de la mezcla CRISPR se realizó en embriones en etapa de 1 célula a las 14-16 h postcoitum (p.c.). Los embriones inyectados se cultivaron en una incubadora de CO_{2 al} 5% durante unas horas y se transfirieron quirúrgicamente a las 18-20 h p.c. en ratones ICR receptores que tenían un tapón de cópula en la misma mañana.
5. Transfiera 20-30 embriones de 2 células a cada receptor para producir animales recombinantes.
   NOTA: Siga el protocolo general¹⁴ o cultive esos embriones en medio mWM o KSOM durante 4 días para validar la eficiencia y examinar la toxicidad. La toxicidad de la mezcla CRISPR es aceptable cuando al menos un tercio de los embriones inyectados alcanzan temprano la etapa de blastocisto completamente expandido con múltiples recombinantes entre ellos. Al mismo tiempo, más del 90% de los embriones no manipulados alcanzan la misma etapa de blastocisto en un cultivo paralelo. Siga el paso 2.6-2.9 para la detección de blastocitos, que no es esencial, pero se puede hacer si se prefiere cuantificar la tasa de éxito de HDR.
6. Recoger individualmente blastocistos tempranos a completamente expandidos con 2 μL de medio de cultivo utilizando una punta de pipeta fina tapada con un micropipetador en tubos de PCR individuales (día 8; Vídeo 2).
7. Lise blastocistos en 8 μL de mezcla de digestión (igual que el paso 3.2; ver Tabla de Materiales) y procese a 75 °C durante 10 min, 95 °C durante 5 min, luego enfríe hasta 4 °C para su almacenamiento. Utilice 2 μL del lisado como plantilla para pcr en una mezcla total de PCR de 15 μL (paso 3).
8. Examinar la eficacia del HDR mediante electroforesis en gel de agarosa¹⁷ de las muestras de PCR después de la digestión de restricción con NlaIII (paso 3-5).
9. Confirme el estado de la recombinación dirigida secuenciando el amplicón¹⁷ de 668 pb en los fundadores y la progenie posterior para confirmar la integridad de la mutación.

3. Extracción de ADN

NOTA: Los ratones en el día postnatal 10 se utilizaron para este experimento debido a la muerte súbita del ratón knock-out GJA1-20k alrededor de 2-4 semanas después del nacimiento⁴. También se puede aplicar un protocolo más general después del informe¹⁸ publicado anteriormente.

1. Corte 1-3 mm de la punta del dedo del pie o la punta de la cola con tijeras limpias y transfiéralo a un tubo de PCR de 0,2 ml y 8 tiras. Para evitar la contaminación entre las muestras del dedo del pie o la cola, use tijeras prelimpiadas o una cuchilla por ratón o limpie antes de cada muestra con etanol al 70% o blanqueador al 10%. Si la cola sangra después del muestreo, aplique una breve presión con una gasa para detener la hemorragia. Guarde las muestras de cola a -20 °C hasta la extracción durante aproximadamente una semana.
2. Añadir solución de lisis tisular (ver Tabla de Materiales) en un tubo de 100 μL y mezclar bien, seguido de spin-down con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente). Asegúrese de que las muestras de cola estén sumergidas en la solución.
3. Coloque los tubos en un termociclador establecido por el siguiente programa; 75 °C durante 10 min (lisis tisular), 95 °C durante 5 min (inactivación) y 4 °C (retención). Guarde el lisado tisular a 4 °C durante un máximo de una semana si las PCR no se pueden realizar inmediatamente.

4. Amplificación del ADN por PCR

1. Preparar una solución de PCR que contenga 5 μL de H₂O libre de nucleasa, 0,75 μL de imprimaciones de 10 μM hacia adelante y hacia atrás, y 7,5 μL de mezcla maestra de PCR (ver Tabla de Materiales) por muestra en un nuevo tubo de PCR (ver Tabla 1 para secuencias de imprimación). Si hay varias muestras, escalar el contenido a alícuota de 14 μL por tubo.
2. Añadir 1 μL de lisado tisular a la solución de PCR preparada en el paso 3.1. Tenga cuidado de no tocar la cola.
3. Mezclar bien y girar hacia abajo con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente).
4. Coloque los tubos en un termociclador establecido por el programa mencionado a continuación. Guarde los productos de PCR a 4 °C durante 1-2 meses o ~1 año a -20 °C.
   NOTA: 95 °C durante 3 min (paso 1, desnaturalización inicial), 95 °C durante 15 s (paso 2, Desnaturalización), 60 °C durante 15 s (paso 2, Recocido), 72 °C durante 45 s (paso 2, Extensión), repita el paso 2 durante 35 ciclos, 72 °C durante 10 min (paso 3, Extensión final) y 4 °C (paso 4, Retención).

5. Incubación con enzima de restricción

1. Preparar la solución enzimática que contiene 7 μL de H₂O libre de nucleasa, 2 μL de tampón CutSmart 10x y 1 μL de enzima de restricción NlaIII (ver Tabla de Materiales). Si hay varias muestras, multiplique cada contenido para hacer la mezcla y alícuota 10 μL por tubo.
2. Añadir 10 μL de producto de PCR obtenido en el paso 3 a la solución enzimática por tubo.
3. Mezclar bien y girar hacia abajo con una minicentrífuga de mesa (2.200 x g durante 10 s a temperatura ambiente).
4. Coloque los tubos en un termociclador o bloque de calor establecido por el programa mencionado a continuación. Almacene el producto después de la incubación a 4 °C durante 1-2 meses o ~1 año a -20 °C.
   NOTA: 37 °C durante 16 h (al menos 2 h; el corto tiempo de incubación puede resultar en una escisión insuficiente) y 4 °C para la explotación.

6. Detección de banda de ADN

1. Prepare un gel de agarosa al 1,5% que contenga tinción de gel de ADN para la electroforesis.
   1. Agregue 0.75 g de agarosa en 50 ml de tampón 1x TAE seguido de mezcla y calor en microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. Después de enfriar, agregue 5 μL de tinción de ADN y mezcle suavemente.
   2. Vierta en el molde de gel (25 ml por molde) y permita que el gel se solidifique. Para obtener una mejor resolución y separación, aumente la concentración de agarosa a 2.5% -4% según sea necesario.
2. Cargue 10 μL de producto de PCR digerido en el pozo. Mezcle 6x búfer de carga, si es necesario.
3. Pasar el gel con 100 V durante 35 min.
   NOTA: Estos parámetros pueden necesitar optimización.
4. Imagen bajo luz UV (longitud de onda de 302 nm).

Resultados

El sistema de edición de genes CRISPR/Cas9 produce una mutación ATG a TTA y una mutación silenciosa de TCC a TCG en 56.264.279 a 56.264.281 y en 56.264.291 a 56.264.293 en el cromosoma 10 del ratón, o en 869 a 871 y 881 a 883 en el ARNm de Gja1, respectivamente. Esas mutaciones dan como resultado una mutación de metionina 213 a leucina (M213L) en la proteína GJA1 y la mutación TTC a TTG interrumpe una secuencia PAM cercana para evitar la edición no deseada del gen (Figura 1). Los det...

Discusión

Un modelo de ratón modificado genéticamente es un enfoque común para comprender la función del gen. Sin embargo, dado que la isoforma traducida internamente GJA1-20k se traduce del mismo ARNm Gja1 que cx43 de longitud completa, se ideó una estrategia creativa para retener la expresión de Cx43 de longitud completa y suprimir la expresión de GJA1-20k. El enfoque se basa en una mutación del codón de inicio interno de GJA1-20k. Con una mutación de un solo punto, M213 se cambió a L en el ARNm de Gja1

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.2 mL 8-Strip PCR tube	Thomas Scientific	1148A28
0.5 M EDTA pH 8.0	Invitrogen	15575-038	For pronuclear micorinjection buffer
10x CutSmart buffer	New England Biolabs	B7204S	Digestion buffer for NlaIII
1 M Tris-HCl pH 7.5	Invitrogen	15567-027	For pronuclear micorinjection buffer
50x TAE Buffer	Invitrogen	24710-030
96-well Thermal cycler	Applied Biosystems	Model # 9902
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
C57BL/6J	The Jackson Laboratory	664	mouse strain
Chemidoc MP imaging system	Bio-rad		To take gel image by 302 nm UV light
eSpCas9 protein	MilliporeSigma	ESPCAS9PRO-50UG
Gel Lading Dye Purple (6x)	New England Biolabs	B7024S	Loading buffer for electrophoresis
Gloves
hCG (human chorionic gonadotropin)	MilliporeSigma	23-073-425G
Hyaluronidase	MilliporeSigma	H3884-100MG
Image Lab software	Bio-rad		To analyze gel image
Inverted stereo microscope whit plasDIC	Zeiss	Axiovert A1
KAPA Mouse Genotyping Kits	Roche Diagnostics	KK7352	For tissue or cell lysis, DNA extraction, and PCR master mix
KSOM	LifeGlobal	ZEKS-050	embryo culture medium
Lab coart
M2 medium	MilliporeSigma	MR015D
NlaIII	New England Biolabs	R0125S	To digest PCR product
Nuclease-Free Water	Ambion	AM9937	To dilute reagents
Paraffin oil	Nacalai USA	2613785
Plugged 20 μL fine pipette tip	FisherScientific	02-707-171	To pick up blastocytes
PMSG (pregnant mare’s serum gonadotropin)	ProSpec-Tany	HOR-272
Sodium Chloride	Invitrogen	AM9760G	For pronuclear micorinjection buffer
SYBR safe DNA Gel Stain	Invitrogen	S33102	To detect bands in gel
tracrRNA	Dharmacon	U-002000-120	Guid RNA