共聚焦显微镜测量肾上腺嗜铬细胞融合孔隙动力学的三种模式

摘要

该协议描述了一种共聚焦成像技术，用于检测牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。这些融合模式包括1）闭合融合（也称为亲吻和运行），涉及融合孔隙开放和闭合，2）停留融合，涉及融合孔隙开放和维持开放孔，以及3）收缩融合，涉及融合囊泡收缩。

摘要

动态融合孔隙打开和闭合介导胞吐和内吞作用，并确定其动力学。在这里，详细展示了共聚焦显微镜如何与膜片钳记录结合使用，以检测原代培养牛肾上腺嗜铬细胞中的三种融合模式。三种融合模式包括1）紧密融合（也称为亲吻和运行），涉及融合孔隙开放和闭合，2）停留融合，涉及融合孔隙开放并保持开放孔，以及3）收缩融合，涉及融合产生的Ω形轮廓的收缩，直到它在质膜上完全合并。

为了检测这些融合模式，通过过表达mNeonGreen标记质膜，该蛋白与磷脂酶C δ（PH-mNG）的PH结构域连接，其与磷脂酰肌醇-4，5-二磷酸（PtdIns（4，5）P₂）在质膜的细胞质基质层面小叶处结合;囊泡加载荧光假神经递质FFN511以检测囊泡内容物的释放;并将Atto 655包含在浴液中以检测熔融孔隙闭合。在活嗜铬细胞中以每帧约20-90 ms的速度同时对这三种荧光探针进行成像，以检测融合孔隙开放，含量释放，融合孔闭合和融合囊泡尺寸变化。描述了分析方法以将三种融合模式与这些荧光测量区分开来。原则上，这里描述的方法可以应用于嗜铬细胞以外的许多分泌细胞。

引言

膜融合介导许多生物学功能，包括突触传递，血糖稳态，免疫反应和病毒进入^1，2，3。胞吐作用涉及质膜处的囊泡融合，释放神经递质和激素以实现许多重要功能，例如神经元网络活动。融合打开一个孔以释放囊泡内容物，之后孔隙可能关闭以取回融合的囊泡，这被称为亲吻和运行^1，4。不可逆和可逆的融合孔隙开口都可以通过细胞附着的电容记录与单个囊泡融合的融合孔隙电导记录来测量。

这通常被解释为反映全塌陷融合，涉及融合的扩张，直到融合囊泡变平，以及吻和运行，涉及融合孔隙的开放和闭合，分别为^5，6，^{7，8，9，10，11，12，13}.最近在染色质细胞中的共聚焦和受激辐射耗尽（STED）成像研究直接观察到融合孔隙开放和闭合（吻和运行，也称为紧密融合），融合孔隙开放，长时间保持具有开放孔隙的Ω形，称为停留融合，以及融合囊泡的收缩，直到它与质膜完全合并，这取代了完全塌陷融合，用于将融合囊泡与质膜合并^{4，8，14，15，16，17}.

在神经元中，已经通过成像检测到融合孔的开放和闭合，显示预装在大于融合孔的囊泡中的量子点的释放，并且在神经末梢释放面^5，18，19处具有融合孔导率测量。肾上腺嗜铬细胞被广泛用作研究外吞和内吞作用的模型^20，21。虽然嗜铬细胞含有大的致密核心囊泡，而突触含有小的突触囊泡，但嗜铬细胞和突触中的胞吐作用和内吞作用蛋白非常相似^{10，11，12，20，21，22，23}。

在这里，描述了一种使用共聚焦成像方法结合牛肾上腺嗜铬细胞电生理学来测量这三种融合模式的方法（图1）。该方法涉及将荧光假神经递质（FFN511）加载到囊泡中以检测胞吐作用;在浴液中加入Atto 655（A655）以填充融合产生的Ω形轮廓，并用磷脂酶C δ（PH）的PH结构域标记质膜，该结构域在质膜⁸，^15，24处与PtdIns（4^，5）P₂结合。聚变孔隙动力学可以通过不同荧光强度的变化来检测。虽然描述了嗜铬细胞，但这里描述的这种方法的原理可以广泛应用于许多分泌细胞，远远超出嗜铬细胞。

研究方案

注意:动物使用程序遵循NIH指南，并已获得NIH动物护理和使用委员会的批准。

1. 牛嗜铬细胞培养

1. 在嗜铬细胞培养前1天准备Locke的溶液（表1）和高压灭菌工具。
2. 在培养日从当地的屠宰场获取牛肾上腺，并在解剖前将它们浸没在冰冷的Locke溶液中。
   注意:肾上腺来自21-27个月大，健康，黑人安格斯，男女皆宜（主要是男性），体重约为1，400磅（约635公斤）。
3. 解剖前准备30mL（用于3个肾上腺）含有胶原酶P，胰蛋白酶抑制剂和牛血清白蛋白（表1）的新鲜酶溶液，并将其保存在室温下。
4. 选择3个完整的腺体，表面没有割伤或出血，并用剪刀去除脂肪组织（图1A）。用洛克的溶液灌注来清洗腺体，直到没有血液流出。为了实现这一点，使用30mL注射器通过肾上腺静脉充气腺（图1B），该注射器连接有0.22μm过滤器，根据需要多次²⁵。
   注意:通常需要大约150毫升的Locke溶液来清洗3个腺体。
5. 为了消化，使用30mL注射器通过肾上腺静脉注射酶溶液，该注射器与0.22μm过滤器连接，直到腺体开始膨胀。然后，将腺体在37°C下放置10分钟。再次注射并将腺体在37°C下再放置10分钟。
   注意:需要大约30毫升的酶溶液来消化3个腺体。
6. 消化后，用剪刀从静脉纵向切开腺体的另一端以展开腺体（图1C）。通过将白色延髓镊出到含有Locke溶液的10厘米培养皿中来分离延髓。
   注意:消化前后腺体内部的比较如图 1C所示。消化和髓质分离的细节先前报告了^23，25。
7. 用剪刀将延髓切成小块（图1D）。用80-100μm尼龙网过滤延髓悬浮液到烧杯中。然后将滤液转移到50mL锥形管中，在室温下以48× g离心3分钟，减速3。
   注意:延髓的切碎通常需要约10分钟。为了获得良好的细胞产量，切碎的碎片必须非常小，直到它们不能被镊子。
8. 离心后，除去上清液，并通过移液将细胞沉淀与Locke溶液重悬。用80-100μm过滤器过滤细胞悬浮液，并在室温下以48× g离心3分钟，减速为3。
9. 除去上清液并用30ml培养基重悬细胞沉淀（表1）。使用血细胞计数器计数室²⁵确定细胞数。

2. 电穿孔转染

1. 将2.8×10⁶ 个细胞转移到15 mL管中。通过以48× g 离心2分钟，以3的减速沉淀细胞。向细胞沉淀中加入100μL制造商提供的转染缓冲液（参见 材料表），然后加入2μgPH-mNG质粒。
   注意:PH-mNG质粒是通过用PH-EGFP¹⁵ 中的mNG替换增强的绿色荧光蛋白（EGFP）而产生的（参见 材料表）。
2. 通过上下移液溶液轻轻混合悬浮液，并将混合物转移到电穿孔比色皿中，无延迟（图1E）。立即将比色皿转移到电敏器（请参阅 材料表），在屏幕列表中选择O-005程序，然后按 Enter 键进行电穿孔。
   注意:准备细胞悬浮液以在细胞培养罩中转染。在混合步骤中，不要将气泡引入悬浮液中。立即继续执行下一步。
3. 电穿孔后，立即向比色皿中加入1.8 mL培养基，并与配备无菌尖端的微量滴注器轻轻混合。然后在每个培养皿中盖玻片（见 材料表）的顶部加入300μL电穿孔细胞的悬浮液，总共电镀5-6个培养皿进行一次电穿孔反应。
4. 小心地将培养皿转移到37°C的加湿培养箱中，用9%CO₂ 培养30分钟，并在30分钟后轻轻地向每个培养皿中加入2mL预热培养基。
5. 在实验前将转染的细胞在37°C的加湿培养箱中用9%CO₂ 保存2-3天。
   注意:培养的细胞将持续一周。最好在第2-3天使用培养的细胞。

3. 膜片钳记录和共聚焦成像的准备

注:该协议是使用激光扫描共聚焦显微镜和带电压钳位记录的膜片钳放大器以及用于电容记录的锁相放大器执行的。使用固定Z平面（XY / Z_固定 扫描）的XY平面共聚焦成像同时对所有三个荧光信号进行成像。Z平面聚焦在细胞底部，质膜附着在盖玻片上。

1. 在膜片钳和成像实验当天，在荧光显微镜下观察细胞。使用明场确保细胞培养物未被污染（图1F）和落射荧光以检查荧光标记蛋白的正确表达。
   注意:例如，PH-mNG在〜20-30%的细胞的质膜上表达。
2. 从硼硅酸盐玻璃毛细管准备贴片移液器。为此，请用移液器拉动移液器，用液体蜡涂覆其尖端，然后用微锻造对其进行抛光（参见 材料表）。
3. 打开膜片钳录音放大器并启动膜片钳录音软件（见 材料表）。在软件中设置钙电流和电容记录的适当参数（见 材料表）。
   1. 设置总共60秒持续时间的记录协议，其中刺激从10秒开始。
   2. 将电压钳位记录的保持电位设置为-80 mV。设置从 -80 mV 到 10 mV 的 1 s 去极化，作为诱导钙流入和电容跳跃的刺激。
   3. 对于电容测量，将正弦激励的频率设置为1，000-1，500 Hz的范围，峰峰值电压不超过50 mV。
4. 保存协议并创建一个新文件进行录制。
5. 打开共聚焦显微镜系统并在软件中设置适当的参数（参见 材料表）。
   1. 打开激光器，包括458 nm，514 nm和633 nm，并根据每个荧光探针设置每个激光器的发射收集范围，如下所示。FFN511:激发波长（EX），458 nm;发射波长（EM），468-500 nm。mNG: EX， 514 nm;EM， 524-560 nm.A655: EX， 633 nm;EM， 650-700 nm.
   2. 对 FFN511 和 mNG 使用顺序成像，以避免这两个探头之间的串扰。为图像记录设置1分钟持续时间的延时摄影（图1G）。

4. 膜片钳记录和共聚焦成像

1. 选择具有良好细胞状态和适当表达的培养皿，并向培养基中加入2μL荧光假神经递质FFN511（10mM储备，1:1，000工作溶液）。将培养皿放回培养箱中20分钟。或者，在步骤 3.2 后加载 FFN511，并在等待时执行步骤 3.3-3.5 以节省时间。
2. FFN511上样完成后，制备记录室，并将2μL荧光染料A655加入500μL浴液中（图2A 和 表1）。用镊子将盖玻片从培养皿转移到记录室（见 材料表），并立即加入含A655的浴液（图2B）。
   注意:A655保持在-20°C，浓度为10 mM，工作浓度为40 μM。
   注意:戴上手套，避免皮肤直接接触FFN511或A655。
3. 在100x油浸物镜上滴一滴油（折射率:1.518;参见 材料表）（数值孔径= 1.4）。将腔室安装在显微镜中，并使用调节旋钮使油刚好接触盖玻片的底部，然后将地丝尖端浸入浴槽溶液中（图2C，D）。
   注:选择适合在室温下工作的浸入式油。无需在低倍率和高倍率镜头之间切换。在记录过程中，室温保持在20-22°C左右。
4. 将细胞聚焦，并使用明场和共聚焦成像来找到具有mNG表达的良好细胞。放大所选单元格并将其调整到视图中心以最小化空白区域。
   注:荧光标记示意图如图 3A所示。一个好的细胞通常具有光滑的膜和干净的边缘（图3B）。通过落射荧光或共聚焦成像，良好的细胞似乎具有具有明亮mNG表达的大而平坦的底部（图3C）。
   像素大小为~50 nm，根据不同的像元大小和变焦系数，在~40-80 nm的范围内。
5. 在 FFN511、PH-mNG 和 A655 的固定 Z 平面（XY/Z_固定 扫描）上设置 XY 平面共聚焦成像的参数，并最大限度地缩短时间间隔。使用微调旋钮将焦点调整到单元格的底部。
   注意:PH-mNG在共聚焦XY平面交叉切口处（细胞底部除外）处发出细胞质膜轮廓的信号。在细胞膜底部附近，可以观察到A655斑点，其反映了Ω形或Λ形膜侵入。如果Z焦平面低于细胞底部，则所有荧光的强度将变弱。
6. 在软件中调整激发激光功率，找到一个设置，以获得最佳的信噪比，并避免明显的荧光漂白。为此，首先，对于在458 nm处激发的FFN511，从2.5 mW功率的初始测试值开始，对于在514 nm处激发的mNG，初始测试值为1 mW。对于用HeNe激光器在633nm处激发的A655，请使用高激光功率，〜12-15 mW（即最大值的70%-80%），在连续激发时，当其孔隙关闭时，可以漂白Ω形轮廓内的所有荧光A655。
   注意:如果激光功率太高，PH-mNG和FFN511荧光将被快速漂白。如果激光功率太低，信号将太弱或噪声太大，无法进行分析。
7. 将9μL内部溶液（表1）加入贴片移液器中，并将移液器连接到膜片钳放大器级中的支架上（参见 材料表）。
8. 用注射器施加少量正压，并移动移液器尖端以用显微操纵器触摸浴液溶液。通过电压脉冲测试，确保放大器显示移液器电阻约为2-4 MΩ。按 LJ/自动 取消液体液络部。
9. 使用显微操作器将移液器向所选细胞移动。要形成细胞附着模式，请移动移液器尖端以接触细胞（阻力将增加）;用注射器轻轻施加负压（电阻将增加到1 GΩ以上），将保持电位从0更改为-80 mV。
10. 一旦电阻超过1 GΩ，请等待~30秒，以使配置稳定下来。按 C-快速/自动 以补偿快速电容。
11. 要形成全电池模式，用注射器施加脉冲短而强大的负压以破坏膜（电流脉冲的形状随带电和放电膜电容器而变化）。按 C 慢/自动 以补偿慢速电容。
12. 稍微调整成像焦点以聚焦在细胞底部。通过同时单击两个不同软件应用程序中的"开始"按钮，同时 启动 共聚焦延时成像和膜片钳记录。
    注:共聚焦成像软件以~20-90 ms/帧的速率制作电影。膜片钳记录包括静息状态10秒，去极化刺激1秒，刺激后另外49秒。膜片钳配置允许记录钙电流、电容跳跃以及从 -80 至 +10 mV 的 1 s 去极化引起的衰减（图 3D）。
13. 录制完成后，请确保保存数据。将保持电位改回0 mV。将移液器移出浴液并丢弃。
14. 重复步骤4.7-4.13以记录培养皿中的另一个细胞。记录1小时后，换到另一个盘子进行记录。
    注意:记录1小时后，膜片钳记录的成功率显着降低。为了提高数据收集的效率，建议每道菜仅记录1小时。

5. 膜片钳数据分析

1. 打开适当的软件（见 材料表）进行数据分析。点击 PPT|加载脉冲文件|用于 加载.dat文件的文件按钮。单击 "执行" ，四条迹线将自动绘制在一个图形中，包括钙电流和电容迹线。
2. 单击 窗口|新建"图形 "按钮，选择Pulse_1_1_1，即 Y Wave 中的第一波，然后单击" 执行 "以绘制钙电流图。单击 窗口|新建"表 "按钮，选择Pulse_1_1_1，然后单击" 执行 "以显示钙电流的原始数据，这些数据可用于绘制多个细胞的平均迹线。
3. 在钙电流图中相应地绘制一个正方形， 右键单击 并 展开 电流信号以包括基线和钙电流峰值。点击 图表|"显示信息" 以显示光标 A 和 B，并分别将它们移动到基线和峰值。图形信息将显示在底部，并且可以估计参数。
4. 重复步骤5.2，但选择Pulse_1_1_1_Cm，即Y波中的第二波，以绘制电容迹线。重复步骤5.3，将A和B光标放在适当的位置，以测量电容参数，如基线、振幅和衰减率。
5. 将步骤5.2中的原始数据复制到电子表格中，计算一组记录的细胞的平均值和标准误差，并在适当的软件中绘制钙电流和膜电容的平均痕量（图3E）。

6. 共聚焦成像数据分析

1. 使用制造商提供的任何软件打开原始映像文件（请参阅 材料表）。
   注意:其他一些免费程序，如ImageJ或Fiji，可用于数据处理和量化第4节中获得的图像。
2. 单击" 进程|"ProcessTools 并使用工具为每个延时图像生成滚动平均值（例如，每4个图像的滚动平均值）文件并保存这些文件。
   注意:在滚动平均值之后，可以对亮度和背景进行适当的调整，以更好地显示三个通道的荧光变化，这可能有助于识别聚变事件。在没有聚变事件的某些区域检查荧光强度可能有助于区分聚变事件的荧光信号和背景信号。
3. 单击量化|按钮 工具|堆栈配置文件，检查刺激前后的时间点，以识别每个通道中的荧光变化。单击 绘制椭圆 按钮以圈出融合事件的感兴趣区域 （ROI）。 右键单击 图像，然后单击 保存 ROI 以保存 ROI。
   注意:ROI的大小，涵盖所有三个荧光信号，与嗜铬细胞²⁴中的囊泡大小相似。使用原始数据进行分析，同时提供增加信噪比的滚动平均数据，以清楚地显示三个信号。
4. 单击 "打开项目 "找到原始文件， 右键单击 图像，然后单击" 加载 ROI "以在原始成像文件中加载 ROI 文件以测量荧光强度。
   注意:原始荧光信号将用于绘制不同通道的迹线。对于每个ROI，基线被定义为刺激前的强度，强度迹线可以归一化为基线。
5. 单击 "工具"|在软件中对投资回报率进行排序 ，并绘制每个投资回报率所有三个通道的迹线。单击" 报告 "将 ROI 数据（包括数字数据和每个 ROI 的成像跟踪）保存到文件夹中。
   1. 通过PH-mNG（F_PH）和A655（F 655_）点荧光（在单个帧内）强度的同时增加来识别融合事件，同时FFN511点荧光（F_FFN）的降低。
   2. 寻找F_PH 和F₆₅₅的外观，这表明由于融合产生的Ω轮廓而形成PH-mNG / A655斑点，允许PH-mNG从质膜扩散，A655从浴中持续扩散。
   3. 寻找_FFN 降低，这表明其由于融合孔隙张开而从囊泡中释放出来，并排除了 F_PH 和 F₆₅₅ 外观可能由内吞作用引起的膜内侵的可能性。
   4. 检查显示细胞底部发生的融合事件的延时XY / Z_固定 图像。分析融合事件的三种模式:1）紧密融合，2）停留融合，3）收缩融合。
      注:在去极化之前很少观察到聚变事件，而在去极化之后可以观察到数十个聚变事件。融合后，Ω轮廓可能关闭其孔隙，保持其开放孔，或收缩以合并到质膜中。
      1. 为了识别紧密融合，请寻找调暗的F₆₅₅ ，因为融合孔闭合阻止了浴A655的交换，而F_PH 持续存在，反映了PtdIns（4，5）P₂ 持续转化为PtdIns（4）P，或者F_PH 延迟衰减，反映囊泡夹断（闭合融合， 图4A，B）。
      2. 寻找持续的F_PH 和F₆₅₅ 以确定停留融合（图4C）。
      3. 寻找F_PH 和F₆₅₅的平行下降，表明Ω轮廓收缩以确定收缩融合（图4D）。
         注:如果不确定事件类型，请检查原始映像文件以检查映像跟踪。在没有聚变事件的某些区域检查荧光强度可能有助于将聚变事件的荧光信号与背景信号区分开来。
6. 绘制以下三个通道的强度变化的代表性迹线:FFN511，PH-mNG和A655。量化每个单元中不同融合模式的百分比并绘制数字。

结果

按照图1和图2所示的实验程序，用PH-mNG转染来自牛肾上腺的嗜铬细胞以标记质膜;将A655加入到熔池溶液中以检测熔融孔隙闭合;并将荧光假神经递质FFN511加载到囊泡中以检测释放。接下来，在细胞底部（Z焦平面~细胞膜上方约100-200nm）每20-90 ms对FFN511，PH-mNG和A655进行XY平面共聚焦延时成像。进行全细胞膜片钳记录和应用从-80至+ 10 mV的1s去极化以唤起外吞和?...

讨论

描述了一种共聚焦显微成像方法，用于检测牛肾上腺嗜^铬细胞中融合孔隙和递质释放的动力学，以及三种融合模式，即紧密融合，停留融合和收缩融合4^，24。描述了一种电生理学方法，用于使细胞去极化，从而唤起外吞和内吞作用。系统共聚焦图像处理提供有关聚变和裂变事件的不同孔隙行为模式的信息。

同时监测具有全细胞结构...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187-500MG	ATP for preparing internal solution
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons	Lonza	VSPI-1003	Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette	Warner Instruments	64-0795	Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G	Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M	Quality Biological	351-130-721	Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm	Falcon	352360	Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041	Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P	Sigma	11213873001	Enzyme for gland digestion
Coverslip	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagent for preparing culture medium
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagent for preparing culture medium
FFN511	Abcam	ab120331	Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877-250MG	GTP for preparing internal solution
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software	Leica	LAS X software	Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope	Leica	Leica TCS SP5	Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid	Sigma	49449-100G	Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier	Heka	Lock-in	Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Counting chamber
Microforge	Narishige	MF-830	Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron	EIKO filtering co	03-100/32	Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP	Addgene	Plasmid #51407	Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97	Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride	Sigma	P5404-500G	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software	Heka	Pulse	Software for patch-clamp data collection
Recording chamber	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride	Sigma	S7653-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S8282-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate	Barnsted/Thermolyne	type 10100	Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride	Sigma	T2265-100G	TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor	Sigma	T9253-5G	Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid	Leica	195371-10-9	Leica confocal mounting oil