Microscopía confocal para medir tres modos de dinámica de poros de fusión en células cromafines suprarrenales

Resumen

Este protocolo describe una técnica de imagen confocal para detectar tres modos de fusión en células cromafines suprarrenales bovinas. Estos modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y el cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción de la vesícula fusionada.

Resumen

La apertura y el cierre dinámicos de los poros de fusión median la exocitosis y la endocitosis y determinan su cinética. Aquí, se demuestra en detalle cómo se utilizó la microscopía confocal en combinación con el registro de pinza de parche para detectar tres modos de fusión en células de cromafina suprarrenal bovina de cultivo primario. Los tres modos de fusión incluyen 1) fusión cerrada (también llamada kiss-and-run), que involucra la apertura y cierre del poro de fusión, 2) la fusión de permanencia, que involucra la apertura del poro de fusión y el mantenimiento del poro abierto, y 3) la fusión retráctil, que involucra la contracción del perfil en forma de Ω generado por la fusión hasta que se fusiona completamente en la membrana plasmática.

Para detectar estos modos de fusión, la membrana plasmática se marcó sobreexpresando mNeonGreen unido con el dominio PH de la fosfolipasa C δ (PH-mNG), que se une al fosfatidilinositol-4,5-bisfosfato (PtdIns(4,5)P₂) en la valva orientada al citosol de la membrana plasmática; las vesículas se cargaron con el falso neurotransmisor fluorescente FFN511 para detectar la liberación de contenido vesicular; y Atto 655 se incluyó en la solución de baño para detectar el cierre de poros de fusión. Estas tres sondas fluorescentes se tomaron imágenes simultáneamente a ~ 20-90 ms por cuadro en células cromafines vivas para detectar la apertura del poro de fusión, la liberación de contenido, el cierre del poro de fusión y la fusión de cambios en el tamaño de la vesícula. El método de análisis se describe para distinguir tres modos de fusión de estas mediciones de fluorescencia. El método descrito aquí puede, en principio, aplicarse a muchas células secretoras más allá de las células cromafines.

Introducción

La fusión de membrana media muchas funciones biológicas, incluida la transmisión sináptica, la homeostasis de la glucosa en sangre, la respuesta inmune y la entrada viral ^1,2,3. La exocitosis, que implica la fusión de vesículas en la membrana plasmática, libera neurotransmisores y hormonas para lograr muchas funciones importantes, como las actividades de la red neuronal. La fusión abre un poro para liberar contenido vesicular, después de lo cual el poro puede cerrarse para recuperar la vesícula fusionante, que se denomina kiss-and-run ^1,4. Tanto la apertura irreversible como reversible del poro de fusión se puede medir con grabaciones de capacitancia conectadas a células combinadas con grabaciones de conductancia de poro de fusión de fusión de una sola vesícula.

Esto a menudo se interpreta como un reflejo de la fusión de colapso completo, que implica la dilatación de la fusión hasta el aplanamiento de la vesícula fusionada, y el beso y la carrera, que implica la apertura y el cierre del poro de fusión, respectivamente ^{5,6,7,8,9,10,11,12,13} . Estudios recientes de imágenes de agotamiento por emisión confocal y estimulada (STED) en células cromafines observaron directamente la apertura y el cierre del poro de fusión (kiss-and-run, también llamado close-fusion), la apertura del poro de fusión que mantiene una forma de Ω con un poro abierto durante mucho tiempo, denominada fusión de permanencia y la reducción de la vesícula fusionante hasta que se fusiona completamente con la membrana plasmática, que reemplaza la fusión de colapso completo para fusionar las vesículas fusionadas con la membrana plasmática^4, 8,14,15,16,17.

En las neuronas, se han detectado apertura y cierre de poros de fusión con imágenes que muestran la liberación de puntos cuánticos precargados en vesículas que son más grandes que el poro de fusión y con mediciones de conductancia de poro de fusión en la cara de liberación de terminales nerviosos ^5,18,19. Las células cromafines suprarrenales son ampliamente utilizadas como modelo para el estudio de la exocitosis y la endocitosis^20,21. Aunque las células cromafines contienen grandes vesículas de núcleo denso, mientras que las sinapsis contienen pequeñas vesículas sinápticas, las proteínas de exocitosis y endocitosis en las células cromafines y sinapsis son bastante análogas 10,11,12,20,21,22,23.

Aquí, se describe un método para medir estos tres modos de fusión utilizando un método de imagen confocal combinado con electrofisiología en células de cromafin suprarrenal bovina (Figura 1). Este método consiste en la carga de falsos neurotransmisores fluorescentes (FFN511) en vesículas para detectar la exocitosis; adición de Atto 655 (A655) en la solución de baño para llenar el perfil en forma de Ω generado por fusión, y etiquetado de la membrana plasmática con el dominio PH de fosfolipasa C δ (PH), que se une a PtdIns(4,5)P₂ en la membrana plasmática ^8,15,24. La dinámica de los poros de fusión se puede detectar a través de cambios en diferentes intensidades fluorescentes. Aunque se describe para las células cromafines, el principio de este método descrito aquí se puede aplicar ampliamente a muchas células secretoras mucho más allá de las células cromafines.

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Protocolo

NOTA: El procedimiento de uso de animales siguió las pautas de los NIH y fue aprobado por el Comité de Cuidado y Uso de Animales de los NIH.

1. Cultivo de células de cromafina bovina

1. Preparar la solución de Locke (Tabla 1) y las herramientas de autoclave 1 día antes del cultivo celular de cromafines.
2. Obtenga glándulas suprarrenales bovinas de un matadero local el día del cultivo y manténgalas sumergidas en la solución helada de Locke antes de la disección.
   NOTA: Las glándulas suprarrenales son de 21-27 meses de edad, sanos, Angus negro de ambos sexos (principalmente hombres) con un peso corporal de alrededor de 1,400 libras (~ 635 kg).
3. Preparar 30 ml (para 3 glándulas suprarrenales) de solución enzimática fresca que contenga colagenasa P, inhibidor de tripsina y albúmina sérica bovina (Tabla 1) antes de la disección y mantenerla a temperatura ambiente.
4. Elija 3 glándulas intactas sin cortes ni sangrados en la superficie y retire el tejido graso con tijeras (Figura 1A). Lave las glándulas por perfusión con la solución de Locke hasta que no salga sangre. Para lograr esto, infle la glándula a través de la vena suprarrenal (Figura 1B) usando una jeringa de 30 ml conectada con un filtro de 0.22 μm tantas veces como sea necesario²⁵.
   NOTA: Por lo general, se necesitan aproximadamente 150 ml de solución de Locke para lavar 3 glándulas.
5. Para la digestión, inyecte la solución enzimática a través de la vena suprarrenal con una jeringa de 30 ml conectada con un filtro de 0,22 μm hasta que la glándula comience a hincharse. Luego, deje las glándulas a 37 ° C durante 10 min. Inyecte una vez más y deje las glándulas a 37 °C durante otros 10 min.
   NOTA: Se necesitan aproximadamente 30 ml de solución enzimática para digerir 3 glándulas.
6. Después de la digestión, corte la glándula longitudinalmente desde la vena hasta el otro extremo con tijeras para desplegar la glándula (Figura 1C). Aísle las médulas exprimiendo la médula blanca en una placa de Petri de 10 cm que contenga la solución de Locke.
   NOTA: La comparación del interior de la glándula antes y después de la digestión se muestra en la Figura 1C. Los detalles de la digestión y el aislamiento de las médulas se reportaron previamente^23,25.
7. Cortar y picar la médula en trozos pequeños con tijeras (Figura 1D). Filtre la suspensión de la médula con una malla de nylon de 80-100 μm en un vaso de precipitados. Luego transfiera el filtrado a un tubo cónico de 50 ml para centrifugación a 48 × g, temperatura ambiente, durante 3 min con desaceleración de 3.
   NOTA: El picado de las médulas generalmente toma ~ 10 min. Para obtener un buen rendimiento de las células, las piezas picadas deben ser muy pequeñas, hasta que no se puedan pinzar.
8. Después de la centrifugación, retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet de la celda con la solución de Locke mediante pipeteo. Filtre la suspensión celular con un colador de 80-100 μm, y centrífuga a 48 x g, temperatura ambiente, durante 3 min con desaceleración de 3.
9. Retirar el sobrenadante y volver a suspender el pellet celular con 30 ml de medio de cultivo (Tabla 1). Determine el número de celda utilizando cámaras de conteo hemacitómetro²⁵.

2. Transfección con electroporación

1. Transfiera 2,8 × 10⁶ células a un tubo de 15 ml. Pellet las células por centrifugación a 48 × g durante 2 min con desaceleración de 3. Agregue 100 μL de tampón de transfección (consulte la Tabla de materiales) proporcionado por el fabricante al pellet celular y luego agregue 2 μg del plásmido PH-mNG.
   NOTA: El plásmido PH-mNG se creó reemplazando la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) con mNG en PH-EGFP¹⁵ (consulte la Tabla de materiales).
2. Mezcle suavemente la suspensión canalizando la solución hacia arriba y hacia abajo, y transfiera la mezcla a una cubeta de electroporación sin demora (Figura 1E). Transfiera inmediatamente la cubeta al electroporador (consulte la Tabla de materiales), seleccione el programa O-005 en la lista de pantalla y presione Entrar para realizar la electroporación.
   NOTA: Prepare la suspensión celular para la transfección en una campana de cultivo celular. No introduzca burbujas de aire en la suspensión durante el paso de mezcla. Continúe con el siguiente paso sin demora.
3. Después de la electroporación, agregue 1,8 ml de medio inmediatamente a la cubeta y mezcle suavemente con un micropipetador equipado con una punta estéril. Luego agregue 300 μL de la suspensión de las celdas electroporadas en la parte superior de la cubierta (consulte la Tabla de materiales) en cada plato, chapando 5-6 platos en total para una reacción de electroporación.
4. Transfiera cuidadosamente los platos a una incubadora humidificada a 37 ° C con 9% de CO₂ durante 30 min, y agregue suavemente 2 ml de medio precalentado a cada plato después de 30 min.
5. Mantenga las células transfectadas en la incubadora humidificada a 37 °C con un 9% de CO₂ durante 2-3 días antes del experimento.
   NOTA: Las células cultivadas durarán una semana. Es mejor usar células cultivadas en los días 2-3.

3. Preparación para el registro de la pinza de parche y la imagen confocal

NOTA: Este protocolo se realizó con un microscopio confocal de barrido láser y un amplificador de abrazadera de parche con grabación de abrazadera de voltaje junto con un amplificador de bloqueo para la grabación de capacitancia. Se utilizó una imagen confocal del plano XY en un plano Z fijo (escaneo_fijo XY /Z) para obtener imágenes de las tres señales fluorescentes simultáneamente. El plano Z se centró en la parte inferior de la célula, donde la membrana plasmática se adhería a las cubiertas.

1. El día del experimento de pinza de parche e imágenes, observe las células bajo un microscopio de fluorescencia. Use brightfield para asegurarse de que el cultivo celular no esté contaminado (Figura 1F) y epifluorescencia para verificar la expresión adecuada de la proteína marcada con fluorescentes.
   NOTA: Por ejemplo, PH-mNG se expresa en la membrana plasmática de ~ 20-30% de las células.
2. Prepare pipetas de parche a partir de capilares de vidrio de borosilicato. Para hacer esto, tire de las pipetas con un extractor de pipetas, cubra sus puntas con cera líquida y límpielas con una microtorcha (consulte la Tabla de materiales).
3. Encienda el amplificador de grabación patch-clamp e inicie el software de grabación patch-clamp (consulte la Tabla de materiales). Establezca los parámetros apropiados para el registro de corriente de calcio y capacitancia en el software (consulte la Tabla de materiales).
   1. Establecer un protocolo de grabación de 60 s de duración en total, donde la estimulación comienza a los 10 s.
   2. Ajuste el potencial de retención para la grabación de la abrazadera de voltaje a -80 mV. Establezca una despolarización de 1 s de -80 mV a 10 mV como estímulo para inducir la afluencia de calcio y el salto de capacitancia.
   3. Para las mediciones de capacitancia, establezca la frecuencia del estímulo sinusoidal en un rango de 1,000-1,500 Hz con un voltaje de pico a pico de no más de 50 mV.
4. Guarde el protocolo y cree un nuevo archivo para grabar.
5. Encienda el sistema de microscopio confocal y establezca los parámetros apropiados en el software (consulte la Tabla de materiales).
   1. Encienda los láseres, incluidos 458 nm, 514 nm y 633 nm, y establezca el rango de recolección de emisiones para cada láser de acuerdo con cada sonda de fluorescencia como se indica a continuación. FFN511: longitud de onda de excitación (EX), 458 nm; longitud de onda de emisión (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
   2. Utilice imágenes secuenciales para FFN511 y mNG para evitar la diafonía entre estas dos sondas. Establezca un lapso de tiempo de 1 minuto de duración para la grabación de imágenes (Figura 1G).

4. Grabación con abrazadera de parche e imágenes confocales

1. Elija un plato con buen estado celular y expresión adecuada y agregue 2 μL de falso neurotransmisor fluorescente FFN511 (stock de 10 mM, solución de trabajo 1: 1,000) en el medio. Vuelva a poner el plato en la incubadora durante 20 minutos. Alternativamente, cargue FFN511 después del paso 3.2 y realice los pasos 3.3-3.5 mientras espera para ahorrar tiempo.
2. Una vez finalizada la carga FFN511, prepare la cámara de grabación y agregue 2 μL de colorante fluorescente A655 en 500 μL de la solución de baño (Figura 2A y Tabla 1). Transfiera el cubrehojas del plato a la cámara de grabación (consulte la Tabla de materiales) con pinzas e inmediatamente agregue la solución de baño que contiene A655 (Figura 2B).
   NOTA: El A655 se mantiene en -20 °C con una concentración de 10 mM y la concentración de trabajo es de 40 μM.
   PRECAUCIÓN: Use guantes para evitar el contacto directo de la piel con FFN511 o A655.
3. Coloque una gota de aceite (índice de refracción: 1.518; consulte la Tabla de materiales) en el objetivo de inmersión de aceite 100x (apertura numérica = 1.4). Monte la cámara en el microscopio y use la perilla de ajuste para hacer que el aceite entre en contacto con la parte inferior de la cubierta, luego sumerja la punta del cable de tierra en la solución del baño (Figura 2C, D).
   NOTA: Elija un aceite de inmersión apropiado para trabajar a temperatura ambiente. Cambiar entre la lente de bajo y alto aumento es innecesario. La temperatura ambiente se mantiene alrededor de 20-22 ° C durante el registro.
4. Enfoca las células y usa imágenes de campo brillante y confocales para encontrar una buena célula con expresión de mNG. Amplíe la celda seleccionada y ajústela al centro de la vista para minimizar las regiones en blanco.
   NOTA: El dibujo esquemático del etiquetado de fluorescencia se muestra en la Figura 3A. Una buena célula generalmente tiene una membrana lisa y un borde limpio (Figura 3B). Con epifluorescencia o imágenes confocales, una buena célula parece tener un fondo grande y plano con expresión de mNG brillante (Figura 3C).
   El tamaño del píxel es de ~ 50 nm, dentro de un rango de ~ 40-80 nm de acuerdo con diferentes tamaños de celda y factor de zoom.
5. Configure los parámetros para la obtención de imágenes confocales del plano XY en un plano Z fijo (escaneo_fijo XY/Z) de FFN511, PH-mNG y A655, con un intervalo de tiempo minimizado. Ajuste el enfoque a la parte inferior de la celda con la perilla de ajuste fino.
   NOTA: PH-mNG señala el contorno de la membrana plasmática celular en la sección transversal confocal del plano XY (excepto la parte inferior de la célula). Cerca del fondo de la membrana celular, se pueden observar manchas A655, que reflejan invaginaciones de membrana en forma de Ω o forma de Λ. Si el plano focal Z es más bajo que el fondo de la célula, la intensidad de toda la fluorescencia se debilitará.
6. Ajuste la potencia del láser de excitación en el software para encontrar una configuración para obtener la mejor relación señal-ruido y evitar un blanqueamiento significativo de la fluorescencia. Para hacerlo, comience con un valor de prueba inicial de 2.5 mW de potencia para FFN511 excitado a 458 nm y 1 mW para mNG excitado a 514 nm. Para A655 excitado a 633 nm con un láser HeNe, use alta potencia láser, ~ 12-15 mW (es decir, 70% -80% del máximo), que, tras la excitación continua, puede blanquear todo el A655 fluorescente dentro de un perfil en forma de Ω cuando su poro está cerrado.
   NOTA: Si la potencia del láser es demasiado alta, la fluorescencia PH-mNG y FFN511 se blanqueará rápidamente. Si la potencia del láser es demasiado baja, las señales serán demasiado débiles o ruidosas para ser analizadas.
7. Añadir 9 μL de solución interna (Tabla 1) en una pipeta de parche y conectar la pipeta al soporte en la etapa del amplificador de abrazadera de parche (consulte la Tabla de materiales).
8. Aplique una pequeña cantidad de presión positiva con una jeringa y mueva la punta de la pipeta para tocar la solución de baño con un micromanipulador. Asegúrese de que el amplificador muestre que la resistencia de la pipeta es de ~ 2-4 MΩ con una prueba de pulso de voltaje. Pulse LJ/Auto para cancelar la unión líquida.
9. Mueva la pipeta hacia la celda seleccionada con el micromanipulador. Para formar un modo conectado a la celda, mueva la punta de la pipeta para tocar la celda (la resistencia aumentará); aplicando presión negativa suavemente con la jeringa (la resistencia aumentará a más de 1 GΩ), cambie el potencial de sujeción de 0 a -80 mV.
10. Una vez que la resistencia pase 1 GΩ, espere ~ 30 s para que la configuración se estabilice. Presione C-fast/Auto para compensar la capacitancia rápida.
11. Para formar un modo de celda completa, aplique presión negativa pulsada corta pero potente con la jeringa para romper la membrana (la forma del pulso actual cambia con un condensador de membrana cargado y descargado). Presione C-slow/Auto para compensar la capacitancia lenta.
12. Ajuste ligeramente el enfoque de la imagen para enfocar la parte inferior de la célula. Inicie simultáneamente la grabación simultánea de imágenes de lapso de tiempo confocal y de abrazadera de parches haciendo clic en los botones Inicio en las dos aplicaciones de software diferentes.
    NOTA: El software de imágenes confocales hace una película a una velocidad de ~ 20-90 ms / fotograma. El registro de la pinza de parche incluye el estado de reposo durante 10 s, la estimulación de despolarización de 1 s y 49 s adicionales después de la estimulación. La configuración de la abrazadera de parche permite registrar la corriente de calcio, el salto de capacitancia y la desintegración inducida por la despolarización de 1 s de -80 a +10 mV (Figura 3D).
13. Una vez finalizada la grabación, asegúrese de que los datos estén guardados. Cambie el potencial de retención a 0 mV. Retire la pipeta de la solución de baño y deséchela.
14. Repita los pasos 4.7-4.13 para grabar otra celda en el plato. Después de 1 h de grabación, cambie a otro plato para grabar.
    NOTA: Después de 1 h de grabación, la tasa de éxito de la grabación con abrazadera de parche disminuye significativamente. Para aumentar la eficiencia de la recopilación de datos, se recomienda registrar solo 1 h en cada plato.

5. Análisis de datos patch-clamp

1. Abra el software apropiado (consulte la Tabla de materiales) para el análisis de datos. Haga clic en el | PPT Cargar | de archivos PULSE Botones de archivo para cargar el archivo .dat. Haga clic en Hacerlo y se trazarán cuatro trazas en un gráfico automáticamente, incluidas las trazas de corriente de calcio y capacitancia.
2. Haga clic en el | Windows Botones Nuevo gráfico , elija el Pulse_1_1_1, la primera onda en la(s) onda(s) Y y haga clic en Hacerlo para trazar el gráfico de corriente de calcio. Haga clic en el | Windows Nuevos botones tabla, elija el Pulse_1_1_1 y haga clic en Hacerlo para mostrar los datos sin procesar de la corriente de calcio, que podría usarse para trazar el rastro promediado de varias celdas.
3. Dibuje un cuadrado en consecuencia en el gráfico de corriente de calcio, haga clic con el botón derecho y expanda la señal de corriente para incluir la línea de base y el pico de corriente de calcio. Haga clic en gráfico | Mostrar información para mostrar los cursores A y B y moverlos a la línea base y al pico respectivamente. La información del gráfico se mostrará en la parte inferior y se pueden estimar los parámetros.
4. Repita el paso 5.2, pero elija el Pulse_1_1_1_Cm, la segunda onda en Y Wave(s), para trazar el trazado de capacitancia. Repita el paso 5.3 y coloque los cursores A y B en la posición adecuada para medir los parámetros de capacitancia, como la línea de base, la amplitud y la velocidad de decaimiento.
5. Copie los datos sin procesar en el paso 5.2 en una hoja de cálculo, calcule la media y el error estándar de la media para un grupo de células registradas y trace los rastros promediados de la corriente de calcio y la capacitancia de la membrana (Figura 3E) en un software apropiado.

6. Análisis de datos de imágenes confocales

1. Abra los archivos de imágenes sin procesar con cualquier software suministrado por el fabricante (consulte la Tabla de materiales).
   NOTA: Algunos otros programas gratuitos, como ImageJ o Fiji, podrían utilizarse para procesar datos y cuantificar las imágenes obtenidas en la sección 4.
2. Haga clic en Procesar | ProcessTools y use las herramientas para generar archivos de promedio móvil (por ejemplo, promedio móvil por cada 4 imágenes) para cada imagen de lapso de tiempo y guardar esos archivos.
   NOTA: Después del promedio móvil, se podría hacer un ajuste apropiado del brillo y el fondo para mostrar mejor los cambios de fluorescencia de tres canales, lo que puede ayudar a identificar los eventos de fusión. Verificar la intensidad fluorescente en algunas regiones sin evento de fusión puede ayudar a distinguir la señal fluorescente de los eventos de fusión de las señales de fondo.
3. Haga clic en los botones Cuantificar | Herramientas | Stack Profile, compruebe los puntos de tiempo antes y después de la estimulación para identificar los cambios de fluorescencia en cada canal. Haga clic en el botón Dibujar elipse para rodear las regiones de interés (ROI) de los eventos de fusión. Haga clic con el botón derecho en la imagen y haga clic en Guardar ROI para guardar los ROI.
   NOTA: El tamaño del ROI, que cubre las tres señales fluorescentes, fue similar con el tamaño de la vesícula en las células cromafines²⁴. Para el análisis se utilizaron datos brutos, mientras que los datos de promedio rodante que aumentan la relación señal-ruido se proporcionaron para mostrar claramente las tres señales.
4. Haga clic en Abrir proyectos para localizar el archivo raw, haga clic con el botón derecho en la imagen y haga clic en Cargar ROI para cargar el archivo ROI en los archivos de imágenes raw para medir las intensidades de fluorescencia.
   NOTA: La señal fluorescente en bruto se utilizará para trazar trazas de diferentes canales. Para cada ROI, la línea de base se define como la intensidad antes de la estimulación, y los rastros de intensidad se pueden normalizar a la línea de base.
5. Haga clic en herramientas | Ordene los ROI en el software y trace los rastros para los tres canales de cada ROI. Haga clic en Informe para guardar los datos de ROI, incluidos los datos digitales y los rastros de imágenes para cada ROI, en una carpeta de archivos.
   1. Identificar un evento de fusión por el aumento simultáneo en la intensidad de la fluorescencia puntual de PH-mNG (F_PH) y_{A655 (F 655}) (dentro de un solo marco), acompañado de una disminución en la fluorescencia puntual de FFN511 (F_FFN).
   2. Busque la aparición de F_PH y F₆₅₅, lo que indica la formación de puntos PH-mNG / A655 debido a un perfil de Ω generado por fusión, lo que permite la difusión de PH-mNG desde la membrana plasmática y la difusión persistente de A655 desde el baño.
   3. Busque la disminución de F_FFN , que indica su liberación de una vesícula debido a la apertura del poro de fusión y excluye la posibilidad de que la aparición de F_PH y F₆₅₅ pueda deberse a la invaginación de la membrana causada por endocitosis.
   4. Inspeccione las imágenes_fijas XY/Z de lapso de tiempo que muestran los eventos de fusión que ocurren en la parte inferior de la celda. Analice tres modos de eventos de fusión: 1) fusión cercana, 2) fusión de permanencia y 3) fusión de contracción.
      NOTA: Los eventos de fusión rara vez se observaron antes de la despolarización, mientras que decenas de eventos de fusión se pudieron observar después de la despolarización. Después de la fusión, el perfil Ω puede cerrar su poro, mantener su poro abierto o encogerse para fusionarse con la membrana plasmática.
      1. Para identificar la fusión cercana, busque la atenuación F₆₅₅ porque el cierre del poro de fusión impide el intercambio del baño A655, mientras que F_PH se mantiene, lo que refleja la conversión continua de PtdIns(4,5)P₂ en PtdIns(4)P, o F_PH se desintegra con un retraso, reflejando el pellizco de vesícula (fusión cercana, Figura 4A, B).
      2. Busque F_PH sostenido y F₆₅₅ para identificar la fusión de permanencia (Figura 4C).
      3. Busque disminuciones paralelas de F_PH y F₆₅₅, lo que indica la contracción de perfil Ω para identificar la fusión retráctil (Figura 4D).
         Nota : compruebe los archivos de imágenes originales para inspeccionar los rastros de imágenes si no está seguro del tipo de evento. La comprobación de la intensidad fluorescente en algunas regiones sin evento de fusión puede ayudar a distinguir la señal fluorescente de los eventos de fusión de las señales de fondo.
6. Traza trazas representativas de los cambios de intensidad para estos tres canales: FFN511, PH-mNG y A655. Cuantificar el porcentaje de diferentes modos de fusión en cada celda y trazar figuras.

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Resultados

Siguiendo los procedimientos experimentales mostrados en la Figura 1 y la Figura 2, las células cromafines de las glándulas suprarrenales bovinas fueron transfectadas con PH-mNG para etiquetar la membrana plasmática; Se agregó A655 a la solución de baño para detectar el cierre de poros de fusión; y el falso neurotransmisor fluorescente FFN511 se cargó en vesículas para la detección de liberación. A continuación, se realizaron imágenes de lapso de ti...

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Discusión

Se describe un método de imagen microscópica confocal para detectar la dinámica de la liberación de poros y transmisores de fusión, así como tres modos de fusión, fusión cercana, fusión de permanencia y fusión retráctil en células cromafines suprarrenales bovinas ^4,24. Se describe un método electrofisiológico para despolarizar la célula y, por lo tanto, evocar exocitosis y endocitosis. El procesamiento sistemático de imágenes confocales proporcio...

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Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187-500MG	ATP for preparing internal solution
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons	Lonza	VSPI-1003	Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette	Warner Instruments	64-0795	Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G	Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M	Quality Biological	351-130-721	Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm	Falcon	352360	Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041	Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P	Sigma	11213873001	Enzyme for gland digestion
Coverslip	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagent for preparing culture medium
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagent for preparing culture medium
FFN511	Abcam	ab120331	Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877-250MG	GTP for preparing internal solution
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software	Leica	LAS X software	Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope	Leica	Leica TCS SP5	Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid	Sigma	49449-100G	Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier	Heka	Lock-in	Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Counting chamber
Microforge	Narishige	MF-830	Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron	EIKO filtering co	03-100/32	Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP	Addgene	Plasmid #51407	Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97	Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride	Sigma	P5404-500G	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software	Heka	Pulse	Software for patch-clamp data collection
Recording chamber	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride	Sigma	S7653-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S8282-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate	Barnsted/Thermolyne	type 10100	Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride	Sigma	T2265-100G	TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor	Sigma	T9253-5G	Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid	Leica	195371-10-9	Leica confocal mounting oil