Microscopie confocale pour mesurer trois modes de dynamique des pores de fusion dans les cellules chromaffines surrénales

Résumé

Ce protocole décrit une technique d’imagerie confocale permettant de détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines. Ces modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant un rétrécissement des vésicules fusionnées.

Résumé

L’ouverture et la fermeture dynamiques des pores de fusion médient l’exocytose et l’endocytose et déterminent leur cinétique. Ici, il est démontré en détail comment la microscopie confocale a été utilisée en combinaison avec l’enregistrement patch-clamp pour détecter trois modes de fusion dans les cellules chromaffines surrénales bovines en culture primaire. Les trois modes de fusion comprennent 1) la fusion étroite (également appelée kiss-and-run), impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, 2) la stay-fusion, impliquant l’ouverture des pores de fusion et le maintien du pore ouvert, et 3) la shrink-fusion, impliquant le retrait du profil en forme de Ω généré par la fusion jusqu’à ce qu’il fusionne complètement au niveau de la membrane plasmique.

Pour détecter ces modes de fusion, la membrane plasmique a été marquée en surexprimant mNeonGreen attaché au domaine PH de la phospholipase C δ (PH-mNG), qui se lie au phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PtdIns(4,5)P₂) au niveau de la feuillet face au cytosol de la membrane plasmique; les vésicules ont été chargées avec le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 pour détecter la libération de contenu vésiculeux; et Atto 655 a été inclus dans la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion. Ces trois sondes fluorescentes ont été imagées simultanément à environ 20-90 ms par image dans des cellules chromaffines vivantes pour détecter l’ouverture des pores de fusion, la libération de contenu, la fermeture des pores de fusion et les changements de taille des vésicules de fusion. La méthode d’analyse est décrite pour distinguer trois modes de fusion de ces mesures de fluorescence. La méthode décrite ici peut, en principe, s’appliquer à de nombreuses cellules sécrétoires au-delà des cellules chromaffines.

Introduction

La fusion membranaire médie de nombreuses fonctions biologiques, y compris la transmission synaptique, l’homéostasie de la glycémie, la réponse immunitaire et l’entrée virale ^1,2,3. L’exocytose, impliquant la fusion des vésicules au niveau de la membrane plasmique, libère des neurotransmetteurs et des hormones pour atteindre de nombreuses fonctions importantes, telles que les activités du réseau neuronal. La fusion ouvre un pore pour libérer le contenu vésiculeux, après quoi le pore peut se fermer pour récupérer la vésicule de fusion, appelée baiser et courir ^1,4. L’ouverture irréversible et réversible des pores de fusion peut être mesurée avec des enregistrements de capacité attachés à des cellules combinés à des enregistrements de conductance des pores de fusion de fusion de vésicules uniques.

Ceci est souvent interprété comme reflétant la fusion d’effondrement complet, impliquant la dilatation de la fusion jusqu’à l’aplatissement de la vésicule de fusion, et le baiser et le run, impliquant l’ouverture et la fermeture des pores de fusion, respectivement ^{5,6,7,8,9,10,11,12,13} . Des études récentes d’imagerie par épuisement des émissions confocales et stimulées (STED) dans des cellules chromaffines ont directement observé l’ouverture et la fermeture des pores de fusion (kiss-and-run, également appelée fusion fermée), l’ouverture des pores de fusion qui maintient une forme de Ω avec un pore ouvert pendant une longue période, appelée stay-fusion, et le rétrécissement de la vésicule de fusion jusqu’à ce qu’elle fusionne complètement avec la membrane plasmique, ce qui remplace la fusion à effondrement complet pour fusionner les vésicules de fusion avec la membrane plasmique^4, 8,14,15,16,17.

Dans les neurones, l’ouverture et la fermeture des pores de fusion ont été détectées par imagerie montrant la libération de points quantiques préchargés dans des vésicules plus grandes que le pore de fusion et avec des mesures de conductance des pores de fusion à la face de libération des terminaisons nerveuses ^5,18,19. Les cellules chromaffines surrénales sont largement utilisées comme modèle pour l’étude de l’exo- et de l’endocytose^20,21. Bien que les cellules chromaffines contiennent de grandes vésicules à noyau dense, tandis que les synapses contiennent de petites vésicules synaptiques, les protéines d’exocytose et d’endocytose dans les cellules chromaffines et les synapses sont assez analogues ^{10,11,12,20,21,22,23}.

Ici, une méthode est décrite pour mesurer ces trois modes de fusion à l’aide d’une méthode d’imagerie confocale combinée à l’électrophysiologie dans les cellules chromaffines surrénales bovines (Figure 1). Cette méthode consiste à charger de faux neurotransmetteurs fluorescents (FFN511) dans des vésicules pour détecter l’exocytose; ajout d’Atto 655 (A655) dans la solution de bain pour remplir le profil en forme de Ω généré par fusion, et marquage de la membrane plasmique avec le domaine PH de la phospholipase C δ (PH), qui se lie à PtdIns(4,5)P₂ à la membrane ^{plasmique 8,15,24}. La dynamique des pores de fusion peut être détectée par des changements dans différentes intensités fluorescentes. Bien que décrit pour les cellules chromaffines, le principe de cette méthode décrit ici peut être largement appliqué à de nombreuses cellules sécrétoires bien au-delà des cellules chromaffines.

Protocole

REMARQUE: La procédure d’utilisation des animaux a suivi les directives des NIH et a été approuvée par le nih Animal Care and Use Committee.

1. Culture de cellules chromaffines bovines

1. Préparer la solution de Locke (Tableau 1) et les outils d’autoclave 1 jour avant la culture de cellules chromaffines.
2. Obtenez des glandes surrénales bovines d’un abattoir local le jour de la culture et gardez-les immergées dans la solution glacée de Locke avant la dissection.
   REMARQUE: Les glandes surrénales sont de 21 à 27 mois, en bonne santé, Angus noir de l’un ou l’autre sexe (principalement masculin) avec un poids corporel d’environ 1 400 livres (~ 635 kg).
3. Préparer 30 mL (pour 3 glandes surrénales) de solution enzymatique fraîche contenant de la collagénase P, un inhibiteur de la trypsine et de l’albumine sérique bovine (tableau 1) avant la dissection et la maintenir à température ambiante.
4. Choisissez 3 glandes intactes sans coupures ni saignements à la surface et retirez le tissu adipeux avec des ciseaux (Figure 1A). Lavez les glandes par perfusion avec la solution de Locke jusqu’à ce qu’aucun sang ne sorte. Pour ce faire, gonflez la glande à travers la veine surrénale (Figure 1B) à l’aide d’une seringue de 30 mL attachée avec un filtre de 0,22 μm autant de fois que nécessaire²⁵.
   REMARQUE: Environ 150 mL de solution de Locke sont généralement nécessaires pour laver 3 glandes.
5. Pour la digestion, injecter la solution enzymatique à travers la veine surrénale à l’aide d’une seringue de 30 mL attachée avec un filtre de 0,22 μm jusqu’à ce que la glande commence à gonfler. Ensuite, laissez les glandes à 37 °C pendant 10 min. Injecter à nouveau et laisser les glandes à 37 °C pendant encore 10 min.
   REMARQUE: Environ 30 mL de solution enzymatique sont nécessaires pour digérer 3 glandes.
6. Après la digestion, coupez la glande longitudinalement de la veine à l’autre extrémité avec des ciseaux pour déplier la glande (Figure 1C). Isolez les médules en pinçant la médulla blanche dans une boîte de Petri de 10 cm contenant la solution de Locke.
   REMARQUE: La comparaison de l’intérieur de la glande avant et après la digestion est illustrée à la figure 1C. Les détails de la digestion et de l’isolement des moelles sont rapportés précédemment^23,25.
7. Couper et hacher la médulla en petits morceaux avec des ciseaux (Figure 1D). Filtrer la suspension médullaire avec une maille de nylon de 80 à 100 μm dans un bécher. Transférer ensuite le filtrat dans un tube conique de 50 mL pour centrifugation à 48 × g, température ambiante, pendant 3 min avec décélération de 3.
   REMARQUE: Le hachage des moelles prend généralement environ 10 minutes. Pour obtenir un bon rendement en cellules, les morceaux hachés doivent être très petits, jusqu’à ce qu’ils ne puissent pas être pincés.
8. Après centrifugation, retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille de cellule avec la solution de Locke par pipetage. Filtrer la suspension de la cellule avec une passoire de 80-100 μm et centrifuger à 48 x g, température ambiante, pendant 3 min avec une décélération de 3.
9. Retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire avec 30 ml de milieu de culture (tableau 1). Déterminez le nombre de cellules à l’aide des chambres de comptage de l’hémacytomètre²⁵.

2. Transfection par électroporation

1. Transférer 2,8 × 10⁶ cellules dans un tube de 15 mL. Granulés les cellules par centrifugation à 48 × g pendant 2 min avec décélération de 3. Ajouter 100 μL de tampon de transfection (voir le tableau des matériaux) fourni par le fabricant à la pastille de cellule, puis ajouter 2 μg du plasmide PH-mNG.
   REMARQUE: Le plasmide PH-mNG a été créé en remplaçant la protéine fluorescente verte améliorée (EGFP) par mNG dans PH-EGFP¹⁵ (voir le tableau des matériaux).
2. Mélanger doucement la suspension en pipetant la solution de haut en bas et transférer le mélange dans une cuvette d’électroporation sans délai (Figure 1E). Transférez immédiatement la cuvette dans l’électroporateur (voir la table des matériaux), sélectionnez le programme O-005 dans la liste des écrans et appuyez sur Entrée pour effectuer l’électroporation.
   REMARQUE: Préparer la suspension cellulaire pour la transfection dans une hotte de culture cellulaire. N’introduisez pas de bulles d’air dans la suspension pendant l’étape de mélange. Passez à l’étape suivante sans délai.
3. Après électroporation, ajouter immédiatement 1,8 mL de milieu à la cuvette et mélanger doucement avec un micropipeteur équipé d’une pointe stérile. Ajoutez ensuite 300 μL de la suspension des cellules électroporées sur le dessus du couvercle (voir le tableau des matériaux) dans chaque plat, en plaquant 5 à 6 plats au total pour une réaction d’électroporation.
4. Transférer délicatement la vaisselle dans un incubateur humidifié à 37 °C avec 9 % de CO₂ pendant 30 min, et ajouter doucement 2 mL de milieu préaverti à chaque plat après 30 min.
5. Conservez les cellules transfectées dans l’incubateur humidifié à 37 °C avec 9 % de CO₂ pendant 2 à 3 jours avant l’expérience.
   REMARQUE: Les cellules cultivées dureront une semaine. Il est préférable d’utiliser des cellules cultivées les jours 2-3.

3. Préparation pour l’enregistrement par patch-clamp et l’imagerie confocale

REMARQUE: Ce protocole a été réalisé avec un microscope confocal à balayage laser et un amplificateur patch-clamp avec enregistrement tension-pince ainsi qu’un amplificateur de verrouillage pour l’enregistrement de capacité. Une imagerie confocale du plan XY à un plan Z fixe (balayage_fixe XY/Z) a été utilisée pour imager les trois signaux fluorescents simultanément. Le plan Z était focalisé au fond de la cellule où la membrane plasmique adhérait aux couvercles.

1. Le jour de l’expérience de patch-clamp et d’imagerie, observez les cellules sous un microscope à fluorescence. Utilisez le champ lumineux pour vous assurer que la culture cellulaire n’est pas contaminée (Figure 1F) et l’épifluorescence pour vérifier la bonne expression de la protéine marquée par fluorescence.
   REMARQUE: Par exemple, PH-mNG est exprimé à la membrane plasmique d’environ 20-30% des cellules.
2. Préparez des pipettes de patch à partir de capillaires en verre borosilicate. Pour ce faire, tirez les pipettes avec un extracteur de pipette, enduisez leurs pointes de cire liquide et polissez-les avec une microforge (voir le Tableau des matériaux).
3. Allumez l’amplificateur d’enregistrement patch-clamp et démarrez le logiciel d’enregistrement patch-clamp (voir la Table des matériaux). Définissez les paramètres appropriés pour l’enregistrement du courant calcique et de la capacité dans le logiciel (voir le tableau des matériaux).
   1. Définissez un protocole d’enregistrement d’une durée totale de 60 s, où la stimulation commence à 10 s.
   2. Réglez le potentiel de maintien pour l’enregistrement de la pince de tension à -80 mV. Définissez une dépolarisation de 1 s de -80 mV à 10 mV comme stimulus pour induire l’afflux de calcium et le saut de capacité.
   3. Pour les mesures de capacité, réglez la fréquence du stimulus sinusoïdal sur une plage de 1 000 à 1 500 Hz avec une tension de crête à crête ne dépassant pas 50 mV.
4. Enregistrez le protocole et créez un nouveau fichier pour l’enregistrement.
5. Allumez le système de microscope confocal et définissez les paramètres appropriés dans le logiciel (voir le tableau des matériaux).
   1. Allumez les lasers, y compris 458 nm, 514 nm et 633 nm, et réglez la plage de collecte des émissions pour chaque laser en fonction de chaque sonde de fluorescence comme indiqué ci-dessous. FFN511: longueur d’onde d’excitation (EX), 458 nm; longueur d’onde d’émission (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655 : EX, 633 nm ; EM, 650-700 nm.
   2. Utilisez l’imagerie séquentielle pour FFN511 et mNG afin d’éviter la diaphonie entre ces deux sondes. Définissez un timelapse d’une durée de 1 min pour l’enregistrement de l’image (Figure 1G).

4. Enregistrement patch-clamp et imagerie confocale

1. Choisissez un plat avec un bon état cellulaire et une expression correcte et ajoutez 2 μL de faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 (stock de 10 mM, solution de travail 1:1 000) dans le milieu. Remettez le plat dans l’incubateur pendant 20 min. Vous pouvez également charger FFN511 après l’étape 3.2 et effectuer les étapes 3.3 à 3.5 en attendant de gagner du temps.
2. Une fois le chargement FFN511 terminé, préparer la chambre d’enregistrement et ajouter 2 μL de colorant fluorescent A655 dans 500 μL de la solution de bain (figure 2A et tableau 1). Transférer le couvercle de la parabole dans la chambre d’enregistrement (voir la table des matériaux) à l’aide d’une pince à épiler et ajouter immédiatement une solution de bain contenant de l’A655 (Figure 2B).
   REMARQUE: L’A655 est maintenu à -20 °C avec une concentration de 10 mM et la concentration en service est de 40 μM.
   ATTENTION : Portez des gants pour éviter tout contact cutané direct avec FFN511 ou A655.
3. Placer une goutte d’huile (indice de réfraction : 1,518 ; voir le Tableau des matériaux) sur l’objectif d’immersion dans l’huile 100x (Ouverture numérique = 1,4). Montez la chambre dans le microscope et utilisez le bouton de réglage pour que l’huile entre simplement en contact avec le bas du couvercle, puis immergez la pointe du fil de terre dans la solution de bain (Figure 2C, D).
   REMARQUE: Choisissez une huile d’immersion appropriée pour travailler à température ambiante. Il n’est pas nécessaire de basculer entre l’objectif à faible et à fort grossissement. La température ambiante est maintenue autour de 20-22 °C pendant l’enregistrement.
4. Mettez les cellules au point et utilisez l’imagerie en champ clair et confocale pour trouver une bonne cellule avec une expression mNG. Effectuez un zoom avant sur la cellule sélectionnée et ajustez-la au centre de la vue pour réduire les zones vides.
   REMARQUE : Le dessin schématique de l’étiquetage par fluorescence est illustré à la figure 3A. Une bonne cellule a généralement une membrane lisse et un bord propre (Figure 3B). Avec l’épifluorescence ou l’imagerie confocale, une bonne cellule semble avoir un fond grand et plat avec une expression lumineuse de mNG (Figure 3C).
   La taille des pixels est d’environ 50 nm, dans une plage de ~40-80 nm en fonction de la taille de cellule et du facteur de zoom différents.
5. Configurez les paramètres de l’imagerie confocale du plan XY sur un plan Z fixe (balayage_fixe XY/Z) de FFN511, PH-mNG et A655, avec un intervalle de temps réduit. Réglez la mise au point vers le bas de la cellule avec le bouton de réglage fin.
   REMARQUE: PH-mNG signale le contour de la membrane plasmique cellulaire à la section confocale du plan XY (à l’exception du fond de la cellule). Près du fond de la membrane cellulaire, des taches A655 peuvent être observées, qui reflètent des invaginations membranaires en forme de Ω ou en forme de Λ. Si le plan focal Z est inférieur au fond de la cellule, l’intensité de toute fluorescence deviendra plus faible.
6. Ajustez la puissance du laser d’excitation dans le logiciel pour trouver un réglage permettant d’obtenir le meilleur rapport signal/bruit et d’éviter un blanchiment important par fluorescence. Pour ce faire, commencez par une valeur de test initiale de 2,5 mW de puissance pour FFN511 excité à 458 nm et de 1 mW pour mNG excité à 514 nm. Pour L’A655 excité à 633 nm avec un laser HeNe, utilisez une puissance laser élevée, ~12-15 mW (c’est-à-dire 70% à 80% du maximum), qui, à excitation continue, peut blanchir tout A655 fluorescent à l’intérieur d’un profil en forme de Ω lorsque son pore est fermé.
   REMARQUE: Si la puissance du laser est trop élevée, la fluorescence PH-mNG et FFN511 sera blanchie rapidement. Si la puissance du laser est trop faible, les signaux seront trop faibles ou bruyants pour être analysés.
7. Ajouter 9 μL de solution interne (tableau 1) dans une pipette de raccordement et fixer la pipette au support dans l’étage de l’amplificateur à pince de raccordement (voir le tableau des matériaux).
8. Appliquez une petite pression positive avec une seringue et déplacez l’embout de la pipette pour toucher la solution de bain avec un micromanipulateur. Assurez-vous que l’amplificateur montre que la résistance de la pipette est d’environ 2-4 MΩ avec un test d’impulsion de tension. Appuyez sur LJ/Auto pour annuler la jonction liquide.
9. Déplacez la pipette vers la cellule sélectionnée avec le micromanipulateur. Pour former un mode attaché à la cellule, déplacez l’embout de la pipette pour toucher la cellule (la résistance augmentera); en appliquant doucement une pression négative avec la seringue (la résistance augmentera à plus de 1 GΩ), modifiez le potentiel de maintien de 0 à -80 mV.
10. Une fois que la résistance passe 1 GΩ, attendez ~30 s pour que la configuration se stabilise. Appuyez sur C-fast/Auto pour compenser la capacité rapide.
11. Pour former un mode à cellules entières, appliquez une pression négative pulsée courte mais puissante avec la seringue pour rompre la membrane (la forme de l’impulsion actuelle change avec un condensateur à membrane chargé et déchargé). Appuyez sur C-slow/Auto pour compenser la capacité lente.
12. Ajustez légèrement la mise au point de l’imagerie pour faire la mise au point sur le fond de la cellule. Démarrez simultanément l’imagerie timelapse confocale et l’enregistrement patch-clamp en cliquant simultanément sur les boutons Démarrer des deux applications logicielles différentes.
    REMARQUE: Le logiciel d’imagerie confocale fait un film à une vitesse d’environ 20-90 ms / image. L’enregistrement de la pince patch comprend l’état de repos pendant 10 s, la stimulation de dépolarisation de 1 s et 49 s supplémentaires après la stimulation. La configuration patch-clamp permet d’enregistrer le courant calcique, le saut de capacité et la désintégration induits par la dépolarisation de 1 s de -80 à +10 mV (Figure 3D).
13. Une fois l’enregistrement terminé, assurez-vous que les données sont enregistrées. Modifiez le potentiel de retenue à 0 mV. Retirez la pipette de la solution de bain et jetez-la.
14. Répétez les étapes 4.7 à 4.13 pour enregistrer une autre cellule dans le plat. Après 1 h d’enregistrement, passez à un autre plat pour l’enregistrement.
    REMARQUE: Après 1 h d’enregistrement, le taux de réussite de l’enregistrement patch-clamp diminue considérablement. Pour augmenter l’efficacité de la collecte de données, l’enregistrement pendant seulement 1 h est recommandé dans chaque plat.

5. Analyse des données patch-clamp

1. Ouvrez un logiciel approprié (voir la table des matériaux) pour l’analyse des données. Cliquez sur le | PPT Charger le fichier | PULSE Boutons de fichier pour charger le fichier .dat. Cliquez sur Le faire et quatre traces seront automatiquement tracées dans un graphique, y compris les traces de courant de calcium et de capacité.
2. Cliquez sur le | Windows Nouveaux boutons Graphique, choisissez le Pulse_1_1_1, la première vague dans Y Onde(s), puis cliquez sur Faire pour tracer le graphique courant de calcium. Cliquez sur le | Windows Nouveaux boutons Tableau, choisissez le Pulse_1_1_1, puis cliquez sur Faire pour afficher les données brutes du courant calcique, qui pourraient être utilisées pour tracer la trace moyenne de plusieurs cellules.
3. Dessinez un carré en conséquence dans le graphique du courant de calcium, cliquez avec le bouton droit de la souris et développez le signal actuel pour inclure la ligne de base et le pic de courant de calcium. Cliquez sur | graphique Afficher les informations pour afficher les curseurs A et B et les déplacer vers la ligne de base et le pic respectivement. Les informations du graphique seront affichées en bas et les paramètres pourront être estimés.
4. Répétez l’étape 5.2, mais choisissez la Pulse_1_1_1_Cm, la deuxième onde en Y Wave(s), pour tracer la trace de capacité. Répétez l’étape 5.3 et placez les curseurs A et B dans la position appropriée pour mesurer les paramètres de capacité, tels que la ligne de base, l’amplitude et la vitesse de désintégration.
5. Copiez les données brutes de l’étape 5.2 dans une feuille de calcul, calculez la moyenne et l’erreur-type de la moyenne pour un groupe de cellules enregistrées et tracez les traces moyennes de courant calcique et de capacité membranaire (figure 3E) dans un logiciel approprié.

6. Analyse des données d’imagerie confocale

1. Ouvrez les fichiers d’imagerie bruts avec n’importe quel logiciel fourni par le fabricant (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE: Certains autres programmes gratuits, tels que ImageJ ou Fiji, pourraient être utilisés pour le traitement des données et la quantification des images obtenues dans la section 4.
2. Cliquez sur | de processus ProcessTools et utilisez les outils pour générer des fichiers de moyenne mobile (par exemple, une moyenne mobile pour 4 images) pour chaque image timelapse et enregistrer ces fichiers.
   REMARQUE: Après la moyenne mobile, un ajustement approprié de la luminosité et de l’arrière-plan pourrait être effectué pour mieux montrer les changements de fluorescence de trois canaux, ce qui peut aider à identifier les événements de fusion. Vérifier l’intensité fluorescente dans certaines régions sans événement de fusion peut aider à distinguer le signal fluorescent des événements de fusion des signaux de fond.
3. Cliquez sur les boutons Quantifier | Outils | Profil de pile, vérifiez les points temporels avant et après la stimulation pour identifier les changements de fluorescence dans chaque canal. Cliquez sur le bouton Dessiner les ellipses pour encercler les régions d’intérêt (ROI) pour les événements de fusion. Faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Enregistrer les retours sur investissement pour enregistrer les retours sur investissement.
   REMARQUE: La taille du retour sur investissement, qui couvre les trois signaux fluorescents, était similaire à la taille des vésicules dans les cellules chromaffines²⁴. Les données brutes ont été utilisées pour l’analyse, tandis que les données de moyenne mobile qui augmentent le rapport signal/bruit ont été fournies pour montrer clairement les trois signaux.
4. Cliquez sur Ouvrir les projets pour localiser le fichier brut, faites un clic droit sur l’image et cliquez sur Charger les rois pour charger le fichier ROI dans les fichiers d’imagerie bruts afin de mesurer les intensités de fluorescence.
   REMARQUE: Le signal fluorescent brut sera utilisé pour tracer des traces de différents canaux. Pour chaque retour sur investissement, la ligne de base est définie comme l’intensité avant la stimulation, et les traces d’intensité peuvent être normalisées à la ligne de base.
5. Cliquez sur Outils | Triez les retours sur investissement dans le logiciel et tracez les traces pour les trois canaux de chaque retour sur investissement. Cliquez sur Rapport pour enregistrer les données de retour sur investissement, y compris les données numériques et les traces d’imagerie pour chaque retour sur investissement, dans un dossier de fichiers.
   1. Identifier un événement de fusion par l’augmentation simultanée de l’intensité de la fluorescence ponctuelle PH-mNG (F_PH) et_{A655 (F 655}) (dans une seule image), accompagnée d’une diminution de la fluorescence ponctuelle FFN511 (F_FFN).
   2. Recherchez l’apparence de F_PH et F₆₅₅, ce qui indique la formation de taches PH-mNG / A655 en raison d’un profil Ω généré par fusion, permettant la diffusion de PH-mNG de la membrane plasmique et la diffusion persistante de A655 du bain.
   3. Recherchez la diminution de la_{F FFN} , qui indique sa libération d’une vésicule due à l’ouverture des pores de fusion et exclut la possibilité que l’apparition de F_PH et F₆₅₅ puisse provenir d’une invagination membranaire causée par une endocytose.
   4. Inspectez les images_fixes XY/Z timelapse qui montrent les événements de fusion se produisant au fond de la cellule. Analysez trois modes d’événements de fusion : 1) fusion fermée, 2) fusion de séjour et 3) fusion de rétrécissement.
      NOTE: Les événements de fusion ont rarement été observés avant la dépolarisation, alors que des dizaines d’événements de fusion ont pu être observés après la dépolarisation. Après la fusion, le profil Ω peut fermer son pore, maintenir son pore ouvert ou rétrécir pour se fondre dans la membrane plasmique.
      1. Pour identifier la fusion étroite, recherchez la gradation F₆₅₅ car la fermeture des pores de fusion empêche l’échange du bain A655, tandis que F_PH se maintient, reflétant la conversion continue de PtdIns(4,5)_P2 en PtdIns(4)P, ou F_PH se désintègre avec un retard, réfléchissant le pincement des vésicules (fusion étroite, Figure 4A,B).
      2. Recherchez_{le PH} F soutenu et le F₆₅₅ pour identifier la fusion par séjour (Figure 4C).
      3. Recherchez des diminutions parallèles de F_PH et F₆₅₅, indiquant un retrait de profil Ω pour identifier la fusion de rétrécissement (Figure 4D).
         REMARQUE : Vérifiez les fichiers d’imagerie d’origine pour inspecter les traces d’imagerie si le type d’événement n’est pas certain. La vérification de l’intensité fluorescente dans certaines régions sans événement de fusion peut aider à distinguer le signal fluorescent des événements de fusion des signaux de fond.
6. Tracez des traces représentatives des changements d’intensité pour ces trois canaux : FFN511, PH-mNG et A655. Quantifiez le pourcentage de différents modes de fusion dans chaque cellule et tracez les figures.

Résultats

À la suite des procédures expérimentales illustrées aux figures 1 et 2, les cellules chromaffines des glandes surrénales bovines ont été transfectées avec du PH-mNG pour marquer la membrane plasmique; L’A655 a été ajouté à la solution de bain pour détecter la fermeture des pores de fusion; et le faux neurotransmetteur fluorescent FFN511 a été chargé dans les vésicules pour la détection de la libération. Ensuite, l’imagerie du timelapse con...

Discussion

Une méthode d’imagerie microscopique confocale est décrite pour détecter la dynamique des pores de fusion et de la libération du transmetteur, ainsi que trois modes de fusion, la fusion rapprochée, la fusion de séjour et la fusion rétractable dans les cellules chromaffines surrénales bovines ^4,24. Une méthode électrophysiologique pour dépolariser la cellule et ainsi évoquer l’exo- et l’endocytose est décrite. Le traitement systématique des ima...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187-500MG	ATP for preparing internal solution
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons	Lonza	VSPI-1003	Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette	Warner Instruments	64-0795	Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G	Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M	Quality Biological	351-130-721	Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm	Falcon	352360	Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041	Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P	Sigma	11213873001	Enzyme for gland digestion
Coverslip	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagent for preparing culture medium
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagent for preparing culture medium
FFN511	Abcam	ab120331	Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877-250MG	GTP for preparing internal solution
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software	Leica	LAS X software	Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope	Leica	Leica TCS SP5	Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid	Sigma	49449-100G	Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier	Heka	Lock-in	Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Counting chamber
Microforge	Narishige	MF-830	Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron	EIKO filtering co	03-100/32	Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP	Addgene	Plasmid #51407	Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97	Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride	Sigma	P5404-500G	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software	Heka	Pulse	Software for patch-clamp data collection
Recording chamber	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride	Sigma	S7653-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S8282-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate	Barnsted/Thermolyne	type 10100	Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride	Sigma	T2265-100G	TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor	Sigma	T9253-5G	Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid	Leica	195371-10-9	Leica confocal mounting oil