JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için konfokal bir görüntüleme tekniğini tanımlar. Bu füzyon modları arasında 1) füzyon gözenek açma ve kapama içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) kaynaşmış vezikül büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Özet

Dinamik füzyon gözenek açma ve kapama ekzositoz ve endositoza aracılık eder ve kinetiklerini belirler. Burada, konfokal mikroskopinin, primer kültür sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu tespit etmek için yama-kelepçe kaydı ile kombinasyon halinde nasıl kullanıldığı ayrıntılı olarak gösterilmiştir. Üç füzyon modu arasında 1) füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapatılmasını içeren yakın füzyon (öpüş ve koş olarak da adlandırılır), 2) füzyon gözenek açılmasını ve açılan gözenekin korunmasını içeren stay-füzyon ve 3) füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profilin plazma zarında tamamen birleşene kadar büzülmesini içeren büzülme-füzyon bulunur.

Bu füzyon modlarını tespit etmek için, plazma membranı, plazma zarının sitosol yüzlü broşüründe fosfatidilinositol-4,5-bisfosfata (PtdIns (4,5) P2) bağlanan fosfolipaz C δ (PH-mNG) PH alanı ile tutturulmuş mNeonGreen'i aşırı eksprese ederek etiketlendi; veziküller, veziküler içerik salınımını tespit etmek için floresan yanlış nörotransmitter FFN511 ile yüklendi; ve Atto 655, füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine dahil edildi. Bu üç floresan prob, füzyon gözenek açıklığını, içerik salınımını, füzyon gözenek kapanmasını ve kaynaştırma vezikül boyutu değişikliklerini tespit etmek için canlı kromafin hücrelerinde kare başına ~ 20-90 ms'de aynı anda görüntülendi. Analiz yöntemi, üç füzyon modunu bu floresan ölçümlerinden ayırt etmek için tanımlanmıştır. Burada açıklanan yöntem, prensip olarak, kromafin hücrelerinin ötesindeki birçok salgı hücresine uygulanabilir.

Giriş

Membran füzyonu, sinaptik iletim, kan şekeri homeostazı, immün yanıt ve viral giriş 1,2,3 dahil olmak üzere birçok biyolojik fonksiyona aracılık eder. Plazma zarında vezikül füzyonunu içeren ekzositoz, nöronal ağ aktiviteleri gibi birçok önemli fonksiyona ulaşmak için nörotransmitterleri ve hormonları serbest bırakır. Füzyon, veziküler içeriği serbest bırakmak için bir gözenek açar, bundan sonra gözenek, öp ve çalıştır 1,4 olarak adlandırılan kaynaştırıcı vezikülü almak için kapanabilir. Hem geri dönüşümsüz hem de geri dönüşümlü füzyon gözenek açıklığı, tek vezikül füzyonunun füzyon gözenek iletkenlik kayıtlarıyla birleştirilen hücreye bağlı kapasitans kayıtları ile ölçülebilir.

Bu genellikle kaynaştırıcı vezikülün düzleşmesine kadar füzyonun genişlemesini içeren tam çökme füzyonunu ve füzyon gözenek açma ve kapama işlemini içeren öpüşme ve koşmayı içeren, sırasıyla 5,6,7,8,9,10,11,12,13 olarak yorumlanır. . Kromafin hücrelerinde yapılan son konfokal ve uyarılmış emisyon tükenmesi (STED) görüntüleme çalışmaları, füzyon gözeneklerinin açılmasını ve kapanmasını (öp ve çalıştır, yakın füzyon olarak da adlandırılır), uzun süre açık gözenekli bir Ω şeklini koruyan füzyon gözenek açıklığını, kalış-füzyon olarak adlandırılan füzyon gözenek açıklığını ve kaynaştırıcı vezikülün plazma zarı ile birleşene kadar küçülmesini doğrudan gözlemlemiştir. 8,14,15,16,17.

Nöronlarda, füzyon gözeneklerinin açılması ve kapanması, füzyon gözeneklerinden daha büyük veziküllere önceden yüklenmiş kuantum noktalarının salınımını gösteren görüntüleme ve sinir terminallerininsalınım yüzünde füzyon gözenek iletkenlik ölçümleri ile tespit edilmiştir 5,18,19. Adrenal kromafin hücreleri, ekzo- ve endositoz20,21'in incelenmesi için bir model olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Kromafin hücreleri büyük yoğun çekirdekli veziküller içermesine rağmen, sinapslar küçük sinaptik veziküller içerirken, kromafin hücrelerinde ve sinapslarda ekzositoz ve endositoz proteinleri oldukça benzerdir 10,11,12,20,21,22,23.

Burada, sığır adrenal kromafin hücrelerinde elektrofizyoloji ile kombine konfokal görüntüleme yöntemi kullanılarak bu üç füzyon modunu ölçmek için bir yöntem tanımlanmıştır (Şekil 1). Bu yöntem, ekzositozu tespit etmek için floresan sahte nörotransmitterlerin (FFN511) veziküllere yüklenmesini içerir; füzyon tarafından üretilen Ω şeklindeki profili doldurmak için banyo çözeltisine Atto 655 (A655) eklenmesi ve plazma zarının, plazma zarı 8,15,24'te PtdIns(4,5)P 2'ye bağlanan fosfolipaz Cδ'nin (PH) PH alanı ile etiketlenmesi. Füzyon gözenek dinamikleri, farklı floresan yoğunluklarındaki değişikliklerle tespit edilebilir. Kromafin hücreleri için tanımlanmış olmasına rağmen, burada açıklanan bu yöntemin prensibi, kromafin hücrelerinin çok ötesinde birçok salgı hücresine yaygın olarak uygulanabilir.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protokol

NOT: Hayvan kullanım prosedürü NIH kurallarına uymuş ve NIH Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi tarafından onaylanmıştır.

1. Sığır kromafin hücre kültürü

  1. Locke çözeltisini (Tablo 1) ve otoklav aletlerini kromafin hücre kültüründen 1 gün önce hazırlayın.
  2. Kültür gününde yerel bir mezbahadan sığır adrenal bezleri alın ve diseksiyondan önce buz gibi soğuk Locke'un çözeltisine batırılmış halde tutun.
    NOT: Böbreküstü bezleri, vücut ağırlığı yaklaşık 1.400 pound (~ 635 kg) olan her iki cinsiyetten (çoğunlukla erkek) 21-27 aylık, sağlıklı, siyah Angus'tandır.
  3. Diseksiyondan önce kollajenaz P, tripsin inhibitörü ve sığır serum albümini (Tablo 1) içeren 30 mL (3 adrenal bez için) taze enzim çözeltisi hazırlayın ve oda sıcaklığında tutun.
  4. Yüzeyde kesik veya kanama olmadan 3 sağlam bez seçin ve yağ dokusunu makasla çıkarın (Şekil 1A). Bezleri, kan çıkmayana kadar Locke'un çözeltisi ile perfüzyonla yıkayın. Bunu başarmak için, bezi adrenal damardan (Şekil 1B), 0.22 μm'lik bir filtreyle tutturulmuş 30 mL'lik bir şırınga kullanarak gerektiği kadarşişirin 25.
    NOT: 3 bezi yıkamak için genellikle yaklaşık 150 mL Locke çözeltisine ihtiyaç vardır.
  5. Sindirim için, bez şişmeye başlayana kadar 0.22 μm'lik bir filtreyle tutturulmuş 30 mL'lik bir şırınga kullanarak enzim çözeltisini adrenal damardan enjekte edin. Ardından, bezleri 10 dakika boyunca 37 ° C'de bırakın. Bir kez daha enjekte edin ve bezleri 10 dakika daha 37 ° C'de bırakın.
    NOT: 3 bezi sindirmek için yaklaşık 30 mL enzim çözeltisi gereklidir.
  6. Sindirimden sonra, bezi açmak için bezi damardan diğer uca uzunlamasına makasla kesin (Şekil 1C). Beyaz medullayı Locke çözeltisini içeren 10 cm'lik bir Petri kabına cımbızlayarak medullae'yi izole edin.
    NOT: Sindirimden önce ve sonra bezin iç kısmının karşılaştırılması Şekil 1C'de gösterilmiştir. Sindirim ve medulla izolasyonunun detayları daha önce23,25 olarak bildirilmiştir.
  7. Medullayı makasla küçük parçalara bölün ve doğrayın (Şekil 1D). Medulla süspansiyonunu 80-100 μm naylon ağ ile bir beher içine filtreleyin. Daha sonra filtrazı, 48 × g, oda sıcaklığında, 3 dakika boyunca santrifüjleme için 3 mL'lik bir konik tüpe aktarın.
    NOT: Medullae'nin kıyılması genellikle ~ 10 dakika sürer. İyi bir hücre verimi elde etmek için, kıyılmış parçalar cımbızlanamayana kadar çok küçük olmalıdır.
  8. Santrifüjlemeden sonra, süpernatantı çıkarın ve pipetle hücre peletini Locke çözeltisi ile yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 80-100 μm'lik bir süzgeçle filtreleyin ve 48 x g, oda sıcaklığında, 3 yavaşlama ile 3 dakika boyunca santrifüj yapın.
  9. Süpernatantı çıkarın ve hücre peletini 30 ml kültür ortamı ile yeniden askıya alın (Tablo 1). Hemasitometre sayım odalarını kullanarak hücre sayısını belirleyin25.

2. Elektroporasyon ile transfeksiyon

  1. 2.8 × 106 hücreyi 15 mL'lik bir tüpe aktarın. 48 × g'da santrifüjleme ile hücreleri 2 dakika boyunca 3 yavaşlama ile toplayın. Hücre peletine üretici tarafından sağlanan 100 μL transfeksiyon tamponu ( Malzeme Tablosuna bakınız) ekleyin ve ardından 2 μg PH-mNG plazmidi ekleyin.
    NOT: PH-mNG plazmidi, PH-EGFP15'teki gelişmiş yeşil floresan proteinin (EGFP) mNG ile değiştirilmesiyle oluşturulmuştur ( Malzeme Tablosuna bakınız).
  2. Çözeltiyi yukarı ve aşağı pipetleyerek süspansiyonu yavaşça karıştırın ve karışımı gecikmeden bir elektroporasyon küvetine aktarın (Şekil 1E). Küvetin hemen elektroporatöre aktarılmasını sağlayın ( Malzeme Tablosuna bakın), ekran listesinden O-005 programını seçin ve elektroporasyon yapmak için Enter tuşuna basın.
    NOT: Hücre süspansiyonunu bir hücre kültürü başlığında transfeksiyon için hazırlayın. Karıştırma işlemi sırasında süspansiyona hava kabarcıkları sokmayın. Gecikmeden bir sonraki adıma geçin.
  3. Elektroporasyondan sonra, küvete hemen 1.8 mL ortam ekleyin ve steril bir uçla donatılmış bir mikropipettör ile hafifçe karıştırın. Daha sonra, her bir tabaktaki kapak kaymasının üzerine elektroporasyonlu hücrelerin süspansiyonunun 300 μL'sini ekleyin (Malzeme Tablosuna bakınız), bir elektroporasyon reaksiyonu için toplamda 5-6 tabak kaplayın.
  4. Bulaşıkları 30 dakika boyunca% 9 CO 2 ile 37 ° C'de nemlendirilmiş bir inkübatöre dikkatlice aktarın ve 30 dakika sonra her yemeğe nazikçe2 mL önceden ısıtılmış ortam ekleyin.
  5. Transfekte edilen hücreleri nemlendirilmiş inkübatörde 37 ° C'de deneyin 2-3 gün boyunca% 9 CO 2 ile tutun.
    NOT: Kültürlenmiş hücreler bir hafta sürecektir. Kültürlenmiş hücreleri 2-3. günlerde kullanmak en iyisidir.

3. Yama-kelepçe kaydı ve konfokal görüntüleme için hazırlık

NOT: Bu protokol, bir lazer taramalı konfokal mikroskop ve voltaj kelepçeli kaydı olan yama kelepçeli amplifikatör ile kapasitans kaydı için bir kilitlemeli amplifikatör ile birlikte gerçekleştirilmiştir. Sabit bir Z-düzleminde (XY / Zsabit tarama) bir XY düzlemi konfokal görüntüleme, üç floresan sinyalini aynı anda görüntülemek için kullanıldı. Z-düzlemi, plazma zarının kapaklara yapıştığı hücre tabanına odaklandı.

  1. Yama kelepçesi ve görüntüleme deneyinin yapıldığı gün, hücreleri bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin. Hücre kültürünün kontamine olmadığından emin olmak için brightfield (Şekil 1F) ve floresan etiketli proteinin doğru ekspresyonunu kontrol etmek için epifloresan kullanın.
    NOT: Örneğin, PH-mNG, hücrelerin ~% 20-30'unun plazma zarında eksprese edilir.
  2. Borosilikat cam kılcal damarlardan yama pipetleri hazırlayın. Bunu yapmak için, pipetleri bir pipet çektirici ile çekin, uçlarını sıvı balmumu ile kaplayın ve bir mikroforge ile parlatın (bkz.
  3. Patch-clamp kayıt amplifikatörünü açın ve patch-clamp kayıt yazılımını başlatın ( bkz. Yazılımda kalsiyum akımı ve kapasitans kaydı için uygun parametreleri ayarlayın ( bkz.
    1. Stimülasyonun 10 sn'de başladığı toplam 60 s süreli bir kayıt protokolü ayarlayın.
    2. Voltaj kelepçesi kaydı için tutma potansiyelini -80 mV'ye ayarlayın. Kalsiyum akışını ve kapasitans sıçramasını indüklemek için uyaran olarak -80 mV'den 10 mV'ye kadar 1 s depolarizasyon ayarlayın.
    3. Kapasitans ölçümleri için, sinüzoidal uyaranın frekansını, 50 mV'den fazla olmayan bir tepeden tepeye voltajla 1.000-1.500 Hz aralığına ayarlayın.
  4. Protokolü kaydedin ve kayıt için yeni bir dosya oluşturun.
  5. Konfokal mikroskop sistemini açın ve yazılımda uygun parametreleri ayarlayın ( bkz.
    1. 458 nm, 514 nm ve 633 nm dahil olmak üzere lazerleri açın ve aşağıdaki gibi her bir floresan probuna göre her lazer için emisyon toplama aralığını ayarlayın. FFN511: uyarma dalga boyu (EX), 458 nm; emisyon dalga boyu (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
    2. Bu iki prob arasındaki çapraz konuşmayı önlemek için FFN511 ve mNG için sıralı görüntüleme kullanın. Görüntü kaydı için 1 dakikalık bir zaman atlaması ayarlayın (Şekil 1G).

4. Patch-kelepçe kaydı ve konfokal görüntüleme

  1. İyi hücre durumuna ve doğru ifadeye sahip bir çanak seçin ve ortama 2 μL floresan sahte nörotransmitter FFN511 (10 mM stok, 1:1.000 çalışma çözeltisi) ekleyin. Çanağı 20 dakika boyunca inkübatöre geri koyun. Alternatif olarak, adım 3.2'den sonra FFN511'i yükleyin ve zamandan tasarruf etmek için beklerken 3.3-3.5 adımlarını gerçekleştirin.
  2. FFN511 yüklemesi bittikten sonra, kayıt odasını hazırlayın ve banyo çözeltisinin 500 μL'sine 2 μL floresan boya A655 ekleyin (Şekil 2A ve Tablo 1). Kapak kapağını çanaktan cımbızla kayıt odasına aktarın ( Malzeme Tablosuna bakınız) ve hemen A655 içeren banyo çözeltisi ekleyin (Şekil 2B).
    NOT: A655, 10 mM konsantrasyonda -20 °C'de tutulur ve çalışma konsantrasyonu 40 μM'dir.
    DİKKAT: FFN511 veya A655 ile doğrudan cilt temasını önlemek için eldiven giyin.
  3. 100x yağ daldırma hedefine (Sayısal Açıklık = 1.4) bir damla yağ (kırılma indisi: 1.518; Malzeme Tablosuna bakınız) yerleştirin. Odayı mikroskopa monte edin ve yağı sadece kapak kaymasının altına temas ettirmek için ayar düğmesini kullanın, ardından topraklama teli ucunu banyo çözeltisine daldırın (Şekil 2C, D).
    NOT: Oda sıcaklığında çalışmaya uygun bir daldırma yağı seçin. Düşük ve yüksek büyütmeli lens arasında geçiş yapmak gereksizdir. Kayıt sırasında oda sıcaklığı 20-22 °C civarında tutulur.
  4. Hücreleri odaklayın ve mNG ekspresyonuna sahip iyi bir hücre bulmak için parlak alan ve konfokal görüntüleme kullanın. Seçili hücreyi yakınlaştırın ve boş bölgeleri en aza indirmek için görünümün ortasına ayarlayın.
    NOT: Floresan etiketlemenin şematik çizimi Şekil 3A'da gösterilmiştir. İyi bir hücre genellikle pürüzsüz bir zara ve temiz bir kenara sahiptir (Şekil 3B). Epifloresan veya konfokal görüntüleme ile, iyi bir hücrenin parlak mNG ekspresyonu ile büyük ve düz bir tabana sahip olduğu görülmektedir (Şekil 3C).
    Piksel boyutu, farklı hücre boyutuna ve yakınlaştırma faktörüne göre ~ 40-80 nm aralığında ~50 nm'dir.
  5. FFN511, PH-mNG ve A655'in sabit bir Z-düzleminde (XY/Zsabit taraması) XY düzlemi konfokal görüntüleme için parametreleri en aza indirilmiş bir zaman aralığıyla ayarlayın. İnce ayar düğmesiyle odağı hücrenin altına ayarlayın.
    NOT: PH-mNG, konfokal XY-düzlem kesitinde hücre plazma zarının konturunu işaret eder (hücre tabanı hariç). Hücre zarı tabanının yakınında, Ω şeklinde veya Λ şeklinde membran invaginasyonlarını yansıtan A655 lekeleri gözlenebilir. Z-odak düzlemi hücre tabanından daha düşükse, tüm floresanların yoğunluğu zayıflayacaktır.
  6. En iyi sinyal-gürültü oranını elde etmek ve önemli floresan ağartmayı önlemek için bir ayar bulmak üzere yazılımdaki uyarma lazer gücünü ayarlayın. Bunu yapmak için, 458 nm'de uyarılan FFN511 için 2,5 mW güç ve 514 nm'de uyarılan mNG için 1 mW güç ile başlayın. Bir HeNe lazerle 633 nm'de uyarılan A655 için, sürekli uyarma üzerine, gözenek kapalıyken Ω şeklindeki bir profil içindeki tüm floresan A655'i ağartabilen yüksek lazer gücü, ~ 12-15 mW (yani, maksimumun% 70-80'i) kullanın.
    NOT: Lazer gücü çok yüksekse, PH-mNG ve FFN511 floresan hızlı bir şekilde ağartılacaktır. Lazer gücü çok düşükse, sinyaller analiz edilemeyecek kadar zayıf veya gürültülü olacaktır.
  7. Bir yama pipetine 9 μL dahili çözelti (Tablo 1) ekleyin ve pipeti yama kelepçeli amplifikatör aşamasındaki tutucuya takın (bkz.
  8. Bir şırınga ile az miktarda pozitif basınç uygulayın ve banyo çözeltisine bir mikromanipülatörle dokunmak için pipet ucunu hareket ettirin. Amplifikatörün bir voltaj darbe testi ile pipet direncinin ~ 2-4 MΩ olduğunu gösterdiğinden emin olun. Sıvı bağlantısını iptal etmek için LJ/Auto düğmesine basın.
  9. Pipet, mikromanipülatör ile seçilen hücreye doğru hareket ettirin. Hücreye bağlı bir mod oluşturmak için, pipet ucunu hücreye dokunacak şekilde hareket ettirin (direnç artacaktır); Şırınga ile yavaşça negatif basınç uygulamak (direnç 1 GΩ'dan daha fazla artacaktır), tutma potansiyelini 0'dan -80 mV'ye değiştirin.
  10. Direnç 1 GΩ'yi geçtikten sonra, konfigürasyonun stabilize olması için ~ 30 s bekleyin. Hızlı kapasitansı telafi etmek için C-fast/Auto tuşlarına basın.
  11. Tüm hücre modunu oluşturmak için, membranı parçalamak için şırınga ile darbeli kısa ama güçlü negatif basınç uygulayın (mevcut darbenin şekli, yüklü ve boşaltılmış bir membran kondansatör ile değişir). Yavaş kapasitansı telafi etmek için C-yavaş/Otomatik tuşlarına basın.
  12. Görüntüleme odağını hücre tabanına odaklanacak şekilde hafifçe ayarlayın. İki farklı yazılım uygulamasındaki Başlat düğmelerini aynı anda tıklatarak konfokal zaman atlamalı görüntülemeyi ve yama kelepçeli kaydı aynı anda başlatın.
    NOT: Konfokal görüntüleme yazılımı, ~20-90 ms/kare hızında bir film yapar. Yama-kelepçe kaydı, 10 s için dinlenme durumunu, 1 s depolarizasyon stimülasyonunu ve stimülasyondan sonra ek 49 s içerir. Yama-kelepçe konfigürasyonu, 1 s depolarizasyonunun -80 ila +10 mV arasında indüklediği kalsiyum akımının, kapasitans sıçramasının ve çürümenin kaydedilmesine izin verir (Şekil 3D).
  13. Kayıt tamamlandığında, verilerin kaydedildiğinden emin olun. Tutma potansiyelini tekrar 0 mV'ye değiştirin. Pipetleri banyo solüsyonundan çıkarın ve atın.
  14. Çanağa başka bir hücre kaydetmek için 4.7-4.13 arasındaki adımları yineleyin. 1 saatlik kayıttan sonra, kayıt için başka bir kaba geçin.
    NOT: 1 saatlik kayıttan sonra, yama kelepçeli kaydın başarı oranı önemli ölçüde azalır. Veri toplamanın verimliliğini artırmak için, her yemekte sadece 1 saat kayıt yapılması önerilir.

5. Yama-kelepçe veri analizi

  1. Veri analizi için uygun yazılımı açın ( Malzeme Tablosuna bakın). PPT | PULSE dosya | yükle .dat dosyasını yüklemek için dosya düğmeleri. Yap'a tıkladığınızda, kalsiyum akımı ve kapasitans izleri de dahil olmak üzere dört iz otomatik olarak tek bir grafikte çizilir.
  2. Windows | Yeni Grafik düğmeleri, Pulse_1_1_1, Y Dalgalarındaki ilk dalgayı seçin ve kalsiyum akımı grafiğini çizmek için Yap'ı tıklatın. Windows | Yeni Tablo düğmeleri, Pulse_1_1_1 seçin ve birden fazla hücrenin ortalama izini çizmek için kullanılabilecek kalsiyum akımının ham verilerini göstermek için Yap'ı tıklatın.
  3. Kalsiyum akımı grafiğinde buna göre bir kare çizin, sağ tıklayın ve kalsiyum akımının taban çizgisini ve zirvesini dahil etmek için akım sinyalini genişletin . Grafik |'e tıklayın A ve B imleçlerini göstermek ve bunları sırasıyla taban çizgisine ve zirveye taşımak için Bilgileri Göster. Grafik bilgileri altta gösterilecek ve parametreler tahmin edilebilir.
  4. Adım 5.2'yi tekrarlayın, ancak kapasitans izini çizmek için Pulse_1_1_1_Cm, Y Dalgalarındaki ikinci dalgayı seçin. Adım 5.3'ü yineleyin ve taban çizgisi, genlik ve bozunma hızı gibi kapasitans parametrelerini ölçmek için A ve B imleçlerini uygun konuma getirin.
  5. Adım 5.2'deki ham verileri bir elektronik tabloya kopyalayın, bir grup kayıtlı hücre için ortalamanın ortalama ve standart hatasını hesaplayın ve kalsiyum akımı ve membran kapasitansının ortalama izlerini (Şekil 3E) uygun bir yazılımda çizin.

6. Konfokal görüntüleme veri analizi

  1. Ham görüntüleme dosyalarını üretici tarafından sağlanan herhangi bir yazılımla açın ( bkz.
    NOT: ImageJ veya Fiji gibi diğer bazı ücretsiz programlar, bölüm 4'te elde edilen görüntülerin veri işlenmesi ve ölçülmesi için kullanılabilir.
  2. İşlem |'na tıklayın ProcessTools ve her zaman atlamalı görüntü için yuvarlanan ortalama (örneğin, her 4 görüntü için yuvarlanan ortalama) dosyaları oluşturmak ve bu dosyaları kaydetmek için araçları kullanın.
    NOT: Yuvarlanan ortalamadan sonra, üç kanalın floresan değişikliklerini daha iyi göstermek için parlaklık ve arka planın uygun şekilde ayarlanması yapılabilir, bu da füzyon olaylarının tanımlanmasına yardımcı olabilir. Füzyon olayı olmayan bazı bölgelerdeki floresan yoğunluğunu kontrol etmek, füzyon olaylarının floresan sinyalini arka plan sinyallerinden ayırt etmeye yardımcı olabilir.
  3. Quantify | düğmelerine tıklayın Araçlar | Yığın Profili, her kanaldaki floresan değişikliklerini tanımlamak için stimülasyondan önceki ve sonraki zaman noktalarını kontrol edin. Birleştirme etkinlikleri için ilgi çekici bölgeleri (YG) daire içine almak üzere Üç nokta çiz düğmesini tıklayın. Resme sağ tıklayın ve YG'leri kaydetmek için YG'leri Kaydet'e tıklayın.
    NOT: Üç floresan sinyalin tümünü kapsayan ROI'nin boyutu, kromafin hücreleri24'teki vezikül boyutuna benzerdi. Analiz için ham veriler kullanılırken, sinyal-gürültü oranını artıran yuvarlanan ortalama verilerin üç sinyali net bir şekilde göstermesi sağlanmıştır.
  4. Ham dosyayı bulmak için Projeleri aç'a tıklayın, resme sağ tıklayın ve floresan yoğunluklarını ölçmek üzere YG dosyasını ham görüntüleme dosyalarına yüklemek için YG'leri Yükle'ye tıklayın.
    NOT: Ham floresan sinyali, farklı kanalların izlerini çizmek için kullanılacaktır. Her ROI için taban çizgisi, stimülasyondan önceki yoğunluk olarak tanımlanır ve yoğunluk izleri taban çizgisine göre normalleştirilebilir.
  5. Araçlar |'e tıklayın Yazılımdaki yatırım getirilerini sıralayın ve her YG'nin üç kanalının da izlerini çizin. Her YG için hem dijital veriler hem de görüntüleme izlemeleri dahil olmak üzere yatırım getirisi verilerini bir dosya klasörüne kaydetmek için Rapor'u tıklatın.
    1. Bir füzyon olayını, FFN511 spot floresansında (F FFN) bir azalma ile birlikte, PH-mNG (FPH) veA655 (F 655) spot floresansının (FFFN) yoğunluğundaki eşzamanlı artışla tanımlayın.
    2. Füzyon tarafından üretilen bir Ω profili nedeniyle PH-mNG / A655 nokta oluşumunu gösteren, PH-mNG'nin plazma zarından difüzyonuna ve A655'in banyodan kalıcı difüzyonuna izinveren F PH ve F 655'in görünümünü arayın.
    3. FFFN düşüşünü arayın, bu da füzyon gözenek açıklığı nedeniyle bir vezikülden salındığını gösterir ve FPH ve F655 görünümünün endositozun neden olduğu membran invaginasyonundan kaynaklanma olasılığını dışlar.
    4. Hücre tabanında gerçekleşen füzyon olaylarını gösteren hızlandırılmış XY/Zsabit görüntülerini inceleyin. Üç füzyon olayı modunu analiz edin: 1) yakın füzyon, 2) stay-füzyon ve 3) shrink-füzyon.
      NOT: Depolarizasyondan önce füzyon olayları nadiren gözlenirken, depolarizasyondan sonra onlarca füzyon olayı gözlenebilir. Füzyonu takiben, Ω profili gözeneklerini kapatabilir, açık gözeneklerini koruyabilir veya plazma zarına birleşmek için büzülebilir.
      1. Yakın füzyonu tanımlamak için, F655'i karartmaya bakın, çünkü füzyon gözenek kapanması A655 banyosunun değişimini önlerken, F PH devam ederken, PtdIns(4,5)P2'nin PtdIns(4)P'ye devam eden dönüşümünü yansıtır veya FPH gecikmeli bozunur, vezikül sıkışmasını yansıtır (yakın füzyon, Şekil 4A,B).
      2. Kalış-füzyonu tanımlamak için sürekli F PH ve F655'i arayın (Şekil 4C).
      3. Büzülme füzyonunu tanımlamak için Ω profilli büzülmeyi gösteren FPH ve F655'in paralel düşüşlerini arayın (Şekil 4D).
        NOT: Olay türünden emin değilseniz görüntüleme izlerini incelemek için orijinal görüntüleme dosyalarını kontrol edin. Füzyon olayı olmayan bazı bölgelerde floresan yoğunluğunu kontrol etmek, füzyon olaylarının floresan sinyalini arka plan sinyallerinden ayırt etmeye yardımcı olabilir.
  6. Bu üç kanal için yoğunluk değişikliklerinin temsili izlerini çizin: FFN511, PH-mNG ve A655. Her hücredeki farklı füzyon modlarının yüzdesini ölçün ve rakamları çizin.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Sonuçlar

Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilen deneysel prosedürleri takiben, sığır adrenal bezlerinden kromafin hücreleri, plazma zarını etiketlemek için PH-mNG ile transfekte edildi; Füzyon gözenek kapanmasını tespit etmek için banyo çözeltisine A655 eklendi; ve floresan sahte nörotransmitter FFN511, salınımın tespiti için veziküllere yüklendi. Daha sonra, FFN511, PH-mNG ve A655'in XY düzlemi konfokal timelapse görüntülemesi, hücre tabanında h...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Tartışmalar

Füzyon gözenek ve transmitter salınımının dinamiklerini ve ayrıca sığır adrenal kromafin hücrelerinde üç füzyon modunu, yakın füzyonu, stay-füzyonu ve shrink-füzyonu tespit etmek için konfokal mikroskobik görüntüleme yöntemi tanımlanmıştır 4,24. Hücreyi depolarize etmek ve böylece ekzo- ve endositozu uyandırmak için elektrofizyolojik bir yöntem tanımlanmıştır. Sistematik konfokal görüntü işleme, füzyon ve fisyon olayları ...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Açıklamalar

Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.

Teşekkürler

Bu çalışmayı destekledikleri için NINDS Intramural Araştırma Programlarına (ZIA NS003009-13 ve ZIA NS003105-08) teşekkür ederiz.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187-500MGATP for preparing internal solution
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary NeuronsLonzaVSPI-1003Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipetteWarner Instruments64-0795Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albuminSigmaA2153-50GReagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 MQuality Biological351-130-721Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µmFalcon352360Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solutionSigma232041Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase PSigma11213873001Enzyme for gland digestion
CoverslipNeuvitroGG-14-LamininGG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KGReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEMThermoFisher Scientific11885092Reagent for preparing culture medium
EGTASigma324626-25GMReagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and NucleofectorAmaxa BiosystemsNucleofector IITransfect plasmids into cells
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10082147Reagent for preparing culture medium
FFN511Abcamab120331Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877-250MGGTP for preparing internal solution
HEPESSigmaH3375-500GReagent for preparing Locke’s solution
Igor ProWaveMetricsIgor proSoftware for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X softwareLeicaLAS X softwareConfocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning MicroscopeLeicaLeica TCS SP5Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acidSigma49449-100GReagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifierHekaLock-inSoftware for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 MQuality Biological351-033-721EAReagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-LineHausser Scientific3120Counting chamber
MicroforgeNarishigeMF-830Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µmMilliporeSLGPR33RBMaterial for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)Allele BiotechnologyABP-FP-MNEONSBTemplate for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micronEIKO filtering co03-100/32Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10HekaEPC-10Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFPAddgenePlasmid #51407Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette pullerSutter InstrumentP-97Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium ChlorideSigmaP5404-500GReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse softwareHekaPulseSoftware for patch-clamp data collection
Recording chamberWarner Instruments64-1943/QR-40LPcoverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chlorideSigmaS7653-1KGReagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxideSigmaS5881-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasicSigmaS0876-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasicSigmaS8282-500GReagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plateBarnsted/Thermolynetype 10100Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mLBecton Dickinson302832Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chlorideSigmaT2265-100GTEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitorSigmaT9253-5GReagent for gland digestion
Type F Immersion liquidLeica195371-10-9Leica confocal mounting oil

Referanslar

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356(2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503(2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604(2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

N robilimSay 181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır