מיקרוסקופיה קונפוקלית למדידת שלושה מצבים של דינמיקת נקבוביות היתוך בתאי כרומפין של יותרת הכליה

Summary

פרוטוקול זה מתאר טכניקת הדמיה קונפוקלית לזיהוי שלושה מצבי איחוי בתאי כרומפין של יותרת הכליה בקר. מצבי היתוך אלה כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבוביות שנפתחו, ו-3) היתוך-כיווץ, הכולל התכווצות שלפוחית מתמזגת.

Abstract

פתיחת נקבוביות היתוך דינמיות וסגירתן מתווכות אקסוציטוזה ואנדוציטוזה וקובעות את הקינטיקה שלהן. כאן, הוא מודגם בפירוט כיצד נעשה שימוש במיקרוסקופיה קונפוקלית בשילוב עם רישום מהדק טלאי כדי לזהות שלושה מצבי היתוך בתאי כרומפין יותרת הכליה של התרבית הראשונית. שלושת מצבי ההיתוך כוללים 1) היתוך קרוב (המכונה גם נשיקה וריצה), הכוללים פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, 2) היתוך שהייה, הכולל פתיחת נקבוביות היתוך ושמירה על הנקבובית שנפתחה, ו-3) היתוך-כיווץ, הכרוך בהתכווצות של פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך עד שהוא מתמזג לחלוטין בקרום הפלזמה.

כדי לזהות מצבי היתוך אלה, קרום הפלזמה סומן על ידי ביטוי יתר של mNeonGreen המחובר לתחום PH של פוספוליפאז C δ (PH-mNG), הנקשר לפוספטידילינוזיטול-4,5-ביספוספט (PtdIns(4,5)P₂) בעלון הפונה לציטוזול של קרום הפלזמה; שלפוחיות היו עמוסות עם נוירוטרנסמיטר כוזב פלואורסצנטי FFN511 כדי לזהות שחרור תוכן שלפוחית; ואטו 655 נכלל בתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך. שלוש בדיקות פלואורסצנטיות אלה צולמו בו-זמנית במהירות של כ-20-90 אלפיות השנייה לפריים בתאי כרומפין חיים כדי לזהות פתיחת נקבוביות היתוך, שחרור תוכן, סגירת נקבוביות היתוך ושינויים בגודל השלפוחית. שיטת הניתוח מתוארת כדי להבחין בין שלושה מצבי היתוך לבין מדידות פלואורסצנטיות אלה. השיטה המתוארת כאן יכולה, באופן עקרוני, לחול על תאים מפרישים רבים מעבר לתאי כרומפין.

Introduction

היתוך ממברנה מתווך תפקודים ביולוגיים רבים, כולל העברה סינפטית, הומאוסטזיס של גלוקוז בדם, תגובה חיסונית וכניסה ויראלית ^1,2,3. אקסוציטוזה, הכוללת איחוי שלפוחית בקרום הפלזמה, משחררת נוירוטרנסמיטורים והורמונים כדי להשיג פונקציות חשובות רבות, כגון פעילויות רשת עצבית. היתוך פותח נקבובית לשחרור תכולת השלפוחית, ולאחר מכן הנקבובית עשויה להיסגר כדי לאחזר את שלפוחית ההתמזגות, המכונה נשיקה והפעלה ^1,4. ניתן למדוד גם את פתיחת נקבוביות ההיתוך הבלתי הפיכה וגם את פתיחת נקבוביות ההיתוך ההפוכה באמצעות הקלטות קיבוליות המחוברות לתאים בשילוב עם הקלטות מוליכות נקבוביות היתוך של נקבוביות היתוך שלפוחית בודדת.

זה מתפרש לעתים קרובות כמשקף היתוך של קריסה מלאה, הכולל התרחבות של ההיתוך עד שיטוח של שלפוחית ההתמזגות, ונשיקה וריצה, הכוללת פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך, בהתאמה 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . מחקרי הדמיה אחרונים של דלדול פליטה קונפוקלית ומעוררת (STED) בתאי כרומפין צפו ישירות בפתיחת נקבוביות היתוך וסגירתן (נשיקה וריצה, הנקראת גם היתוך קרוב), פתיחת נקבוביות היתוך השומרת על צורת Ω עם נקבובית פתוחה במשך זמן רב, המכונה היתוך שהייה, וכיווץ שלפוחית ההתמזגות עד להשלמת התמזגותה עם קרום הפלזמה, המחליף היתוך קריסה מלאה למיזוג שלפוחית התמזגות עם קרום הפלזמה^4, 8,14,15,16,17.

בתאי עצב, פתיחה וסגירה של נקבוביות היתוך זוהו עם הדמיה המציגה שחרור של נקודות קוונטיות הטעונות מראש בשלפוחיות גדולות יותר מנקבוביות ההיתוך ועם מדידות מוליכות נקבוביות היתוך בפני שחרור של מסופי עצבים ^5,18,19. תאי כרומפין יותרת הכליה נמצאים בשימוש נרחב כמודל לחקר אקסו ואנדוציטוזה^20,21. אף על פי שתאי כרומפין מכילים בועיות גדולות בעלות ליבה צפופה, בעוד שסינפסות מכילות בועיות סינפטיות קטנות, חלבוני האקסוציטוזה והאנדוציטוזה בתאי כרומפין וסינפסות מקבילים למדי ל-10,11,12,20,21,22,23.

כאן מתוארת שיטה למדידת שלושת מצבי ההיתוך האלה באמצעות שיטת הדמיה קונפוקלית בשילוב עם אלקטרופיזיולוגיה בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר (איור 1). שיטה זו כוללת העמסה של נוירוטרנסמיטורים כוזבים פלואורסצנטיים (FFN511) לתוך שלפוחית כדי לזהות אקסוציטוזה; תוספת של Atto 655 (A655) בתמיסת האמבטיה כדי למלא את פרופיל צורת Ω שנוצר על ידי היתוך, ותיוג של קרום הפלזמה עם תחום PH של פוספוליפאז C δ (PH), הנקשר ל- PtdIns(4,5)P₂ בקרום הפלזמה ^8,15,24. ניתן לזהות דינמיקה של נקבוביות היתוך באמצעות שינויים בעוצמות פלואורסצנטיות שונות. למרות שהיא מתוארת עבור תאי כרומפין, העיקרון של שיטה זו המתוארת כאן יכול להיות מיושם באופן נרחב על תאים מפרישים רבים הרבה מעבר לתאי כרומפין.

Protocol

הערה: הליך השימוש בבעלי חיים פעל בהתאם להנחיות NIH ואושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של NIH.

1. תרבית תאי כרומפין בקר

1. הכינו את התמיסה של לוק (טבלה 1) ואת כלי האוטוקלבה האוטומטית יום אחד לפני תרבית תאי הכרומפין.
2. השיגו בלוטות יותרת הכליה של בקר מאבטואר מקומי ביום התרבית, ושמרו אותן שקועות בתמיסה הקרה כקרח של לוק לפני הנתיחה.
   הערה: בלוטות יותרת הכליה הן בנות 21-27 חודשים, אנגוס שחור בריא ושחור משני המינים (בעיקר זכר) עם משקל גוף סביב 1,400 פאונד (~ 635 ק"ג).
3. יש להכין 30 מ"ל (עבור 3 בלוטות יותרת הכליה) של תמיסת אנזימים טרייה המכילה קולגןאז P, מעכב טריפסין ואלבומין בסרום בקר (טבלה 1) לפני הניתוח ולשמור אותו בטמפרטורת החדר.
4. בחרו 3 בלוטות שלמות ללא חתכים או דימומים על פני השטח והסירו את רקמת השומן באמצעות מספריים (איור 1A). לשטוף את הבלוטות על ידי זלוף עם הפתרון של לוק עד שלא יוצא דם. כדי להשיג זאת, יש לנפח את הבלוטה דרך וריד יותרת הכליה (איור 1B) באמצעות מזרק של 30 מ"ל המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר בכמות הפעמים הדרושה^ל-25.
   הערה: כ 150 מ"ל של הפתרון של לוק הוא בדרך כלל נחוץ כדי לשטוף 3 בלוטות.
5. לצורך העיכול, הזריקו את תמיסת האנזים דרך וריד יותרת הכליה באמצעות מזרק של 30 מ"ל המחובר למסנן של 0.22 מיקרומטר עד שהבלוטה מתחילה להתנפח. לאחר מכן, השאירו את הבלוטות בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. להזריק שוב ולהשאיר את הבלוטות ב 37 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות נוספות.
   הערה: יש צורך בכ-30 מ"ל של תמיסת אנזים כדי לעכל 3 בלוטות.
6. לאחר העיכול, חותכים את הבלוטה לאורך הווריד לקצה השני עם מספריים כדי לפתוח את הבלוטה (איור 1C). בודדו את המדולה על ידי פינצטה של המדולה הלבנה לתוך צלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה את התמיסה של לוק.
   הערה: ההשוואה בין פנים הבלוטה לפני ואחרי העיכול מוצגת באיור 1C. הפרטים של העיכול ובידוד medullae דווחו בעבר^23,25.
7. חותכים את המדולה ומחברים אותה לחתיכות קטנות עם מספריים (איור 1D). מסננים את מתלי המדולה עם רשת ניילון של 80-100 מיקרומטר לכוס. לאחר מכן להעביר את התסיס לצינור חרוטי 50 מ"ל לצנטריפוגה ב 48 × גרם, טמפרטורת החדר, למשך 3 דקות עם האטה של 3.
   הערה: כריכה של medullae בדרך כלל לוקח ~ 10 דקות. כדי להשיג תשואה טובה של תאים, החלקים הטחונים חייבים להיות קטנים מאוד, עד שלא ניתן יהיה לתקן אותם.
8. לאחר צנטריפוגה, הסר את הסופרנטנט והחזיר את גלולת התא עם התמיסה של לוק על ידי צנרת. סנן את מתלה התא עם מסננת של 80-100 מיקרומטר, וצנטריפוגה ב-48 x גרם, טמפרטורת החדר, למשך 3 דקות עם האטה של 3.
9. מוציאים את הסופרנטנט ומחזירים את גלולת התא עם 30 מ"ל של מדיום תרבית (טבלה 1). קבע את מספר התא באמצעות תאי ספירת המקסיטומטר²⁵.

2. טרנספקציה עם אלקטרופורציה

1. להעביר 2.8 × 10⁶ תאים לתוך צינור 15 מ"ל. גלול את התאים על ידי צנטריפוגה ב 48 × g במשך 2 דקות עם האטה של 3. הוסף 100 μL של מאגר טרנספקציה (ראה טבלת החומרים) המסופק על ידי היצרן לכדור התא, ולאחר מכן הוסף 2 מיקרוגרם של פלסמיד PH-mNG.
   הערה: פלסמיד PH-mNG נוצר על-ידי החלפת החלבון הפלואורסצנטי הירוק המשופר (EGFP) ב-mNG ב-PH-EGFP¹⁵ (ראו טבלת החומרים).
2. ערבבו בעדינות את המתלים על-ידי צנרת התמיסה למעלה ולמטה, והעבירו את התערובת לקובט אלקטרופורציה ללא דיחוי (איור 1E). העבר מיד את הקובט לאלקטרופורטור (ראה את טבלת החומרים), בחר את תוכנית O-005 ברשימת המסך והקש Enter כדי לבצע אלקטרופורציה.
   הערה: הכינו את תרחיף התא לטרנספקציה במכסה אדים של תרבית תאים. אין להכניס בועות אוויר למתלים במהלך שלב הערבוב. המשך לשלב הבא ללא דיחוי.
3. לאחר אלקטרופורציה, הוסיפו 1.8 מ"ל של מדיום מיד לקובט וערבבו בעדינות עם מיקרופיפטטור המצויד בקצה סטרילי. לאחר מכן הוסיפו 300 μL של ההשעיה של התאים האלקטרופורים על גבי הכיסוי (ראו טבלת החומרים) בכל מנה, וציפו 5-6 כלים בסך הכל לתגובת אלקטרופורציה אחת.
4. העבירו בזהירות את הכלים לחממה לחה בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% CO₂ למשך 30 דקות, והוסיפו בעדינות 2 מ"ל של מדיום מחומם מראש לכל מנה לאחר 30 דקות.
5. שמור את התאים הטרנספקטים באינקובטור הלח בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 9% CO₂ למשך 2-3 ימים לפני הניסוי.
   הערה: התאים בתרבית יחזיקו מעמד במשך שבוע. עדיף להשתמש בתאים בתרבית בימים 2-3.

3. הכנה להקלטת מהדק טלאי והדמיה קונפוקלית

הערה: פרוטוקול זה בוצע עם מיקרוסקופ קונפוקלי לסריקת לייזר ומגבר מהדק טלאי עם הקלטת מהדק מתח יחד עם מגבר נעילה להקלטת קיבוליות. הדמיה קונפוקלית של מישור XY במישור Z קבוע (סריקה_קבועה XY/Z) שימשה כדי לצלם את כל שלושת האותות הפלואורסצנטיים בו זמנית. מישור ה-Z היה ממוקד בקרקעית התא, שם קרום הפלזמה נדבק לכיסויים.

1. ביום של ניסוי הידוק טלאי והדמיה, התבונן בתאים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. השתמשו בשדה בהיר כדי לוודא שתרבית התאים אינה מזוהמת (איור 1F) ובאפיפלואורסצנציה כדי לבדוק אם יש ביטוי נכון של החלבון המתויג כחלואורסצנטי.
   הערה: לדוגמה, PH-mNG מתבטא בקרום הפלזמה של כ-20-30% מהתאים.
2. הכן פיפטות טלאי מנימי זכוכית בורוסיליקט. לשם כך, משכו את הפיפטות עם מושך פיפטות, ציפו את קצותיהן בשעווה נוזלית וליטשו אותן במיקרו-פורג' (ראו טבלת החומרים).
3. הפעילו את מגבר ההקלטה של מהדק התיקון והפעילו את תוכנת ההקלטה של מהדקי התיקון (ראו טבלת החומרים). הגדר את הפרמטרים המתאימים לרישום זרם סידן וקיבוליות בתוכנה (ראה טבלת החומרים).
   1. הגדר פרוטוקול הקלטה של 60 שניות בסך הכל, כאשר הגירוי מתחיל ב-10 שניות.
   2. הגדר את פוטנציאל ההחזקה של הקלטת מהדקי מתח ל- -80 mV. קבעו דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80 mV ל-10 mV כתמריץ לגרימת זרם סידן וקפיצת קיבוליות.
   3. עבור מדידות קיבוליות, הגדר את התדר של הגירוי הסינוסואידלי לטווח של 1,000-1,500 הרץ עם מתח שיא לשיא של לא יותר מ-50 mV.
4. שמור את הפרוטוקול וצור קובץ חדש להקלטה.
5. הפעל את מערכת המיקרוסקופ הקונפוקלית והגדר את הפרמטרים המתאימים בתוכנה (ראה טבלת החומרים).
   1. הפעל את הלייזרים, כולל 458 ננומטר, 514 ננומטר ו- 633 ננומטר, והגדר את טווח איסוף הפליטות עבור כל לייזר בהתאם לכל בדיקה פלואורסצנטית כמו בהמשך. FFN511: אורך גל עירור (EX), 458 ננומטר; אורך גל פליטה (EM), 468-500 ננומטר. mNG: EX, 514 ננומטר; EM, 524-560 ננומטר. A655: EX, 633 ננומטר; EM, 650-700 ננומטר.
   2. השתמש בהדמיה רציפה עבור FFN511 ו- mNG כדי למנוע הצלבה בין שתי בדיקות אלה. קבעו משך זמן של דקה אחת להקלטת תמונה (איור 1G).

4. הקלטה של מהדק טלאי והדמיה קונפוקלית

1. בחר צלחת עם מצב תא טוב וביטוי נכון והוסף 2 μL של נוירוטרנסמיטר פלואורסצנטי כוזב FFN511 (מלאי 10 mM, תמיסת עבודה 1:1,000) למדיום. החזירו את המנה לחממה למשך 20 דקות. לחלופין, טען FFN511 לאחר שלב 3.2 ובצע שלבים 3.3-3.5 תוך המתנה כדי לחסוך זמן.
2. לאחר סיום העמסת FFN511, הכינו את תא ההקלטה והוסיפו 2 μL של צבע פלואורסצנטי A655 לתוך 500 μL של תמיסת האמבטיה (איור 2A וטבלה 1). העבירו את הכיסוי מהתבשיל לתוך תא ההקלטה (ראו טבלת החומרים) עם פינצטה, והוסיפו מיד תמיסת אמבטיה המכילה A655 (איור 2B).
   הערה: A655 נשמר ב -20 °C עם ריכוז של 10 mM וריכוז העבודה הוא 40 μM.
   אזהרה: לבשו כפפות כדי למנוע מגע ישיר עם העור עם FFN511 או A655.
3. מקם טיפת שמן (מקדם שבירה: 1.518; ראה טבלת החומרים) על מטרת טבילת השמן פי 100 (צמצם מספרי = 1.4). הרכיבו את התא במיקרוסקופ והשתמשו בידית הכוונון כדי לגרום לשמן פשוט ליצור קשר עם החלק התחתון של הכיסוי, ואז לטבול את קצה חוט ההארקה לתוך תמיסת האמבטיה (איור 2C, D).
   הערה: בחר שמן טבילה המתאים לעבודה בטמפרטורת החדר. המעבר בין עדשת ההגדלה הנמוכה והגבוהה הוא מיותר. טמפרטורת החדר נשמרת סביב 20-22 מעלות צלזיוס במהלך ההקלטה.
4. הכניסו את התאים למיקוד והשתמשו בהדמיה בהירה וקונפוקלית כדי למצוא תא טוב עם ביטוי mNG. הגדל את התצוגה של התא שנבחר והתאם אותו למרכז התצוגה כדי למזער אזורים ריקים.
   הערה: השרטוט הסכמטי של תיוג פלואורסצנטי מוצג באיור 3A. לתא טוב יש בדרך כלל קרום חלק וקצה נקי (איור 3B). בהדמיה אפיפלואורסצנטית או קונפוקלית, נראה שלתא טוב יש תחתית גדולה ושטוחה עם ביטוי mNG בהיר (איור 3C).
   גודל הפיקסל הוא ~ 50 ננומטר, בטווח של ~ 40-80 ננומטר בהתאם לגודל התא וגורם הזום השונים.
5. הגדר פרמטרים להדמיה קונפוקלית במישור XY במישור Z קבוע (סריקה_קבועה XY/Z) של FFN511, PH-mNG ו-A655, עם מרווח זמן מינימלי. התאם את המיקוד לתחתית התא באמצעות ידית הכוונון העדינה.
   הערה: PH-mNG מאותת על קווי המתאר של קרום הפלזמה של התא בהצלבה של מישור XY הקונפוקלי (למעט תחתית התא). ליד תחתית קרום התא, ניתן לראות כתמים A655, המשקפים Ω בצורת Ω או בצורת Λ אינוויגינציות של קרום. אם מישור מוקד ה-Z נמוך יותר מתחתית התא, העוצמה של כל הפלואורסצנציה תהיה חלשה יותר.
6. התאם את עוצמת הלייזר של העירור בתוכנה כדי למצוא הגדרה שתקבל את יחס האות לרעש הטוב ביותר ותמנע הלבנה פלואורסצנטית משמעותית. לשם כך, התחל עם ערך בדיקה ראשוני של הספק של 2.5 mW עבור FFN511 נרגש ב- 458 ננומטר ו- 1 mW עבור mNG נרגש ב- 514 ננומטר. עבור A655 נרגש ב-633 ננומטר עם לייזר HeNe, השתמש בהספק לייזר גבוה, ~12-15 mW (כלומר, 70%-80% מהמקסימום), אשר, לאחר עירור רציף, יכול להלבין את כל A655 פלואורסצנטי בתוך פרופיל בצורת Ω כאשר הנקבובית שלו סגורה.
   הערה: אם עוצמת הלייזר גבוהה מדי, PH-mNG ו-FFN511 פלואורסצנציה יולבנו במהירות. אם עוצמת הלייזר נמוכה מדי, האותות יהיו חלשים או רועשים מכדי לנתח אותם.
7. הוסף 9 μL של תמיסה פנימית (טבלה 1) לתוך פיפטה טלאי והצמד את הפיפטה למחזיק בשלב מגבר הידוק התיקון (ראה טבלת החומרים).
8. יש למרוח כמות קטנה של לחץ חיובי עם מזרק ולהזיז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתמיסת האמבטיה עם מיקרומניפולטור. ודא שהמגבר מראה שהתנגדות הפיפטה היא ~ 2-4 MΩ עם בדיקת פולס מתח. לחץ על LJ/Auto כדי לבטל את הצומת הנוזלי.
9. הזיזו את הפיפטה לכיוון התא שנבחר באמצעות המיקרומניפולטור. כדי ליצור מצב המחובר לתא, הזז את קצה הפיפטה כדי לגעת בתא (ההתנגדות תגדל); הפעלת לחץ שלילי בעדינות עם המזרק (ההתנגדות תגדל ליותר מ 1 GΩ), לשנות את פוטנציאל ההחזקה מ 0 ל -80 mV.
10. ברגע שההתנגדות עוברת 1 GΩ, המתן עד ~ 30 שניות עד שהתצורה תתייצב. לחץ על C-fast/Auto כדי לפצות על קיבוליות מהירה.
11. כדי ליצור מצב של תא שלם, יש להפעיל לחץ שלילי קצר אך רב עוצמה עם המזרק כדי לקרוע את הממברנה (צורת הדופק הנוכחי משתנה עם קבל ממברנה טעון ומשוחרר). לחץ על C-slow/Auto כדי לפצות על קיבוליות איטית.
12. התאם מעט את מוקד ההדמיה כדי להתמקד בתחתית התא. התחל הדמיית זמן קונפוקלית והקלטת מהדק תיקון בו-זמנית על-ידי לחיצה על הלחצנים התחל בשני יישומי התוכנה השונים בו-זמנית.
    הערה: תוכנת ההדמיה הקונפוקלית יוצרת סרט בקצב של ~ 20-90 אלפיות השנייה למסגרת. הקלטת מהדק התיקון כוללת את מצב המנוחה במשך 10 שניות, את גירוי הדה-פולריזציה של 1 שניות, ותוספת של 49 שניות לאחר הגירוי. תצורת מהדק הטלאים מאפשרת רישום של זרם סידן, קפיצת קיבוליות ודעיכה המושרים על-ידי דה-פולריזציה של 1 שניות מ-80- ל-10 mV +(איור 3D).
13. לאחר סיום ההקלטה, ודא שהנתונים נשמרים. שנה את פוטנציאל ההחזקה בחזרה ל-0 mV. מזיזים את הפיפטה מתמיסת האמבטיה ומשליכים אותה.
14. חזור על שלבים 4.7-4.13 כדי להקליט תא נוסף בצלחת. לאחר שעה אחת של הקלטה, החליפו למנה אחרת להקלטה.
    הערה: לאחר שעה אחת של הקלטה, שיעור ההצלחה של הקלטת מהדק טלאי יורד באופן משמעותי. כדי להגביר את היעילות של איסוף הנתונים, מומלץ לרשום רק שעה אחת בכל מנה.

5. ניתוח נתוני מהדק תיקון

1. פתח תוכנה מתאימה (ראה טבלת החומרים) לניתוח נתונים. לחץ על | PPT טען | קובץ PULSE לחצני קובץ לטעינת הקובץ .dat. לחץ על עשה זאת וארבעה עקבות יפורטו בגרף אחד באופן אוטומטי, כולל זרם הסידן ועקבות הקיבול.
2. לחץ על | Windows לחצני גרף חדשים, בחר את Pulse_1_1_1, הגל הראשון ב- Y Wave(s), ולחץ על עשה זאת כדי להתוות את גרף זרם הסידן. לחץ על | Windows לחצני טבלה חדשים, בחר את Pulse_1_1_1 ולחץ על עשה זאת כדי להציג את הנתונים הגולמיים של זרם סידן, שניתן להשתמש בהם כדי להתוות את העקבות הממוצעים של תאים מרובים.
3. צייר ריבוע בהתאם בגרף זרם הסידן, לחץ לחיצה ימנית והרחב את האות הנוכחי כך שיכלול את קו הבסיס ואת שיא זרם הסידן. לחץ על גרף | הצג מידע כדי להציג את הסמנים A ו- B ולהעביר אותם לקו הבסיס ולשיא בהתאמה. פרטי הגרף יוצגו בתחתית וניתן יהיה להעריך פרמטרים.
4. חזור על שלב 5.2, אך בחר את Pulse_1_1_1_Cm, הגל השני ב- Y Wave(s), כדי להתוות את עקבות הקיבול. חזור על שלב 5.3 והצב את הסמנים A ו- B במיקום המתאים למדידת פרמטרי הקיבול, כגון קו בסיס, משרעת וקצב דעיכה.
5. העתק נתונים גולמיים בשלב 5.2 לגיליון אלקטרוני, חישב את השגיאה הממוצעת והסטנדרטית של הממוצע עבור קבוצת תאים מוקלטים, והתווה את העקבות הממוצעים של זרם סידן וקיבוליות ממברנה (איור 3E) בתוכנה מתאימה.

6. ניתוח נתוני הדמיה קונפוקלית

1. פתח את קבצי ההדמיה הגולמיים עם כל תוכנה שסופקה על-ידי היצרן (ראה טבלת החומרים).
   הערה: ניתן להשתמש בכמה תוכניות חינמיות אחרות, כגון ImageJ או Fiji, לעיבוד נתונים ולכימות התמונות המתקבלות בסעיף 4.
2. לחץ על | תהליך ProcessTools ושימוש בכלים כדי ליצור ממוצע מתגלגל (לדוגמה, ממוצע מתגלגל עבור כל 4 תמונות) עבור כל תמונה בהילוך מהיר ולשמור קבצים אלה.
   הערה: לאחר גלגול הממוצע, ניתן לבצע התאמה מתאימה של הבהירות והרקע כדי להראות טוב יותר את השינויים הפלואורסצנטיים של שלושה ערוצים, מה שעשוי לסייע בזיהוי אירועי היתוך. בדיקת עוצמת הפלואורסצנט באזורים מסוימים ללא אירוע היתוך עשויה לסייע בהבחנה בין האות הפלואורסצנטי של אירועי היתוך לבין אותות רקע.
3. לחץ על הכפתורים כימות | כלים | פרופיל מחסנית, בדוק נקודות זמן לפני ואחרי הגירוי כדי לזהות שינויים פלואורסצנטיים בכל ערוץ. לחץ על לחצן ציור אליפסה כדי להקיף את אזורי העניין (ROIs) לאירועי היתוך. לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על שמור ROIs כדי לשמור את ה- ROIs.
   הערה: גודל ההחזר על ההשקעה, המכסה את כל שלושת האותות הפלואורסצנטיים, היה דומה לגודל השלפוחית בתאי כרומפין²⁴. לצורך הניתוח נעשה שימוש בנתונים גולמיים, בעוד שהנתונים הממוצעים המתגלגלים המגדילים את יחס האות לרעש סופקו כדי להראות בבירור את שלושת האותות.
4. לחץ על פתח פרויקטים כדי לאתר את הקובץ הגולמי, לחץ לחיצה ימנית על התמונה ולחץ על Load ROIs כדי לטעון את קובץ ההחזר על ההשקעה בקבצי ההדמיה הגולמיים כדי למדוד את עוצמות הפלואורסצנציה.
   הערה: האות הפלואורסצנטי הגולמי ישמש להתוויית עקבות של ערוצים שונים. עבור כל ROI, קו הבסיס מוגדר כעוצמה שלפני הגירוי, וניתן לנרמל את עקבות העוצמה לנקודת ההתחלה.
5. לחץ על כלים | מיין ROIs בתוכנה והתווה את העקבות עבור כל שלושת הערוצים של כל החזר השקעה. לחץ על דווח כדי לשמור את נתוני ההחזר על ההשקעה, כולל מעקבי נתונים דיגיטליים והדמיה עבור כל החזר השקעה, בתיקיית קבצים.
   1. זהה אירוע היתוך על ידי עלייה בו-זמנית בעוצמת הפלואורסצנציה הנקודתית PH-mNG (F_PH) ו-A655 (F₆₅₅) (בתוך מסגרת אחת), המלווה בירידה בפלואורסצנציה של נקודת FFN511 (F_FFN).
   2. חפש את המראה של F_{PH PH} ו- F₆₅₅, המציין היווצרות נקודה PH-mNG / A655 עקב פרופיל Ω שנוצר על ידי היתוך, המאפשר דיפוזיה של PH-mNG מממברנת הפלזמה והפצה מתמשכת של A655 מהאמבטיה.
   3. חפשו ירידה ב-F_FFN , אשר מציינת את שחרורה משלפוחית עקב פתיחת נקבוביות היתוך ואינה כוללת את האפשרות שהופעת F_PH ו-F₆₅₅ עשויה להיות מאינווגינציה של ממברנה הנגרמת על ידי אנדוציטוזה.
   4. בדוק את התמונות_{הקבועות} של XY/Z בהילוך הזמן המציגות אירועי היתוך המתרחשים בתחתית התא. נתחו שלושה מצבים של אירועי היתוך: 1) היתוך קרוב, 2) היתוך שהייה, ו-3) היתוך-כיווץ.
      הערה: אירועי היתוך נצפו רק לעתים רחוקות לפני דה-פולריזציה, בעוד שניתן היה לצפות בעשרות אירועי היתוך לאחר דה-פולריזציה. לאחר ההיתוך, פרופיל Ω עשוי לסגור את הנקבובית שלו, לשמור על הנקבובית הפתוחה שלה או להתכווץ כדי להתמזג לתוך קרום הפלזמה.
      1. כדי לזהות היתוך קרוב, חפשו עמעום F₆₅₅ מכיוון שסגירת נקבוביות היתוך מונעת את החלפת ה-A655 של האמבטיה, בעוד ש-F_PH מתקיים, מה שמשקף את ההמרה המתמשכת של PtdIns(4,5)P₂ ל-PtdIns(4)P, או F_PH דועך עם השהיה, המשקף את הצביטה המתמשכת של שלפוחית (היתוך קרוב, איור 4A,B).
      2. חפשו F_PH ו-F₆₅₅ מתמשכים כדי לזהות היתוך שהייה (איור 4C).
      3. חפשו הפחתות מקבילות של F_PH ו-F₆₅₅, מה שמצביע על התכווצות בפרופיל Ω כדי לזהות היתוך כיווץ (איור 4D).
         הערה: בדוק את קבצי ההדמיה המקוריים כדי לבדוק את עקבות ההדמיה אם אינך בטוח לגבי סוג האירוע. בדיקת עוצמת הפלואורסצנט באזורים מסוימים ללא אירוע היתוך עשויה לסייע בהבחנה בין האות הפלואורסצנטי של אירועי היתוך לבין אותות רקע.
6. העלילה מייצגת עקבות של שינויי עוצמה עבור שלושת הערוצים האלה: FFN511, PH-mNG ו- A655. לכמת את אחוז מצבי ההיתוך השונים בכל תא ומספרי העלילה.

תוצאות

בעקבות ההליכים הניסיוניים שהוכחו באיור 1 ובאיור 2, תאי כרומפין מבלוטת יותרת הכליה של בקר הועתקו עם PH-mNG כדי לתייג את קרום הפלזמה; A655 נוסף לתמיסת האמבטיה כדי לזהות סגירת נקבוביות היתוך; והנוירוטרנסמיטר הכוזב הפלואורסצנטי FFN511 הועמס בשלפוחיות לזיהוי שחרור. לאח...

Discussion

שיטת הדמיה מיקרוסקופית קונפוקלית מתוארת כדי לזהות את הדינמיקה של נקבוביות היתוך ושחרור משדרים, כמו גם שלושה מצבי היתוך, היתוך קרוב, היתוך שהייה ואיחוי התכווצות בתאי כרומפין יותרת הכליה בקר ^4,24. מתוארת שיטה אלקטרופיזיולוגית לדה-פולריזציה של התא ובכך לעורר א?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187-500MG	ATP for preparing internal solution
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons	Lonza	VSPI-1003	Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette	Warner Instruments	64-0795	Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G	Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M	Quality Biological	351-130-721	Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm	Falcon	352360	Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041	Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P	Sigma	11213873001	Enzyme for gland digestion
Coverslip	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagent for preparing culture medium
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagent for preparing culture medium
FFN511	Abcam	ab120331	Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877-250MG	GTP for preparing internal solution
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software	Leica	LAS X software	Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope	Leica	Leica TCS SP5	Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid	Sigma	49449-100G	Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier	Heka	Lock-in	Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Counting chamber
Microforge	Narishige	MF-830	Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron	EIKO filtering co	03-100/32	Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP	Addgene	Plasmid #51407	Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97	Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride	Sigma	P5404-500G	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software	Heka	Pulse	Software for patch-clamp data collection
Recording chamber	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride	Sigma	S7653-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S8282-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate	Barnsted/Thermolyne	type 10100	Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride	Sigma	T2265-100G	TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor	Sigma	T9253-5G	Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid	Leica	195371-10-9	Leica confocal mounting oil