부신 크로마핀 세포에서 융합 기공 역학의 세 가지 모드를 측정하는 공초점 현미경 검사

요약

이 프로토콜은 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위한 공초점 이미징 기술을 기술한다. 이러한 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 융합 된 소낭 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

초록

동적 융합 공극 개방 및 폐쇄는 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 매개하고 이들의 동역학을 결정한다. 여기에서, 공초점 현미경이 일차 배양 소 부신 크로마핀 세포에서 세 가지 융합 모드를 검출하기 위해 패치-클램프 기록과 함께 어떻게 사용되었는지를 상세히 입증한다. 세 가지 융합 모드에는 1) 융합 기공 개폐 및 폐쇄를 포함하는 근접 융합 (키스 앤 런이라고도 함), 2) 융합 기공 개방 및 개방 된 기공 유지를 포함하는 체류 융합, 3) 원형질막에서 완전히 병합 될 때까지 융합 생성 된 Ω 형상 프로파일의 수축을 포함하는 수축 융합이 포함됩니다.

이들 융합 모드를 검출하기 위해, 원형질막은 포스포리파제 C δ(PH-mNG)의 PH 도메인과 부착된 mNeonGreen을 과발현시킴으로써 표지하였고, 이는 원형질막의 시토졸 대향 전단지에서 포스파티딜이노시톨-4,5-비스포스페이트(PtdIns(4,5)_P2)에 결합하고; 수포 함량 방출을 검출하기 위해 형광 거짓 신경전달물질 FFN511로 로딩된 소포; 및 Atto 655를 융합 기공 폐쇄를 검출하기 위해 욕조 용액에 포함시켰다. 이 세 개의 형광 프로브를 라이브 크로마핀 세포에서 프레임당 ~20-90ms로 동시에 이미징하여 융합 기공 개방, 함량 방출, 융합 기공 폐쇄 및 융합 소포 크기 변화를 검출하였다. 분석 방법은 이러한 형광 측정으로부터 세 가지 융합 모드를 구별하기 위해 설명된다. 여기에 기술된 방법은 원칙적으로 크로마핀 세포를 넘어 많은 분비 세포에 적용할 수 있다.

서문

막 융합은 시냅스 전달, 혈당 항상성, 면역 반응 및 바이러스 진입 ^1,2,3을 포함한 많은 생물학적 기능을 매개합니다. 원형질막에서 소낭 융합을 포함하는 외세포증은 신경 전달 물질과 호르몬을 방출하여 신경 네트워크 활동과 같은 많은 중요한 기능을 수행합니다. 퓨전은 수포 내용물을 방출하기 위해 기공을 열고, 그 후에 기공은 키스 앤 런 ^1,4라고 불리는 융합 소포를 회수하기 위해 닫힐 수 있습니다. 비가역적 및 가역적 융합 기공 개방 둘 모두는 단일 소포 융합의 융합 공극 전도도 기록과 결합된 셀 부착 커패시턴스 기록으로 측정될 수 있다.

이것은 종종 융합 소포의 평탄화까지 융합의 팽창을 포함하는 완전 붕괴 융합을 반영하는 것으로 해석되며, 융합 기공 개폐를 포함하는 키스 앤 런은 각각 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . 최근 크로마핀 세포에서의 공초점 및 자극 방출 고갈(STED) 영상 연구는 융합 기공 개폐(키스 앤 런(kiss-and-run, close-fusion이라고도 함), 오랜 시간 동안 열린 기공으로 Ω 형태를 유지하는 융합 기공 개구, 체류-융합(stay-fusion)이라 불리우며, 융합된 소포가 원형질막과 완전히 병합될 때까지 융합된 소포의 축소를 직접 관찰하였으며, 이는 원형질막과 융합된 소포를 병합하기 위한 완전 붕괴 융합을 대체한다^4, 8,14,15,16,17.

뉴런에서, 융합 기공 개폐는 융합 기공보다 큰 소포에 미리 로딩된 양자점의 방출을 보여주는 이미징과 신경 말단의 방출면에서의 융합 기공 전도도 측정(^5,18,19)으로 검출되었다. 부신 크로마핀 세포는 exo- 및 엔도사이토시스^20,21의 연구를 위한 모델로서 널리 사용된다. 크로마핀 세포에는 큰 조밀 코어 소포가 포함되어 있지만 시냅스에는 작은 시냅스 소포가 포함되어 있지만 크로마핀 세포와 시냅스의 엑소 사이토시스 및 엔도 사이토시스 단백질은 10,11,12,20,21,22,23과 매우 유사합니다.

여기에서, 소 부신 크로마핀 세포에서 전기생리학과 결합된 공초점 이미징 방법을 이용하여 이들 세 가지 융합 모드를 측정하는 방법이 설명된다(도 1). 이 방법은 형광 거짓 신경 전달 물질 (FFN511)을 소포에 로딩하여 외세포증을 검출하는 것을 포함합니다. 합착 용액에 Atto 655(A655)를 첨가하여 융해-생성된 Ω형 프로파일을 채우고, 원형질막 ^8,15,24에서 PtdIns(^4,5)_P2에 결합하는 포스포리파제 C δ(PH)의 PH 도메인으로 원형질막의 표지를 채운다. 융합 기공 역학은 상이한 형광 강도의 변화를 통해 검출될 수 있다. 크로마핀 세포에 대해 기술되었지만, 여기에 기술된 이 방법의 원리는 크로마핀 세포를 훨씬 넘어서는 많은 분비 세포에 널리 적용될 수 있다.

프로토콜

참고: 동물 사용 절차는 NIH 지침을 따랐으며 NIH 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. 소 크로마핀 세포 배양

1. 크로마핀 세포 배양 1일 전에 로크의 용액(표 1) 및 오토클레이브 도구를 준비한다.
2. 배양 당일에 지역 축사에서 소 부신을 구하고 해부 전에 얼음처럼 차가운 로크의 용액에 잠기게하십시오.
   참고 : 부신 땀샘은 21-27 개월 된 건강하며 검은 색 앵거스 (주로 남성)이며 체중은 약 1,400 파운드 (~ 635kg)입니다.
3. 해부 전에 콜라게나제 P, 트립신 억제제 및 소 혈청 알부민(표 1)을 포함하는 신선한 효소 용액 30mL(부신 3개용)를 준비하고 실온에서 보관한다.
4. 표면에 상처나 출혈이 없는 3개의 손상되지 않은 땀샘을 선택하고 가위로 지방 조직을 제거합니다(그림 1A). 피가 나오지 않을 때까지 로크의 용액으로 관류하여 땀샘을 씻으십시오. 이를 위해 0.22 μm 필터가 부착된 30 mL 주사기를 사용하여 부신 정맥을 통해 땀샘을 팽창시키고(그림 1B) 필요한 횟수만큼²⁵회 팽창시킨다.
   참고 : 약 150 mL의 로크 용액은 일반적으로 3 개의 땀샘을 씻는 데 필요합니다.
5. 소화를 위해, 땀샘이 부풀어 오르기 시작할 때까지 0.22 μm 필터가 부착된 30 mL 주사기를 사용하여 부신 정맥을 통해 효소 용액을 주입하십시오. 그런 다음 땀샘을 37 °C에서 10 분 동안 그대로 두십시오. 다시 한 번 주사하고 땀샘을 37 ° C에서 10 분 동안 그대로 두십시오.
   참고 : 3 땀샘을 소화하기 위해 약 30 mL의 효소 용액이 필요합니다.
6. 소화 후, 가위로 정맥에서 반대쪽 끝으로 땀샘을 세로로 잘라 땀샘을 펼치십시오 (그림 1C). 하얀 수질을 핀셋으로 뽑아 로크의 용액이 들어있는 10cm 페트리 접시에 담아 수질을 분리하십시오.
   참고: 소화 전후의 땀샘 내부의 비교는 그림 1C에 나와 있습니다. 소화 및 수질 분리의 세부 사항은 이전에^23,25보고되었습니다.
7. 수질을 가위로 작은 조각으로 자르고 다듬습니다 (그림 1D). 수질 현탁액을 80-100 μm 나일론 메쉬로 비이커에 걸러냅니다. 이어서, 여액을 50 mL 원뿔형 튜브로 옮기고 48 × g, 실온에서 3분 동안 3분 동안 감속시켰다.
   참고 : 수질의 다짐은 일반적으로 ~ 10 분이 걸립니다. 세포의 좋은 수율을 얻으려면 다진 조각이 핀셋을 할 수 없을 때까지 매우 작아야합니다.
8. 원심분리 후, 상층액을 제거하고 피펫팅에 의해 로크의 용액으로 세포 펠릿을 재현탁시킨다. 세포 현탁액을 80-100 μm 스트레이너로 여과하고, 48 x g, 실온에서 원심분리하고, 3의 감속으로 3분 동안 원심분리한다.
9. 상청액을 제거하고 세포 펠렛을 30 ml의 배지로 재현탁시켰다(표 1). 혈구계 계수 챔버(²⁵)를 사용하여 세포 수를 결정한다.

2. 전기천공을 이용한 트랜스펙션

1. 2.8 × 10⁶ 세포를 15 mL 튜브로 옮깁니다. 세포를 3의 감속으로 2분 동안 48 × g 에서 원심분리하여 펠릿화하였다. 제조업체가 제공한 100 μL의 형질감염 완충액 ( 물질 표 참조)을 세포 펠릿에 첨가한 다음, 2 μg의 PH-mNG 플라스미드를 첨가한다.
   주: PH-mNG 플라스미드는 강화된 녹색 형광 단백질(EGFP)을 PH-EGFP¹⁵ 의 mNG로 대체함으로써 생성되었다( 물질의 표 참조).
2. 용액을 위아래로 피펫팅하여 현탁액을 부드럽게 혼합하고, 혼합물을 지연 없이 전기천공 큐벳으로 옮긴다(그림 1E). 큐벳을 전기 천공기( 재료 표 참조)로 즉시 전송하고, 화면 목록에서 O-005 프로그램을 선택한 다음, Enter 키를 눌러 전기천공을 수행합니다.
   주: 세포 배양 후드에서 형질감염을 위해 세포 현탁액을 준비한다. 혼합 단계 동안 현탁액에 기포를 도입하지 마십시오. 지체 없이 다음 단계로 진행하십시오.
3. 전기천공 후, 배지 1.8 mL를 큐벳에 즉시 첨가하고, 멸균 팁이 장착된 마이크로피펫터와 부드럽게 혼합한다. 그런 다음 커버슬립 ( 재료 표 참조) 위에 전기 천공 된 셀의 현탁액 300 μL를 각 접시에 넣고 하나의 전기 천공 반응을 위해 총 5-6 개의 접시를 도금합니다.
4. 조심스럽게 접시를 9%_CO2 로 37°C에서 가습된 인큐베이터로 30분 동안 옮기고, 30분 후에 각 접시에 미리 예열된 배지 2 mL를 부드럽게 첨가한다.
5. 형질감염된 세포를 실험 전에 2-3일 동안 9%_CO2 와 함께 37°C의 가습된 인큐베이터에 보관한다.
   주: 배양된 세포는 일주일 동안 지속될 것이다. 2-3 일에 배양 된 세포를 사용하는 것이 가장 좋습니다.

3. 패치 클램프 기록 및 공초점 이미징 준비

참고: 이 프로토콜은 레이저 스캐닝 공초점 현미경 및 커패시턴스 기록을 위한 잠금 증폭기와 함께 전압 클램프 레코딩이 있는 패치 클램프 증폭기로 수행되었습니다. 고정 Z-평면에서의 XY 평면 공초점 이미징(XY/Z_고정 스캐닝)을 사용하여 세 개의 형광 신호를 동시에 촬영했습니다. Z-평면은 원형질막이 커버슬립에 부착되어 있는 세포 바닥에 초점을 맞췄다.

1. 패치 클램프 및 이미징 실험 당일에, 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다. 브라이트필드를 사용하여 세포 배양물이 오염되지 않았는지 확인하고(도 1F) 에피형광을 사용하여 형광 태깅 단백질의 적절한 발현을 확인한다.
   참고: 예를 들어, PH-mNG는 세포의 ~20-30%의 원형질막에서 발현된다.
2. 붕규산 유리 모세 혈관에서 패치 피펫을 준비하십시오. 이렇게하려면 피펫 풀러로 피펫을 당기고 팁을 액체 왁스로 코팅 한 다음 마이크로 단조로 닦 으십시오 (재료 표 참조).
3. 패치 클램프 레코딩 앰프를 켜고 패치 클램프 레코딩 소프트웨어를 시작합니다( 자료표 참조). 소프트웨어에서 칼슘 전류 및 정전 용량 기록에 적합한 파라미터를 설정합니다( 재료표 참조).
   1. 자극이 10초에서 시작되는 총 60초 지속 시간의 기록 프로토콜을 설정합니다.
   2. 전압 클램프 기록의 유지 전위를 -80mV로 설정합니다. 칼슘 유입 및 커패시턴스 점프를 유도하기 위한 자극으로서 -80mV에서 10mV로 1s 탈분극을 설정한다.
   3. 정전 용량 측정의 경우, 정현파 자극의 주파수를 피크 대 피크 전압이 50mV 이하인 1,000-1,500Hz 범위로 설정하십시오.
4. 프로토콜을 저장하고 기록할 새 파일을 만듭니다.
5. 공초점 현미경 시스템을 켜고 소프트웨어에서 적절한 매개 변수를 설정 하십시오 (재료 표 참조).
   1. 458 nm, 514 nm, 및 633 nm를 포함하는 레이저를 켜고, 다음에서와 같이 각 형광 프로브에 따라 각 레이저에 대한 방출 수집 범위를 설정한다. FFN511: 여기 파장 (EX), 458 nm; 방출 파장 (EM), 468-500 nm. mNG: EX, 514 nm; EM, 524-560 nm. A655: EX, 633 nm; EM, 650-700 nm.
   2. FFN511 및 mNG에 순차 이미징을 사용하여 이 두 프로브 사이의 누화를 피하십시오. 이미지 녹화를 위한 타임랩스를 1분 간격으로 설정합니다(그림 1G).

4. 패치 클램프 기록 및 공초점 이미징

1. 좋은 세포 상태와 적절한 발현을 가진 접시를 선택하고 2 μL의 형광 거짓 신경 전달 물질 FFN511 (10 mM 스톡, 1:1,000 작동 용액)을 배지에 첨가하십시오. 접시를 20 분 동안 인큐베이터에 다시 넣으십시오. 또는 3.2단계 후에 FFN511을 로드하고 대기 중에 3.3-3.5단계를 수행하여 시간을 절약하십시오.
2. FFN511 로딩이 완료된 후, 기록 챔버를 준비하고, 2 μL의 형광 염료 A655를 500 μL의 욕조 용액에 첨가한다(도 2A 및 표 1). 커버 슬립을 핀셋으로 접시에서 기록 챔버( 재료 표 참조)로 옮기고 즉시 A655 함유 욕조 용액(그림 2B)을 추가합니다.
   참고: A655는 10 mM의 농도로 -20°C에 보관되며 작동 농도는 40 μM입니다.
   주의: FFN511 또는 A655와의 직접적인 피부 접촉을 방지하기 위해 장갑을 착용하십시오.
3. 100x 오일 침지 목표(수치 조리개 = 1.4)에 오일 한 방울(굴절률: 1.518, 재료 표 참조)을 놓습니다. 챔버를 현미경에 장착하고 조정 노브를 사용하여 오일이 커버슬립의 바닥에 닿도록 한 다음 접지선 팁을 욕조 용액에 담그십시오(그림 2C, D).
   참고: 실온에서 작업하기에 적합한 침수 오일을 선택하십시오. 저배율 렌즈와 고배율 렌즈 사이를 전환하는 것은 불필요합니다. 실내 온도는 기록 동안 약 20-22 °C로 유지된다.
4. 세포에 초점을 맞추고 밝은 필드 및 공초점 이미징을 사용하여 mNG 발현이있는 좋은 세포를 찾으십시오. 선택한 셀을 확대하고 뷰의 중앙으로 조정하여 빈 영역을 최소화합니다.
   참고: 형광 표지의 개략도는 도 3A에 도시되어 있다. 좋은 세포는 보통 매끄러운 막과 깨끗한 가장자리를 가지고 있습니다 (그림 3B). 후피형광 또는 공초점 영상화의 경우, 좋은 세포는 밝은 mNG 발현과 함께 크고 평평한 바닥을 갖는 것으로 보인다(도 3C).
   픽셀 크기는 ~ 50nm이며, 다른 셀 크기 및 줌 계수에 따라 ~ 40-80 nm 범위 내에 있습니다.
5. 최소화된 시간 간격으로 FFN511, PH-mNG 및 A655의 고정 Z-평면(XY/Z_고정 스캐닝)에서 XY 평면 공초점 이미징에 대한 파라미터를 설정합니다. 미세 조정 손잡이로 초점을 셀 하단으로 조정합니다.
   참고: PH-mNG는 공초점 XY 평면 단면(셀 바닥 제외)에서 세포 원형질막의 윤곽을 알립니다. 세포막 바닥 근처에서 A655 반점이 관찰 될 수 있으며, 이는 Ω 모양 또는 Λ 자형 막 내포를 반영합니다. Z-초점 평면이 세포 바닥보다 낮 으면 모든 형광의 강도가 약해질 것입니다.
6. 소프트웨어에서 여기 레이저 파워를 조정하여 최상의 신호 대 잡음비를 얻고 상당한 형광 표백을 피할 수 있는 설정을 찾으십시오. 이렇게 하려면 458nm에서 여기된 FFN511의 경우 2.5mW 전력, 514nm에서 여기된 mNG의 경우 1mW의 초기 테스트 값으로 시작합니다. HeNe 레이저로 633nm에서 여기된 A655의 경우, ~12-15mW(즉, 최대치의 70%-80%)의 높은 레이저 파워를 사용하여 연속 여기 시 기공이 닫힐 때 Ω 형상 프로파일 내부의 모든 형광 A655를 표백할 수 있습니다.
   참고: 레이저 파워가 너무 높으면 PH-mNG 및 FFN511 형광이 빠르게 표백됩니다. 레이저 출력이 너무 낮으면 신호가 너무 약하거나 시끄러워서 분석할 수 없습니다.
7. 9μL의 내부 용액(표 1)을 패치 피펫에 넣고 피펫을 패치 클램프 증폭기 스테이지의 홀더에 부착 합니다(재료 표 참조).
8. 주사기로 소량의 양압을 가하고 피펫 팁을 움직여 미세 조작기로 목욕 용액을 만지십시오. 증폭기가 전압 펄스 테스트에서 파이펫 저항이 ~ 2-4MΩ임을 보여 주는지 확인하십시오. LJ/Auto를 눌러 액체 접합부를 취소합니다.
9. 미세 조작기를 사용하여 피펫을 선택한 셀 쪽으로 이동합니다. 셀 부착 모드를 형성하려면 피펫 팁을 움직여 셀을 만지십시오 (저항이 증가 할 것입니다). 주사기로 부드럽게 음압을 가하면 (저항이 1GΩ 이상으로 증가함), 유지 전위를 0에서 -80mV로 변경하십시오.
10. 저항이 1GΩ을 통과하면 구성이 안정화될 때까지 ~30초가 걸릴 때까지 기다립니다. C-fast/Auto를 눌러 빠른 정전 용량을 보정합니다.
11. 전체 셀 모드를 형성하려면 주사기로 펄스가 짧지만 강력한 음압을 가하여 멤브레인을 파열시킵니다(전류 펄스의 모양은 충방전 멤브레인 커패시터로 변함). C-slow/Auto를 눌러 느린 정전 용량을 보정합니다.
12. 이미징 초점을 약간 조정하여 셀 바닥에 초점을 맞춥니다. 공초점 타임랩스 이미징과 패치 클램프 레코딩을 동시에 두 개의 서로 다른 소프트웨어 응용 프로그램에서 시작 버튼을 클릭하여 동시에 시작합니다 .
    참고: 공초점 이미징 소프트웨어는 ~20-90ms/frame의 속도로 동영상을 만듭니다. 패치-클램프 기록은 10초 동안의 휴식 상태, 1s 탈분극 자극, 및 자극 후 추가적인 49s를 포함한다. 패치 클램프 구성을 사용하면 -80mV ~ +10mV의 1s 탈분극으로 인한 칼슘 전류, 정전 용량 점프 및 감쇠를 기록할 수 있습니다(그림 3D).
13. 녹음이 완료되면 데이터가 저장되었는지 확인하십시오. 보유 전위를 다시 0mV로 변경합니다. 피펫을 욕조 용액에서 꺼내어 버리십시오.
14. 4.7-4.13단계를 반복하여 접시에 다른 셀을 기록합니다. 녹음 1 시간 후에 녹음을 위해 다른 접시로 변경하십시오.
    참고: 1시간 동안 녹음한 후 패치 클램프 녹화의 성공률이 크게 감소합니다. 데이터 수집의 효율성을 높이려면 각 접시에 1 시간 동안 만 기록하는 것이 좋습니다.

5. 패치 클램프 데이터 분석

1. 데이터 분석을 위해 적절한 소프트웨어( 자료 표 참조)를 엽니다. PPT |를 클릭하십시오. 펄스 파일 |로드 파일 단추를 사용하여 .dat 파일을 로드합니다. Do it 을 클릭하면 칼슘 전류와 커패시턴스 트레이스를 포함한 네 개의 트레이스가 하나의 그래프에 자동으로 플로팅됩니다.
2. 윈도우 |를 클릭하십시오. 새 그래프 단추, Pulse_1_1_1, Y 웨이브의 첫 번째 파동을 선택하고 수행 을 클릭하여 칼슘 전류 그래프를 플로팅합니다. 윈도우 |를 클릭하십시오. 새 테이블 단추, Pulse_1_1_1을 선택한 다음 수행 을 클릭하여 여러 세포의 평균 추적을 플로팅하는 데 사용할 수 있는 칼슘 전류의 원시 데이터를 표시합니다.
3. 칼슘 전류 그래프에 그에 따라 사각형을 그리고, 마우스 오른쪽 버튼을 클릭하고 칼슘 전류의 기준선 및 피크를 포함하도록 전류 신호를 확장 한다. 그래프 |를 클릭합니다. 정보를 표시하여 커서 A와 B를 표시하고 각각 기준선과 피크로 이동합니다. 그래프 정보는 하단에 표시되며 매개 변수를 추정 할 수 있습니다.
4. 5.2단계를 반복하되 Pulse_1_1_1_Cm, Y파의 두 번째 파동인 [Y파]를 선택하여 정전 용량 트레이스를 플로팅합니다. 5.3단계를 반복하고 A 및 B 커서를 적절한 위치에 배치하여 기준선, 진폭 및 감쇠율과 같은 정전용량 매개변수를 측정합니다.
5. 5.2단계의 원시 데이터를 스프레드시트에 복사하고, 기록된 세포 그룹에 대한 평균의 평균 및 표준 오차를 계산하고, 칼슘 전류 및 막 정전 용량의 평균 트레이스(그림 3E)를 적절한 소프트웨어에 플로팅합니다.

6. 공초점 영상 데이터 분석

1. 제조업체에서 제공하는 소프트웨어로 원시 이미징 파일을 엽니다( 재료 표 참조).
   참고: ImageJ 또는 Fiji와 같은 일부 다른 무료 프로그램은 데이터 처리 및 섹션 4에서 얻은 이미지를 정량화하는 데 사용될 수 있습니다.
2. 프로세스 |를 클릭합니다. ProcessTools 및 도구를 사용하여 각 타임랩스 이미지에 대한 롤링 평균(예: 4개 이미지마다 롤링 평균) 파일을 생성하고 해당 파일을 저장합니다.
   참고: 롤링 평균 후 밝기와 배경을 적절히 조정하여 세 채널의 형광 변화를 더 잘 나타낼 수 있으므로 융합 이벤트를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다. 융합 이벤트가 없는 일부 영역에서의 형광 강도를 확인하면 융합 이벤트의 형광 신호를 배경 신호와 구별하는 데 도움이 될 수 있다.
3. | 정량화 버튼을 클릭하십시오. 도구 | 스택 프로파일, 자극 전후의 시점을 확인하여 각 채널의 형광 변화를 확인한다. 타원 그리기 단추를 클릭하여 퓨전 이벤트의 관심 영역(ROI)을 원으로 돌립니다. 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭하고 ROI 저장을 클릭하여 ROI를 저장합니다.
   참고: 세 개의 형광 신호를 모두 커버하는 ROI의 크기는 크로마핀 세포⁽²⁴)의 소포 크기와 유사하였다. 원시 데이터가 분석에 사용되었고, 신호 대 잡음비를 증가시키는 롤링 평균 데이터가 제공되어 세 가지 신호를 명확하게 보여줍니다.
4. 프로젝트 열기를 클릭하여 원시 파일을 찾고 이미지를 마우스 오른쪽 버튼으로 클릭한 다음 ROI 로드를 클릭하여 원시 이미징 파일에 ROI 파일을 로드하여 형광 강도를 측정합니다.
   참고: 원시 형광 신호는 다른 채널의 흔적을 플로팅하는 데 사용됩니다. 각 ROI에 대해, 기준선은 자극 전의 강도로 정의되고, 강도 트레이스는 기준선으로 정규화될 수 있다.
5. 도구 |를 클릭합니다. 소프트웨어에서 ROI를 정렬하고 각 ROI의 세 채널 모두에 대한 추적을 플로팅합니다. 보고서를 클릭하여 각 ROI에 대한 디지털 데이터 및 이미징 트레이스를 포함한 ROI 데이터를 파일 폴더에 저장합니다.
   1. FFN511 스폿 형광 (F_FFN)의 감소를 수반하는 PH-mNG (F_PH) 및_{A655 (F 655}) 스팟 형광 (단일 프레임 내)의 강도의 동시 증가에 의한 융합 이벤트를 확인한다.
   2. 융합에 의해 생성 된_Ω 프로파일로 인한 PH-mNG / A655 스폿 형성을_{나타내는 F PH} 및 F 655의 외관을 찾아 원형질막에서 PH-mNG를 확산시키고 욕조에서 A655를 지속적으로 확산시킵니다.
   3. F_FFN 감소를 찾고, 이는 융합 기공 개방으로 인한 소포로부터의 그의 방출을 나타내고_{, F PH} 및_F655 출현이 엔도사이토시스에 의해 야기된 막 질내 손상으로부터 나타날 수 있다는 가능성을 배제한다.
   4. 셀 하단에서 발생하는 융합 이벤트를 보여주는 타임랩스 XY/Z_고정 이미지를 검사합니다. 융합 이벤트의 세 가지 모드를 분석하십시오 : 1) 근접 융합, 2) 스테이 퓨전, 3) 수축 융합.
      참고: 탈분극 전에는 융합 사건이 거의 관찰되지 않는 반면, 탈분극 후에는 수십 개의 융합 사건이 관찰될 수 있었다. 융합 후, Ω 프로파일은 기공을 닫거나, 열린 기공을 유지하거나, 수축하여 원형질막으로 병합 할 수 있습니다.
      1. 근접 융합을 식별하기 위해, 융합 기공 폐쇄가 욕조_A655 의 교환을 방해하기 때문에 F_PH 가 유지되는 반면, PtdIns(4,5)_P2 가 PtdIns(4)P로 계속 변환되거나 지연과 함께 F_PH 가 붕괴되어 소포 핀치 오프를 반영하기 때문에 F 655를 디밍하십시오 (근접 융합, 그림 4A, B).
      2. 체류-융합을 식별하기 위해 지속된 F_PH 및 F₆₅₅ 를 찾으십시오(그림 4C).
      3. 수축 융합을 식별하기 위해 Ω 프로파일 수축을 나타내는 F_PH 와 F₆₅₅의 평행 감소를 찾습니다(그림 4D).
         참고: 원본 이미징 파일을 확인하여 이벤트 유형이 확실하지 않은 경우 이미징 추적을 검사하십시오. 융합 이벤트가 없는 일부 영역에서 형광 강도를 확인하는 것은 융합 이벤트의 형광 신호를 배경 신호와 구별하는 데 도움이 될 수 있습니다.
6. 이 세 채널에 대한 강도 변화의 대표적인 흔적을 플로팅합니다: FFN511, PH-mNG 및 A655. 각 셀에서 서로 다른 융합 모드의 백분율을 정량화하고 수치를 플롯합니다.

결과

도 1 및 도 2에 도시된 실험 절차에 따라, 소 부신으로부터 크로마핀 세포를 PH-mNG로 형질감염시켜 원형질막을 표지하였다; A655를 융합 기공 폐쇄를 검출하기 위해 욕조 용액에 첨가하였고; 형광 거짓 신경전달물질 FFN511을 방출의 검출을 위해 소포에 로딩하였다. 다음으로, FFN511, PH-mNG 및 A655의 XY 평면 공초점 타임랩스 이미징을 세포 바닥에서 20-90 ms마다...

토론

공초점 현미경 이미징 방법은 융합 기공 및 송신기 방출의 역학뿐만 아니라 소 부신 크로마핀 세포^4,24에서 세 가지 융합 모드, 근접 융합^, 체류 융합 및 수축 융합을 검출하기 위해 설명됩니다. 세포를 탈분극시키고 이에 의해 엑소사이토시스 및 엔도사이토시스를 불러일으키는 전기생리학적 방법이 기재되어 있다. 체계적인 공초점 이미지 처리는 융합...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium salt	Sigma	A9187-500MG	ATP for preparing internal solution
Atto 655	ATTO-TEC GmbH	AD 655-21	Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary Neurons	Lonza	VSPI-1003	Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipette	Warner Instruments	64-0795	Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albumin	Sigma	A2153-50G	Reagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 M	Quality Biological	351-130-721	Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µm	Falcon	352360	Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solution	Sigma	232041	Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase P	Sigma	11213873001	Enzyme for gland digestion
Coverslip	Neuvitro	GG-14-Laminin	GG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-Glucose	Sigma	G8270-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEM	ThermoFisher Scientific	11885092	Reagent for preparing culture medium
EGTA	Sigma	324626-25GM	Reagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and Nucleofector	Amaxa Biosystems	Nucleofector II	Transfect plasmids into cells
Fetal bovine serum	ThermoFisher Scientific	10082147	Reagent for preparing culture medium
FFN511	Abcam	ab120331	Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrate	Sigma	G8877-250MG	GTP for preparing internal solution
HEPES	Sigma	H3375-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Igor Pro	WaveMetrics	Igor pro	Software for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X software	Leica	LAS X software	Confocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning Microscope	Leica	Leica TCS SP5	Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acid	Sigma	49449-100G	Reagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifier	Heka	Lock-in	Software for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 M	Quality Biological	351-033-721EA	Reagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-Line	Hausser Scientific	3120	Counting chamber
Microforge	Narishige	MF-830	Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm	Millipore	SLGPR33RB	Material for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)	Allele Biotechnology	ABP-FP-MNEONSB	Template for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micron	EIKO filtering co	03-100/32	Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10	Heka	EPC-10	Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFP	Addgene	Plasmid #51407	Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette puller	Sutter Instrument	P-97	Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium Chloride	Sigma	P5404-500G	Reagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse software	Heka	Pulse	Software for patch-clamp data collection
Recording chamber	Warner Instruments	64-1943/QR-40LP	coverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chloride	Sigma	S7653-1KG	Reagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxide	Sigma	S5881-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasic	Sigma	S0876-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasic	Sigma	S8282-500G	Reagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plate	Barnsted/Thermolyne	type 10100	Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mL	Becton Dickinson	302832	Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chloride	Sigma	T2265-100G	TEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitor	Sigma	T9253-5G	Reagent for gland digestion
Type F Immersion liquid	Leica	195371-10-9	Leica confocal mounting oil