JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол описывает метод конфокальной визуализации для обнаружения трех режимов слияния в хромаффинных клетках надпочечников крупного рогатого скота. Эти режимы слияния включают в себя 1) тесное слияние (также называемое поцелуем и бегом), включающее открытие и закрытие пор слияния, 2) слияние пор, включающее открытие пор слияния и поддержание открытой поры, и 3) термоядерное слияние, включающее усадку плавленого пузырька.

Аннотация

Динамическое сращение пор, открытие и закрытие опосредуют экзоцитоз и эндоцитоз и определяют их кинетику. Здесь подробно показано, как конфокальная микроскопия использовалась в сочетании с записью патч-зажима для обнаружения трех режимов слияния в первичной культуре хромафинных клеток надпочечников крупного рогатого скота. Три режима синтеза включают в себя 1) близкий синтез (также называемый поцелуем и бегом), включающий открытие и закрытие пор синтеза, 2) термоядерный синтез, включающий открытие пор синтеза и поддержание открытой поры, и 3) термоусадочный синтез, включающий усадку профиля Ω формы, генерируемого синтезом, пока он полностью не сольется в плазматической мембране.

Для обнаружения этих режимов слияния плазматическую мембрану мечили путем сверхэкспрессии mNeonGreen, присоединенного к PH-домену фосфолипазы C δ (PH-mNG), который связывается с фосфатидилинозитол-4,5-бисфосфатом (PtdIns(4,5)P2) на цитозольном листке плазматической мембраны; везикулы нагружали флуоресцентным ложным нейротрансмиттером FFN511 для обнаружения высвобождения везикулярного содержимого; и Atto 655 был включен в раствор ванны для обнаружения закрытия пор слияния. Эти три флуоресцентных зонда были изображены одновременно со скоростью ~ 20-90 мс на кадр в живых хромаффинных клетках для обнаружения открытия пор слияния, высвобождения содержимого, закрытия пор слияния и изменения размера пузырьков плавления. Описан метод анализа, чтобы отличить три режима синтеза от этих флуоресцентных измерений. Метод, описанный здесь, может, в принципе, применяться ко многим секреторным клеткам за пределами хромаффинных клеток.

Введение

Слияние мембран опосредует многие биологические функции, включая синаптическую передачу, гомеостаз глюкозы в крови, иммунный ответ и проникновение вируса 1,2,3. Экзоцитоз, включающий слияние пузырьков на плазматической мембране, высвобождает нейротрансмиттеры и гормоны для достижения многих важных функций, таких как активность нейронной сети. Слияние открывает пору для высвобождения везикулярного содержимого, после чего пора может закрыться, чтобы извлечь сливающийся пузырь, который называется поцелуем и бегом 1,4. Как необратимое, так и обратимое открытие пор слияния может быть измерено с помощью прикрепленных к клеткам емкостных записей в сочетании с записями проводимости пор слияния одиночных пузырьков.

Это часто интерпретируется как отражение полного коллапса слияния, включающего расширение слияния до сплющивания плавящегося пузырька, и поцелуй и бег, включающий открытие и закрытие пор слияния, соответственно 5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Недавние исследования конфокальной и стимулированной эмиссионной недостаточности (STED) в хромаффинных клетках непосредственно наблюдали открытие и закрытие пор слияния (kiss-and-run, также называемое близким слиянием), открытие пор слияния, которое поддерживает форму Ω с открытой порой в течение длительного времени, терминальное стай-слияние и сжатие плавящегося пузырька до тех пор, пока он полностью не сольется с плазматической мембраной, которая заменяет полный коллапс слияния для слияния плавящихся пузырьков с плазматической мембраной4, 8,14,15,16,17.

В нейронах открытие и закрытие пор слияния были обнаружены с помощью визуализации, показывающей высвобождение квантовых точек, предварительно загруженных в везикулы, которые больше, чем пора слияния, и с измерениями проводимости пор слияния на поверхности высвобождения нервных окончаний 5,18,19. Хромаффинные клетки надпочечников широко используются в качестве модели для изучения экзо- и эндоцитоза20,21. Хотя хромаффинные клетки содержат большие везикулы с плотным ядром, тогда как синапсы содержат небольшие синаптические везикулы, белки экзоцитоза и эндоцитоза в хромафинных клетках и синапсах весьма аналогичны 10,11,12,20,21,22,23.

Здесь описан способ измерения этих трех режимов слияния с использованием конфокального метода визуализации в сочетании с электрофизиологией в хромаффинных клетках надпочечников крупного рогатого скота (рисунок 1). Этот метод включает загрузку флуоресцентных ложных нейротрансмиттеров (FFN511) в везикулы для выявления экзоцитоза; добавление Atto 655 (A655) в раствор ванны для заполнения сгенерированного слиянием Ω-образного профиля и маркировка плазматической мембраны с доменом PH фосфолипазы C δ (PH), который связывается с PtdIns(4,5)P2 на плазматической мембране 8,15,24. Динамика пор синтеза может быть обнаружена путем изменения различных интенсивностей флуоресцентной жидкости. Несмотря на то, что принцип этого метода описан для хромаффинных клеток, описанный здесь, может быть широко применен ко многим секреторным клеткам далеко за пределами хромаффинных клеток.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Процедура использования животных соответствовала руководящим принципам NIH и была одобрена Комитетом по уходу и использованию животных NIH.

1. Культура хромафиновых клеток крупного рогатого скота

  1. Приготовьте раствор Локка (таблица 1) и инструменты автоклава за 1 день до посева хромаффинных клеток.
  2. Достаньте надпочечники крупного рогатого скота с местной скотобойни в день культивирования и держите их погруженными в ледяной раствор Локка перед рассечением.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Надпочечники от 21-27-месячного возраста, здоровые, черные ангусы любого пола (в основном мужчины) с массой тела около 1 400 фунтов (~ 635 кг).
  3. Перед рассечением готовят 30 мл (на 3 надпочечника) свежего раствора фермента, содержащего коллагеназу Р, ингибитор трипсина и сывороточный альбумин крупного рогатого скота (таблица 1), и держат при комнатной температуре.
  4. Выберите 3 неповрежденные железы без порезов или кровотечений на поверхности и удалите жировую ткань ножницами (рисунок 1А). Промыть железы перфузией раствором Локка до тех пор, пока не выйдет кровь. Чтобы достичь этого, раздуйте железу через надпочечниковую вену (рисунок 1B) с помощью шприца объемом 30 мл, прикрепленного с фильтром 0,22 мкм столько раз, сколько необходимо25.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 150 мл раствора Локка обычно требуется для промывки 3 желез.
  5. Для пищеварения вводят раствор фермента через надпочечниковую вену, используя шприц объемом 30 мл, прикрепленный фильтром 0,22 мкм, пока железа не начнет набухать. Затем оставьте железы при 37 °C в течение 10 мин. Ввести еще раз и оставить железы при 37 °C еще на 10 мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Приблизительно 30 мл ферментного раствора необходимо для переваривания 3 желез.
  6. После пищеварения разрезают железу продольно от вены к другому концу ножницами, чтобы развернуть железу (рисунок 1С). Изолируйте медуллы, вытащив белый продолговатый мозг в 10-сантиметровую чашку Петри, содержащую раствор Локка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Сравнение внутренней части железы до и после пищеварения показано на рисунке 1С. Подробности пищеварения и выделения медул ранее сообщали23,25.
  7. Разрежьте и измельчите продолговатый мозг ножницами на мелкие кусочки (рисунок 1D). Отфильтруйте суспензию продолговатого мозга нейлоновой сеткой 80-100 мкм в стакан. Затем переложите фильтрат на коническую трубку объемом 50 мл для центрифугирования при 48 × г, комнатной температуры, в течение 3 мин с замедлением 3.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Измельчение медуллов обычно занимает ~10 минут. Чтобы получить хороший выход клеток, измельченные кусочки должны быть очень маленькими, пока их нельзя будет поднять.
  8. После центрифугирования удалите супернатант и повторно суспендируйте гранулу ячейки раствором Локка путем пипетирования. Фильтруют клеточную суспензию с помощью ситечка 80-100 мкм и центрифуги при 48 х г, комнатной температуры, в течение 3 мин с замедлением 3.
  9. Удалить супернатант и повторно суспендировать клеточную гранулу с 30 мл питательной среды (табл. 1). Определите номер ячейки с помощью гемацитометра счетных камер25.

2. Трансфекция с электропорацией

  1. Переложите 2,8 × 106 клеток в трубку объемом 15 мл. Гранулируют клетки центрифугированием при 48 × г в течение 2 мин с замедлением 3. Добавьте 100 мкл трансфекционного буфера (см. Таблицу материалов), предоставленного производителем, к грануле клетки, а затем добавьте 2 мкг плазмиды PH-mNG.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Плазмида PH-mNG была создана путем замены усиленного зеленого флуоресцентного белка (EGFP) на mNG в PH-EGFP15 (см. Таблицу материалов).
  2. Осторожно перемешайте суспензию, пипетируя раствор вверх и вниз, и без задержки переложите смесь в электропорационную кювету (рисунок 1Е). Немедленно перенесите кювету на электропоратор (см. Таблицу материалов), выберите программу O-005 в списке экрана и нажмите Enter для выполнения электропорации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Подготовьте клеточную суспензию к трансфекции в вытяжке клеточной культуры. Не вводите пузырьки воздуха в суспензию на этапе перемешивания. Переходите к следующему шагу без промедления.
  3. После электропорации сразу же добавьте 1,8 мл среды в кювету и аккуратно перемешайте с микропипеттором, оснащенным стерильным наконечником. Затем добавляют 300 мкл суспензии электропорированных ячеек поверх крышки (см. Таблицу материалов) в каждую посуду, покрывая в общей сложности 5-6 тарелок для одной реакции электропорации.
  4. Осторожно переложите посуду в увлажненный инкубатор при 37 °C с 9% CO2 в течение 30 мин, и осторожно добавляйте 2 мл предварительно расплавленной среды к каждому блюду через 30 мин.
  5. Храните трансфектированные клетки в увлажненном инкубаторе при 37 °C с 9% CO2 в течение 2-3 дней до эксперимента.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Культивируемых клеток хватит на неделю. Лучше всего использовать культивируемые клетки на 2-3 день.

3. Подготовка к записи зажимов и конфокальной визуализации

ПРИМЕЧАНИЕ: Этот протокол выполнялся с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа и патч-зажимного усилителя с записью зажима напряжения вместе с запирающим усилителем для записи емкости. Конфокальная визуализация плоскости XY на фиксированной Z-плоскости (фиксированное сканирование XY / Z) использовалась для одновременного изображения всех трех флуоресцентных сигналов. Z-плоскость была сфокусирована на дне клетки, где плазматическая мембрана прилипала к покровам.

  1. В день эксперимента по зажиму пластыря и визуализации наблюдайте за клетками под флуоресцентным микроскопом. Используйте brightfield, чтобы убедиться, что клеточная культура не загрязнена (рисунок 1F), и эпифлуоресценцию, чтобы проверить правильную экспрессию флуоресцентного белка.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Например, PH-mNG экспрессируется на плазматической мембране ~20-30% клеток.
  2. Приготовьте пластырные пипетки из боросиликатных стеклянных капилляров. Для этого потяните пипетки с помощью пипетки, покройте их кончики жидким воском, а также отполируйте их микроклепкой (см. Таблицу материалов).
  3. Включите усилитель записи патч-зажима и запустите программное обеспечение для записи патч-зажима (см. Таблицу материалов). Установите соответствующие параметры для регистрации тока кальция и емкости в программном обеспечении (см. Таблицу материалов).
    1. Установите протокол записи общей продолжительностью 60 с, где стимуляция начинается с 10 с.
    2. Установите удерживающий потенциал для записи зажима напряжения на -80 мВ. Устанавливают деполяризацию за 1 с от -80 мВ до 10 мВ в качестве стимула для индуцирования притока кальция и скачка емкости.
    3. Для измерения емкости устанавливают частоту синусоидального раздражителя в диапазоне 1000-1 500 Гц при пиковом напряжении не более 50 мВ.
  4. Сохраните протокол и создайте новый файл для записи.
  5. Включите систему конфокального микроскопа и задайте соответствующие параметры в программном обеспечении (см. Таблицу материалов).
    1. Включите лазеры, в том числе 458 нм, 514 нм и 633 нм, и установите диапазон сбора излучения для каждого лазера в соответствии с каждым флуоресцентным зондом, как показано ниже. FFN511: длина волны возбуждения (EX), 458 нм; длина волны излучения (ЭМ), 468-500 нм. мНГ: EX, 514 нм; ЭМ, 524-560 нм. A655: EX, 633 нм; ЭМ, 650-700 нм.
    2. Используйте последовательную визуализацию для FFN511 и mNG, чтобы избежать перекрестных помех между этими двумя зондами. Установите таймлапс длительностью 1 мин для записи изображения (рисунок 1G).

4. Запись патч-зажима и конфокальная визуализация

  1. Выберите блюдо с хорошим состоянием клеток и правильной экспрессией и добавьте в среду 2 мкл флуоресцентного ложного нейротрансмиттера FFN511 (запас 10 мМ, рабочий раствор 1:1000). Поставьте блюдо обратно в инкубатор на 20 минут. Кроме того, загрузите FFN511 после шага 3.2 и выполните шаги 3.3-3.5 в ожидании, чтобы сэкономить время.
  2. После завершения загрузки FFN511 подготовьте регистрирующую камеру и добавьте 2 мкл флуоресцентного красителя A655 в 500 мкл раствора ванны (фиг.2A и таблица 1). Переложите крышку с тарелки в записывающую камеру (см. Таблицу материалов) пинцетом, и сразу же добавьте раствор для ванны, содержащий А655 (рисунок 2В).
    ПРИМЕЧАНИЕ: A655 выдерживается при -20 °C с концентрацией 10 мМ, а рабочая концентрация составляет 40 мкМ.
    ВНИМАНИЕ: Надевайте перчатки, чтобы избежать прямого контакта кожи с FFN511 или A655.
  3. Поместите каплю масла (показатель преломления: 1,518; см. Таблицу материалов) на 100-кратный цель погружения масла (числовая диафрагма = 1,4). Установите камеру в микроскоп и используйте регуляторную ручку, чтобы масло просто соприкоснулось с нижней частью крышки, а затем погрузите наконечник заземляющей проволоки в раствор ванны (рисунок 2C, D).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите иммерсионное масло, подходящее для работы при комнатной температуре. Переключение между объективом с низким и большим увеличением не требуется. Температура в помещении поддерживается около 20-22 °C во время записи.
  4. Поместите клетки в фокус и используйте яркую и конфокальную визуализацию, чтобы найти хорошую клетку с экспрессией mNG. Увеличьте масштаб выделенной ячейки и отрегулируйте ее в центре представления, чтобы свернуть пустые области.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Схематический рисунок флуоресцентной маркировки показан на рисунке 3А. Хорошая клетка обычно имеет гладкую мембрану и чистый край (рисунок 3B). При эпифлуоресценции или конфокальной визуализации хорошая клетка, по-видимому, имеет большое и плоское дно с яркой экспрессией mNG (рисунок 3C).
    Размер пикселя составляет ~ 50 нм, в диапазоне ~ 40-80 нм в зависимости от размера ячейки и коэффициента масштабирования.
  5. Настройка параметров конфокальной визуализации плоскости XY на фиксированной Z-плоскости (фиксированное сканирование XY/Z) FFN511, PH-mNG и A655 с минимальным интервалом времени. Отрегулируйте фокусировку в нижней части ячейки с помощью ручки тонкой регулировки.
    ПРИМЕЧАНИЕ: PH-mNG сигнализирует контур клеточной плазматической мембраны при конфокальной поперечной XY-плоскости (кроме дна клетки). Вблизи дна клеточной мембраны можно наблюдать пятна A655, которые отражают Ω или Λ-образные мембранные инвагинации. Если Z-фокальная плоскость ниже дна ячейки, интенсивность всей флуоресценции станет слабее.
  6. Отрегулируйте мощность лазера возбуждения в программном обеспечении, чтобы найти настройку, чтобы получить наилучшее соотношение сигнал/шум и избежать значительного флуоресцентного отбеливания. Для этого начните с начального испытательного значения мощности 2,5 мВт для FFN511, возбужденного при 458 нм и 1 мВт для мНГ, возбужденного при 514 нм. Для A655, возбуждаемого при 633 нм с помощью heNe-лазера, используйте высокую мощность лазера, ~12-15 мВт (т.е. 70%-80% от максимума), который при непрерывном возбуждении может отбеливать весь флуоресцентный A655 внутри профиля Ω формы, когда его поры закрыты.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если мощность лазера слишком высока, флуоресценция PH-mNG и FFN511 будет быстро отбелена. Если мощность лазера слишком низкая, сигналы будут слишком слабыми или шумными для анализа.
  7. Добавьте 9 мкл внутреннего раствора (таблица 1) в патч-пипетку и прикрепите пипетку к держателю в каскаде усилителя с патч-зажимом (см. Таблицу материалов).
  8. Нанесите небольшое количество положительного давления шприцем и переместите кончик пипетки, чтобы коснуться раствора ванны с помощью микроманипулятора. Убедитесь, что усилитель показывает, что сопротивление пипетки составляет ~2-4 МОм с помощью импульсного теста напряжения. Нажмите LJ/Auto , чтобы отменить соединение жидкости.
  9. Переместите пипетку к выбранной ячейке с помощью микроманипулятора. Чтобы сформировать режим прикрепления к ячейке, переместите кончик пипетки, чтобы коснуться ячейки (сопротивление увеличится); Осторожно применяя шприцем отрицательное давление (сопротивление увеличится до более чем 1 ГОм), изменяйте удерживающий потенциал от 0 до -80 мВ.
  10. Как только сопротивление превысит 1 ГОм, подождите ~ 30 с, пока конфигурация стабилизируется. Нажмите C-fast/Auto , чтобы компенсировать быструю емкость.
  11. Чтобы сформировать полноклеточный режим, примените импульсное короткое, но мощное отрицательное давление шприцем для разрыва мембраны (форма импульса тока изменяется с помощью заряженного и разряженного мембранного конденсатора). Нажмите C-slow/Auto , чтобы компенсировать медленную емкость.
  12. Слегка отрегулируйте фокус изображения, чтобы сфокусироваться на нижней части ячейки. Начните конфокальную временную визуализацию и запись патч-зажима одновременно, нажав кнопки Пуск в двух разных программных приложениях одновременно.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Конфокальное программное обеспечение для визуализации делает фильм со скоростью ~ 20-90 мс / кадр. Запись патч-зажима включает в себя состояние покоя в течение 10 с, стимуляцию деполяризации 1 с и дополнительные 49 с после стимуляции. Конфигурация патч-зажим позволяет регистрировать ток кальция, скачок емкости и распад, вызванные деполяризацией 1 с от -80 до +10 мВ (рисунок 3D).
  13. После завершения записи убедитесь, что данные сохранены. Измените потенциал удержания обратно на 0 мВ. Выдвиньте пипетку из раствора ванны и выбросьте ее.
  14. Повторите шаги 4.7-4.13, чтобы записать еще одну ячейку в чашке. После 1 ч записи перейдите на другое блюдо для записи.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После 1 ч записи показатель успешности записи патч-зажима значительно снижается. Для повышения эффективности сбора данных в каждом блюде рекомендуется запись всего за 1 ч.

5. Анализ данных патч-зажима

  1. Откройте соответствующее программное обеспечение (см. Таблицу материалов) для анализа данных. Нажмите на | PPT Загрузить файл PULSE | Кнопки файла для загрузки .dat файла. Нажмите «Сделать», и четыре следа будут автоматически нанесены на один график, включая следы тока кальция и емкости.
  2. Щелкните | Windows Кнопки «Новый график », выберите Pulse_1_1_1, первую волну в Y Wave(s), и нажмите « Сделать это », чтобы построить график тока кальция. Щелкните | Windows Кнопки «Новая таблица», выберите Pulse_1_1_1 и нажмите кнопку «Сделать», чтобы отобразить необработанные данные о токе кальция, которые можно использовать для построения усредненного следа нескольких клеток.
  3. Нарисуйте квадрат соответственно на графике тока кальция, щелкните правой кнопкой мыши и разверните текущий сигнал, чтобы включить базовую линию и пик тока кальция. Щелкните график | Показать информацию , чтобы отобразить курсоры A и B и переместить их на базовую линию и пик соответственно. Информация о графике будет показана внизу и параметры могут быть оценены.
  4. Повторите шаг 5.2, но выберите Pulse_1_1_1_Cm, вторую волну в Y Wave(s), чтобы построить след емкости. Повторите шаг 5.3 и поместите курсоры A и B в соответствующее положение для измерения параметров емкости, таких как базовая линия, амплитуда и скорость затухания.
  5. Скопируйте необработанные данные на шаге 5.2 в электронную таблицу, рассчитайте среднюю и стандартную погрешность среднего значения для группы зарегистрированных клеток и постройте усредненные следы тока кальция и емкости мембраны (рисунок 3E) в соответствующем программном обеспечении.

6. Конфокальный анализ данных визуализации

  1. Откройте необработанные файлы изображений с помощью любого программного обеспечения, поставляемого производителем (см. Таблицу материалов).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Некоторые другие бесплатные программы, такие как ImageJ или Fiji, могут быть использованы для обработки данных и количественной оценки изображений, полученных в разделе 4.
  2. Нажмите обработать | ProcessTools и используйте инструменты для генерации скользящего среднего (например, скользящего среднего для каждых 4 изображений) файлов для каждого образа таймлапса и сохранения этих файлов.
    ПРИМЕЧАНИЕ: После скользящего среднего может быть выполнена соответствующая регулировка яркости и фона, чтобы лучше показать флуоресцентные изменения трех каналов, что может помочь идентифицировать события синтеза. Проверка интенсивности флуоресцентной жидкости в некоторых регионах без события синтеза может помочь отличить флуоресцентный сигнал событий синтеза от фоновых сигналов.
  3. Нажмите кнопки Количественная оценка | Инструменты | Stack Profile, проверка временных точек до и после стимуляции для выявления флуоресцентных изменений в каждом канале. Нажмите кнопку Нарисовать эллипс , чтобы обвести интересующие области (ROI) для событий слияния. Щелкните правой кнопкой мыши на изображении и выберите Сохранить ROI , чтобы сохранить ROI.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Размер ROI, который охватывает все три флуоресцентных сигнала, был аналогичен размеру везикул в хромаффинных клетках24. Для анализа использовались необработанные данные, в то время как скользящие усреднения, которые увеличивают отношение сигнал/шум, были предоставлены, чтобы четко показать три сигнала.
  4. Щелкните Открыть проекты , чтобы найти необработанный файл, щелкните правой кнопкой мыши изображение и выберите Загрузить ROI , чтобы загрузить файл ROI в необработанные файлы изображений для измерения интенсивности флуоресценции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Необработанный флуоресцентный сигнал будет использоваться для построения следов различных каналов. Для каждого ROI базовый уровень определяется как интенсивность перед стимуляцией, а следы интенсивности могут быть нормализованы до базового уровня.
  5. Нажмите Инструменты | Сортируйте ROI в программном обеспечении и стройте трассировки для всех трех каналов каждого ROI. Щелкните Отчет , чтобы сохранить данные о рентабельности инвестиций, включая цифровые данные и трассировки изображений для каждой окупаемости инвестиций, в папку с файлами.
    1. Идентифицировать событие синтеза путем одновременного увеличения интенсивности точечной флуоресценции PH-mNG (FPH) иA655 (F 655) (в пределах одного кадра), сопровождаемого уменьшением точечной флуоресценции FFN511 (FFFN).
    2. Обратите внимание на появление FPH и F655, что указывает на образование пятен PH-mNG / A655 из-за Ω-профиля, генерируемого слиянием, что позволяет диффузию PH-mNG из плазматической мембраны и стойкую диффузию A655 из ванны.
    3. Обратите внимание на снижение FFFN , которое указывает на его высвобождение из пузырька из-за открытия пор слияния и исключает возможность того, что появление FPH и F655 может быть вызвано инвагинацией мембраны, вызванной эндоцитозом.
    4. Проверьтефиксированные изображения XY/Z, которые показывают события слияния, происходящие в нижней части ячейки. Проанализируйте три режима событий синтеза: 1) близкий синтез, 2) остаточный синтез и 3) термоядерный синтез.
      ПРИМЕЧАНИЕ: События синтеза редко наблюдались до деполяризации, тогда как десятки событий синтеза можно было наблюдать после деполяризации. После слияния Ω-профиль может закрывать поры, поддерживать открытую пору или сжиматься, чтобы слиться с плазматической мембраной.
      1. Чтобы идентифицировать близкий синтез, ищите затемнение F655, поскольку закрытие пор слияния предотвращает обмен ванны A655, в то время как FPH поддерживается, отражая продолжающееся превращение PtdIns(4,5)P2 в PtdIns(4)P, или FPH распадается с задержкой, отражая защемление пузырьков (близкий синтез, рисунок 4A,B).
      2. Ищите устойчивые FPH и F655 для идентификации остаточного слияния (рисунок 4C).
      3. Ищите параллельные снижения FPH и F655, указывающие на усадку профиля Ω, чтобы идентифицировать термоусадочный синтез (рисунок 4D).
        ПРИМЕЧАНИЕ: Проверьте исходные файлы изображений, чтобы проверить следы изображений, если они не уверены в типе события. Проверка интенсивности флуоресцентной жидкости в некоторых регионах без события синтеза может помочь отличить флуоресцентный сигнал событий синтеза от фоновых сигналов.
  6. График репрезентативных следов изменений интенсивности для этих трех каналов: FFN511, PH-mNG и A655. Количественно оцените процент различных режимов слияния в каждой ячейке и нарисуйте фигуры.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Результаты

После экспериментальных процедур, показанных на рисунке 1 и рисунке 2, хромаффинные клетки из бычьих надпочечников трансфектировали PH-mNG для маркировки плазматической мембраны; A655 добавляли в раствор ванны для обнаружения сращивания порового закрытия; ?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Обсуждение

Описан конфокальный микроскопический метод визуализации для обнаружения динамики слияния пор и высвобождения трансмиттера, а также трех режимов слияния: близкого слияния, остаточного слияния и усадки-слияния в хромафинных клетках надпочечников крупного рогатого скота <...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Раскрытие информации

У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.

Благодарности

Мы благодарим программы внутренних исследований NINDS (ZIA NS003009-13 и ZIA NS003105-08) за поддержку этой работы.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
Adenosine 5'-triphosphate magnesium saltSigmaA9187-500MGATP for preparing internal solution
Atto 655ATTO-TEC GmbHAD 655-21Atto dye to label bath solution
Basic Nucleofector for Primary NeuronsLonzaVSPI-1003Electroporation transfection buffer along with kit
Boroscilicate capillary glass pipetteWarner Instruments64-0795Standard wall with filament OD=2.0 mm ID=1.16 mm Length=7.5 cm
Bovine serum albuminSigmaA2153-50GReagent for gland digestion
Calcium Chloride 2 MQuality Biological351-130-721Reagent for preparing bath solution
Cell Strainers, 100 µmFalcon352360Material for filtering chromaffin cell suspension
Cesium hydroxide solutionSigma232041Reagent for preparing internal solution and Cs-glutamate/Cs-EGTA stock buffer
Collagenase PSigma11213873001Enzyme for gland digestion
CoverslipNeuvitroGG-14-LamininGG-14-Laminin, 14 mm dia.#1 thick 60 pieces Laminin coated German coverslips
D-(+)-GlucoseSigmaG8270-1KGReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
DMEMThermoFisher Scientific11885092Reagent for preparing culture medium
EGTASigma324626-25GMReagent for preparing Cs-EGTA stock buffer for bath solution
Electroporation and NucleofectorAmaxa BiosystemsNucleofector IITransfect plasmids into cells
Fetal bovine serumThermoFisher Scientific10082147Reagent for preparing culture medium
FFN511Abcamab120331Fluorescent false neurotransmitter to label vesicles
Guanosine 5'-triphosphate sodium salt hydrateSigmaG8877-250MGGTP for preparing internal solution
HEPESSigmaH3375-500GReagent for preparing Locke’s solution
Igor ProWaveMetricsIgor proSoftware for patch-clamp analysis and imaging data presentation
Leica Application Suite X softwareLeicaLAS X softwareConfocal software for imaging data collection and analysis
Leica TCS SP5 Confocal Laser Scanning MicroscopeLeicaLeica TCS SP5Confocal microscope for imaging data collection
L-Glutamic acidSigma49449-100GReagent for preparing Cs-glutamate stock buffer for bath solution
Lock-in amplifierHekaLock-inSoftware for capacitance recording
Magnesium Chloride 1 MQuality Biological351-033-721EAReagent for preparing internal solution and bath solution
Metallized Hemacytometer Hausser Bright-LineHausser Scientific3120Counting chamber
MicroforgeNarishigeMF-830Polish pipettes to enhance the formation and stability of giga-ohm seals
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µmMilliporeSLGPR33RBMaterial for glands wash and digestion
mNG(mNeonGreen)Allele BiotechnologyABP-FP-MNEONSBTemplate for PH-mNeonGreen construction
Nylon mesh filtering screen 100 micronEIKO filtering co03-100/32Material for filtering medulla suspension
Patch clamp EPC-10HekaEPC-10Amplifier for patch-clamp data collection
PH-EGFPAddgenePlasmid #51407Backbone for PH-mNeonGreen construction
Pipette pullerSutter InstrumentP-97Make pipettes for patch-clamp recording
Potassium ChlorideSigmaP5404-500GReagent for preparing Locke’s solution and bath solution
Pulse softwareHekaPulseSoftware for patch-clamp data collection
Recording chamberWarner Instruments64-1943/QR-40LPcoverslip chamber, apply patch-clamp pipette on live cells
Sodium chlorideSigmaS7653-1KGReagent for preparing Locke’s solution, bath solution and internal solution
Sodium hydroxideSigmaS5881-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate dibasicSigmaS0876-500GReagent for preparing Locke’s solution
Sodium phosphate monobasicSigmaS8282-500GReagent for preparing Locke’s solution
Stirring hot plateBarnsted/Thermolynetype 10100Heater for pipette coating with wax
Syringe, 30 mLBecton Dickinson302832Material for glands wash and digestion
Tetraethylammonium chlorideSigmaT2265-100GTEA for preparing bath solution
Trypsin inhibitorSigmaT9253-5GReagent for gland digestion
Type F Immersion liquidLeica195371-10-9Leica confocal mounting oil

Ссылки

  1. Wu, L. G., Hamid, E., Shin, W., Chiang, H. C. Exocytosis and endocytosis: modes, functions, and coupling mechanisms. Annual Review of Physiology. 76, 301-331 (2014).
  2. Chang, C. W., Chiang, C. W., Jackson, M. B. Fusion pores and their control of neurotransmitter and hormone release. Journal of General Physiology. 149 (3), 301-322 (2017).
  3. Harrison, S. C. Viral membrane fusion. Nature Structural & Molecular Biology. 15 (7), 690-698 (2008).
  4. Zhao, W. D., et al. Hemi-fused structure mediates and controls fusion and fission in live cells. Nature. 534 (7608), 548-552 (2016).
  5. Klyachko, V. A., Jackson, M. B. Capacitance steps and fusion pores of small and large-dense-core vesicles in nerve terminals. Nature. 418 (6893), 89-92 (2002).
  6. Albillos, A., et al. The exocytotic event in chromaffin cells revealed by patch amperometry. Nature. 389 (6650), 509-512 (1997).
  7. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  8. Chiang, H. C., et al. Post-fusion structural changes and their roles in exocytosis and endocytosis of dense-core vesicles. Nature Communications. 5, 3356(2014).
  9. Sharma, S., Lindau, M. The fusion pore, 60 years after the first cartoon. Federation of European Biochemical Societies Letters. 592 (21), 3542-3562 (2018).
  10. Jorgacevski, J., et al. Munc18-1 tuning of vesicle merger and fusion pore properties. Journal of Neuroscience. 31 (24), 9055-9066 (2011).
  11. Rituper, B., et al. Vesicle cholesterol controls exocytotic fusion pore. Cell Calcium. 101, 102503(2021).
  12. Gucek, A., et al. Dominant negative SNARE peptides stabilize the fusion pore in a narrow, release-unproductive state. Cellular and Molecular Life Sciences. 73 (19), 3719-3731 (2016).
  13. Grabner, C. P., Moser, T. Individual synaptic vesicles mediate stimulated exocytosis from cochlear inner hair cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 115 (50), 12811-12816 (2018).
  14. Wen, P. J., et al. Actin dynamics provides membrane tension to merge fusing vesicles into the plasma membrane. Nature Communications. 7, 12604(2016).
  15. Shin, W., et al. Visualization of Membrane Pore in Live Cells Reveals a Dynamic-Pore Theory Governing Fusion and Endocytosis. Cell. 173 (4), 934-945 (2018).
  16. Shin, W., et al. Vesicle Shrinking and Enlargement Play Opposing Roles in the Release of Exocytotic Contents. Cell Reports. 30 (2), 421-431 (2020).
  17. Ge, L., Shin, W., Wu, L. -G. Visualizing sequential compound fusion and kiss-and-run in live excitable cells. bioRxiv. , (2021).
  18. Zhang, Q., Li, Y., Tsien, R. W. The dynamic control of kiss-and-run and vesicular reuse probed with single nanoparticles. Science. 323 (5920), 1448-1453 (2009).
  19. He, L., Wu, X. S., Mohan, R., Wu, L. G. Two modes of fusion pore opening revealed by cell-attached recordings at a synapse. Nature. 444 (7115), 102-105 (2006).
  20. Androutsellis-Theotokis, A., Rubin de Celis, M. F., Ehrhart-Bornstein, M., Bornstein, S. R. Common features between chromaffin and neural progenitor cells. Molecular Psychiatry. 17 (4), 351(2012).
  21. Bornstein, S. R., et al. Chromaffin cells: the peripheral brain. Molecular Psychiatry. 17 (4), 354-358 (2012).
  22. Park, Y., Kim, K. T. Short-term plasticity of small synaptic vesicle (SSV) and large dense-core vesicle (LDCV) exocytosis. Cellular Signalling. 21 (10), 1465-1470 (2009).
  23. Thahouly, T., et al. Bovine Chromaffin Cells: Culture and Fluorescence Assay for Secretion. Exocytosis and Endocytosis. Methods in Molecular Biology. Niedergang, F., Vitale, N., Gasman, S., et al. 2233, Springer US. (2021).
  24. Shin, W., et al. Preformed Omega-profile closure and kiss-and-run mediate endocytosis and diverse endocytic modes in neuroendocrine chromaffin cells. Neuron. 109 (19), 3119-3134 (2021).
  25. O'Connor, D. T., et al. Primary culture of bovine chromaffin cells. Nature Protocols. 2 (5), 1248-1253 (2007).
  26. Wu, X. S., et al. Membrane Tension Inhibits Rapid and Slow Endocytosis in Secretory Cells. Biophysical Journal. 113 (11), 2406-2414 (2017).
  27. Revelo, N. H., et al. A new probe for super-resolution imaging of membranes elucidates trafficking pathways. Journal of Cell Biology. 205 (4), 591-606 (2014).
  28. Gao, J., Liao, J., Yang, G. -Y. CAAX-box protein, prenylation process and carcinogenesis. American journal of translational research. 1 (3), 312-325 (2009).
  29. Schermelleh, L., et al. Super-resolution microscopy demystified. Nature Cell Biology. 21 (1), 72-84 (2019).
  30. Ceccarelli, B., Hurlbut, W. P., Mauro, A. Depletion of vesicles from frog neuromuscular junctions by prolonged tetanic stimulation. Journal of Cell Biology. 54 (1), 30-38 (1972).
  31. Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM). Nature Methods. 3 (10), 793-795 (2006).
  32. Betzig, E., et al. Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution. Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).
  33. Fish, K. N. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Current Protocols in Cytometry. , Chapter 12 Unit12 18(2009).
  34. Schmidt, R., et al. MINFLUX nanometer-scale 3D imaging and microsecond-range tracking on a common fluorescence microscope. Nature Communications. 12 (1), 1478(2021).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены