JoVE Logo
发表
联系我们

登录

需要订阅 JoVE 才能查看此. 登录或开始免费试用。

本文内容

  • 摘要
  • 摘要
  • 引言
  • 研究方案
  • 结果
  • 讨论
  • 披露声明
  • 致谢
  • 材料
  • 参考文献
  • 转载和许可

摘要

从小鼠视网膜获得的Müller神经胶质细胞原代培养物是研究microRNA处理后神经胶质转化为视网膜祖细胞的非常强大和可靠的工具。在随后应用 体内 方法之前，可以测试单个分子或组合。

摘要

穆勒神经胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要神经胶质细胞，可以作为视网膜神经元的再生源。在鱼类等低等脊椎动物中，MG驱动的再生自然发生;然而，在哺乳动物中，需要用某些因素或遗传/表观遗传操作进行刺激。由于MG仅占视网膜细胞群的5%，因此需要允许专门研究该细胞群的模型系统。这些模型系统之一是可重复的原代MG培养物，可用于各种应用，包括分子/因子筛选和鉴定，化合物或因子的测试，细胞监测和/或功能测试。该模型用于研究小鼠MG 在通过 转染人工miRNA或其抑制剂补充或抑制microRNA（miRNA）后转化为视网膜神经元的潜力。将MG特异性报告小鼠与免疫荧光标记和单细胞RNA测序（scRNA-seq）结合使用，证实在这些培养物中发现的80%-90%的细胞是MG.使用该模型，发现miRNA可以将MG重新编程为视网膜祖细胞（RPC），随后分化为神经元样细胞。该技术的优点是，在 体内 应用之前，可以测试miRNA候选物的效率和结果。

引言

米勒神经胶质细胞（MG）是神经视网膜中的主要神经胶质细胞。与中枢神经系统其他部位的其他神经胶质细胞相比，它们具有相似的功能，例如维持水和离子稳态，滋养神经元和保护组织。MG还有另一个迷人的特征:虽然它们是成熟的神经胶质细胞，但它们仍然在发育后期表达视网膜祖细胞（RPC）中的许多基因1，2。这种相似性被认为是视网膜损伤3，4后鱼视网膜中自然发生的基于MG的神经元再生的原因。在此过程中，MG重新进入细胞周期并解分化成RPC，然后分化成所有六种类型的视网膜神经元。虽然这种现象自然发生在鱼类中，但哺乳动物MG不会转化为神经元5，6。但是，它们可以重新编程。已经证明多种因素可以将MG重新编程为RPC /神经元;这些因素包括参与鱼类再生的基本螺旋-环-螺旋（bHLH）转录因子阿科特-斯库特同源物1（Ascl1）7，8。在小鼠中， Ascl1 仅在视网膜发生期间在RPC中表达，但在成熟的MG或视网膜神经元中不存在9。

直接 在体内 重编程细胞不仅在方法学上具有挑战性，而且还需要获得机构动物护理和使用委员会的批准。要获得批准，需要有关使用或改变的因子，浓度，脱靶效应，潜在机制，毒性和效率的初步数据。细胞培养系统允许在 体内 模型中使用之前测试这些标准。此外，由于MG仅占整个视网膜细胞群10的约5%，MG培养物允许研究其功能11 以及它们的行为，包括迁移12，13，增殖14，对损伤/损伤的应激反应15，16，它们与其他细胞类型的相互作用，如小胶质细胞17 或视网膜神经节细胞（RGC）18， 或他们的神经源性潜力19，20，21。许多研究人员使用永生细胞系进行研究，因为它们具有无限的增殖潜力，并且可以轻松维持和转染。然而，原代细胞比永生化细胞更适合生物学相关测定，因为它们具有真正的细胞特征（基因和蛋白质表达），更重要的是，它们代表发育的某个阶段，因此具有"年龄"。动物的年龄（以及因此从动物获得的细胞的年龄）是细胞重编程中特别关键的因素，因为细胞可塑性随着发育阶段的推进而降低22。

该协议详细描述了如何用miRNA重新编程原代MG作为研究再生的当前 体外 方法。该MG原代培养模型建立于2012年，用于评估MG在P53敲除小鼠（trp53-/-小鼠）23中的细胞增殖特征。结果表明，培养的MG保持其神经胶质特征（即 通过 免疫荧光标记评估的S100β，Pax6和Sox2蛋白的表达），并且它们类似于 体内 MG（FACS纯化的MG的微阵列）23。此后不久，使用病毒载体20以不同的方法验证和确认了神经胶质mRNA和蛋白质表达。几年后，通过使用MG特异性 Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPFL / fl 报告小鼠24，证实在这些培养物中发现的绝大多数细胞是MG。此外，对FACS纯化的MG和培养的原代MG中一组miRNA的定量表明，在生长阶段，培养的MG中mRNA的水平变化不大。然而，较长的培养周期会导致miRNA水平的变化，从而导致mRNA水平和蛋白质表达的变化，因为miRNA是翻译调节因子25。

2013年，该MG培养模型用于测试各种转录因子，这些转录因子具有将MG重新编程为视网膜神经元20的能力。Ascl1被发现是一种非常强大和可靠的重编程因子。通过病毒载体过表达Ascl1诱导形态学变化，神经元标志物的表达以及神经元电生理特性的获得。更重要的是，从这些首次体外实验中获得的见解和结果已成功转移到体内应用22，26中，证明初级MG培养物代表了在体内实施之前进行初始因子筛选和神经胶质特征评估的坚实可靠的工具。

几年前，已经证明，在视网膜神经元中高度表达的富含脑的miRNA miR-124可以在培养的MG21中诱导Ascl1表达。通过Ascl1报告小鼠可视化活细胞中的Ascl1表达（Ascl1CreERT:td多马托斯托普夫特/fl）。报告小鼠是一种基因工程小鼠，其DNA中插入了报告基因。这个报告基因编码一种报告蛋白，在这项研究中，这是一种红色荧光蛋白tdTomato。该报告蛋白报告目的基因的表达，在这种情况下，Ascl1。换句话说，表达Ascl1的细胞将变成红色。由于Ascl1仅在RPC9中表达，因此该Ascl1CreERT:td多马托斯托普弗/fl小鼠允许跟踪MG转化为表达RPC的Ascl1，这意味着转换细胞将表达红色荧光tdtomato报告蛋白。这是不可逆的标记，因为这些细胞的DNA被改变。因此，任何随后的神经元分化都将被可视化，因为tdTomato标签保留在分化细胞中。如果表达MG衍生的RPC（带有tdTomato标签）的Ascl1分化成神经元，这些神经元仍将具有红色标签。因此，该小鼠不仅可以标记MG衍生的RPC以进行活细胞成像，还可以允许这些MG衍生的（红色）RPC的命运映射和谱系追踪。最近，鉴定了RPC中的一组miRNA，并使用Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPFL / fl RPC报告基因小鼠的MG培养物来筛选和测试这些miRNA对重编程能力和效率的影响27。一种候选者RPC-miRNA miR-25被发现能够将培养的MG重新编程为Ascl1表达（Ascl1-番茄+）细胞。这些重编程的细胞随着时间的推移采用神经元特征，包括神经元形态（小体细胞和短或长精细过程），通过scRNA-Seq测量的神经元转录本的表达，以及通过免疫荧光标记27验证的神经元蛋白的表达。

在这里，该协议详细介绍了如何从适应先前工作21，24，27的P12小鼠中生长和转染MG。为该方案选择的是上述miRNA miR-25，这是一种在RPC中高度表达的miRNA，在MG或视网膜神经元中表达水平低。为了过表达miR-25，使用小鼠miR-25模拟物，即人工miRNA分子。作为对照，选择来自秀丽隐杆线虫的miRNA的模拟物，它们在哺乳动物细胞中没有功能。MG转换为RPC的可视化是通过RPC报告小鼠（Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPFL / fl），具有混合背景的小鼠（C57BL / 6，S129和ICR菌株）完成的。然而，这种培养可以用所有小鼠品系进行，包括野生型品系。在过去几年中，对原始方案进行了修改，以减少生长阶段的持续时间和整个培养期，并确保更健壮的神经胶质细胞状态，并最大限度地减少细胞变性的程度，这在长时间的培养期间发生。常规转染时间窗口也从3小时延长至2天。如前所述，尽管目前的方案将MG培养物描述为再生研究的工具，但该方法不仅可用于测试重编程因子，还可以适用于其他应用，包括关于MG迁移或增殖行为的研究，损伤/细胞损伤相关范例，和/或潜在机制和途径的鉴定。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

研究方案

涉及动物受试者的程序已获得纽约州立大学眼科学院机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

注意:该培养方案包括三个阶段:生长、转染和转化阶段。 图1给出了带有时间表的整体协议摘要。

1. 培养基和所有所需试剂的制备

注:所有步骤都需要在A2或B2生物安全柜（BSC）中执行。在生长阶段，使用高血清生长培养基，其由补充有表皮生长因子（EGF）的基础神经元培养基组成。对于转换阶段，使用补充神经元补充剂的低血清神经生理学基础培养基来确保神经元分化和存活。

  1. 通过将200 mL基础神经元培养基补充20mL胎牛血清（FBS，10%），1mL 200mM L-谷氨酰胺（0.5%），2mL青霉素/链霉素（1%）和2mL N2补充剂（1%）来制备生长培养基（在生长阶段使用）。进行无菌过滤（孔径为0.22μm的过滤装置）。使用前在37°C金属珠浴中预热介质。
  2. 按照制造商的说明（见 材料表）准备神经元培养基（在转化阶段使用），在磷酸盐缓冲盐水中补充2 mL B27神经元补充剂（2%），20μL 100 ng / mL脑源性神经营养因子（BDNF，在0.1%牛血清白蛋白（BSA）中重组， 终浓度20 ng / mL），20μL 100 ng / mL神经胶质细胞衍生的神经营养因子（GDNF，在无菌汉克斯平衡盐溶液[HBSS]中重建，终浓度20ng / mL），500μL 100mg / mL二丁酰基-cAMP（在DMSO中重组），70μL 50 ng / mL抗坏血酸（在无菌PBS中重建）和1.5 mL青霉素/链霉素。进行无菌过滤（孔径为0.22μm的过滤装置）。使用前在37°C金属珠浴中预热介质。
    注意:这些培养基可以在4°C下储存1个月。
  3. 按照制造商的方案重建视网膜解离所需的木瓜蛋白酶、DNase I 和卵泡样试剂。在无菌1.5 mL管中等分750μL木瓜蛋白酶，在无菌0.6 mL管中等分75μLDNase I，在2 mL管中等分750μL卵泡蛋白酶抑制剂。将木瓜蛋白酶和DNase I等分试样冷冻在-20°C，并将卵胞浆样等分试样保持在4°C，以避免试剂降解。使用前在室温下解冻。
    注意:木瓜蛋白酶，DNase I和卵胞浆菌在称为木瓜蛋白酶解离系统的试剂盒中发现（参见 材料表）。
  4. 如果按照数据表说明进行免疫荧光标记（Poly-O:在无菌水中0.1mg / mL;层粘连蛋白: 在 DMEM 中以 1:50 稀释 1.2 毫克/毫升）。等分试样聚O和层粘连蛋白（2.5 mL）并在-20°C下冷冻等分试样。 使用前在室温下解冻。
    注:步骤 1.4。仅当进行免疫荧光标记和激光扫描显微镜检查时才需要。

2. 小鼠和组织提取

注意:对于这些重新编程研究，阿斯克莱1CreERT:td多马托单胞胎鼠标是通过将阿斯克莱1克瑞特小鼠（阿斯克拉1-克里特:贾克斯#012882）与一只叔丁点穴位/fl小鼠（B6.Cg-gt（ROSA）26Sortm14（CAG-td多马托）Hze/J:贾克斯#007914）杂交而产生的。此鼠标具有混合背景（C57BL/6、S129 和 ICR 应变）。该小鼠的基因型如图1A所示。所有菌株都可用于该方案。

  1. 戴上手套并对工作空间进行消毒，包括解剖显微镜和所有精细工具（杜蒙#5精细和杜蒙特#7弯曲镊子，精细剪刀和Vannas剪刀）与70%乙醇。将10厘米的硅胶涂层黑色解剖盘暴露在紫外线下20分钟，对其进行消毒。
  2. 准备用于组织提取的培养皿和盘子
    1. 准备一个24孔板用于眼睛收集和样品分离（每只小鼠在一个孔中两只眼睛，用小鼠ID标记），每孔约1mL冷HBSS（4°C）。将24孔板放在冰上。
    2. 将无菌的10厘米培养皿（用于洗涤）和消毒的硅胶涂层解剖皿中填充几毫升冷HBSS（4°C），以确保组织被HBSS完全覆盖。
    3. 用1 mL 70%乙醇制备无菌的1.5 mL管。
    4. 通过在培养板上标记培养物编号，日期，菌株和所有必需的信息来准备12孔培养板。
  3. 使用任何批准的方法对P12小鼠实施安乐死。
  4. 眼部切除
    1. 用拇指和食指轻轻握住鼠标头的眼睛。
    2. 使用Dumont #7弯曲的镊子，轻轻地走到眼球后面并夹住视神经。小心地把眼睛拿出来。
      注意:如果使用成年小鼠，请勿使用弯曲的镊子，也不要拉动眼睛。而是用细剪刀小心地切开眼球;切开视神经，但不切开眼睛本身。使用镊子小心地取下眼球。
  5. 眼球清洁
    1. 将眼球短暂浸入含乙醇的管中，以避免细菌从动物中携带。
    2. 在10厘米培养皿中短暂清洗眼球，然后将其放入24孔板上的冰上。
  6. 对另一只眼睛重复步骤2.4和2.5。在此过程中将孔板保持在冰上。将一只动物的两只眼睛放在带有光源的解剖显微镜下的解剖皿中。
  7. 视网膜提取
    1. 用Dumont #5细镊子抓住视神经和巩膜周围的结缔组织，并将其小心地压在解剖皿（角膜向上）上，从而固定一个眼球。
    2. 使用30 G针在角膜中心打一个洞，以便于获得Vannas剪刀。
    3. 使用Vannas剪刀解剖睫状体周围的角膜，并用Dumont #5精细镊子仔细去除角膜，晶状体，虹膜和玻璃体。 图2A 显示了一个内含视网膜的眼罩。
    4. 用瓦纳斯剪刀解剖巩膜，直到到达视神经。夹住视神经，并使用Dumont #5精细镊子小心地提取视网膜。
    5. 使用第二对Dumont #5细镊子推动视网膜，并允许完全切除玻璃体。 图2B 示出了两个提取的视网膜。
  8. 转移和清洗
    1. 切开约2.5厘米的无菌转移移液管尖端以扩大直径。使用此尖端，在不损伤组织的情况下拾取（吸入）整个视网膜。
    2. 将视网膜转移到具有冷HBSS（4°C）的新无菌培养皿中，并摇晃培养皿（来回，左侧和右侧）。
    3. 使用转移移液器吸头，小心地推动视网膜以洗去视网膜色素上皮（RPE）细胞。
      注意:或者，可以将整个视网膜与晶状体和玻璃体从眼罩中取出。然后，可以从提取的视网膜中取出晶状体和玻璃体。如果视网膜被撕裂，请确保收集所有碎片以进行解离;否则，将没有足够的组织量来生长融合的细胞层。
  9. 立即将分离的视网膜放入装有1 mL HBSS的24孔板的新，干净的孔中。在解剖过程中将24孔板保持在冰上。
  10. 重复步骤2.7-2.9以隔离第二个视网膜。

3. 视网膜解离

注意:所有后续步骤（直到细胞收获）都需要在A2或B2生物安全柜（BSC）中进行。

  1. 按如下方式制备木瓜蛋白酶/DNase I解离混合物。
    1. 对于六个视网膜，将75μLDNase I加入含有750μL木瓜蛋白酶（从步骤1.3开始）的管中并仔细混合（解离混合物）。
    2. 对于该方案所需的单个样品制备，将825μL的总体积分成三个等分试样:275μL混合物，每只小鼠（两个视网膜）在一个1.5 mL管中。相应地计算DNase I和木瓜蛋白酶所需的量。
      注意:在一管木瓜蛋白酶/DNase I混合物中最多可以解离六个视网膜。然而，与组合样品相比，单个样品制备可减少团块并改善细胞生长。
  2. 将两个视网膜转移到木瓜蛋白酶/DNase I解离混合物中。使用吸头直径增大的转移移液管（步骤2.8.1），拿起视网膜，等到视网膜沉降在吸头底部，然后将视网膜释放出来，而不会过多的HBSS进入含有木瓜蛋白酶/DNase I混合物的管中。
  3. 放在坚果上，在细胞培养箱（37°C，5%CO2）中孵育10分钟。
  4. 通过用1mL移液管小心地上下移液（约20-30次）来解离细胞。细胞解离后（即，产生没有块的均匀溶液），从木瓜蛋白酶解离试剂盒中加入275μL卵胞浆蛋白酶抑制剂以中和木瓜蛋白酶。通过上下移液轻轻混合。
    注意:如果在825μL木瓜蛋白酶/DNase I混合物中分离出六个视网膜，则需要825μL卵泡。
  5. 在4°C下以300× g 离心混合物10分钟。
  6. 将表皮生长因子（EGF，每1mL生长培养基1μL，在PBS中以200μg/ mL重建）添加到在37°C预热的生长培养基（每只小鼠1mL）的计算体积中。
    注意:根据实验设计，可以在培养期开始时添加增殖标记5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU）以及4-羟基他莫昔芬（4-OHT）或其他所需因子。
  7. 小心地从离心机中取出管子。不要触摸管底部的颗粒。
  8. 仔细和完全地除去上清液。用500μL补充EGF的生长培养基重悬细胞沉淀。
  9. 将细胞悬浮液转移到标记的12孔板的一个孔中（图2C）。用另一个500μL补充EGF的生长培养基冲洗管并将其加入孔中（每孔总体积为1mL）。
  10. 对所有其他示例重复步骤 3.8 和 3.9。
  11. 小心地将孔板摇三次（来回，左，右）。将板放入培养箱（37°C，CO2）。
    注意:如果使用转基因小鼠，请对每只动物进行基因分型（图2D）。鉴定 Cre 重组酶阳性和阴性小鼠并相应地标记板。对于该协议，只有Cre 重组酶阳性报告小鼠的细胞用于后续步骤。Cre 阴性标本的细胞被冷冻并用于其他应用。

4. 成长阶段

注意:生长阶段的持续时间约为4-5天（图1B）。为了将液体添加到含有细胞的孔中，移液器需要指向孔壁，并且需要缓慢释放液体以避免细胞脱离。不要直接移液在细胞顶部。

  1. 解离后一天，取出培养基并加入1 mL新鲜EGF补充生长培养基。
  2. 在第3天，取出培养基并加入1 mL HBSS（室温）以除去细胞碎片。从左到右轻轻来回摇摆。取出HBSS，重复洗涤步骤，并加入1 mL预热的EGF补充生长培养基。
  3. 每天监测细胞并评估其生长状态，直到细胞达到90%-100%汇合。 图 3 显示了一段时间内良好 MG 增长的示例。检查可能的污染或细胞死亡（补充图1）。丢弃受污染的培养物。
    注意:要监视和记录细胞状态，请使用带有相机和4x，10x或20x物镜的光学显微镜以各种放大倍率拍摄图像。在这项研究中，使用了荧光显微镜。

5. 用聚-L-鸟氨酸（Poly-O）和层粘连蛋白涂层制备盖玻片

注意:仅当执行免疫荧光标记和共聚焦激光扫描显微镜时，才需要此步骤。圆形玻璃盖玻片（直径12毫米）是正确成像所必需的。涂层方案也可以在神经元介质数据表中找到（参见 材料表）。

  1. 使用无菌Dumont#2AP镊子将无菌盖玻片小心地放在24孔板的每个孔的中心。
    注意:将盖玻片放在孔的中心。将盖玻片放置在靠近井壁的地方会导致后续步骤的表面张力问题。
  2. 在室温下解冻2.5 mL Poly-O等分试样，并将其100μL放在每个盖玻片的中心。
  3. 将孔板在37°C培养箱中孵育30分钟。
  4. 取出Poly-O并用盖玻片用~1 mL无菌水洗涤孔三次。
  5. 让孔板在平衡计分卡中干燥过夜。在4°C下解冻2.5 mL层粘连蛋白过夜。
  6. 第二天早上，在每个盖玻片的中心加入100μL层粘连蛋白，并在37°C培养箱中孵育4小时。
  7. 仔细和完全去除层粘连蛋白。
  8. 如果不能立即进行传代，则将板保持在4°C。
    注意:准备好的板中的涂层盖玻片可以在4°C下保存几天。

6. 细胞通道以清除神经元幸存者

注意:细胞传代需要去除神经元细胞，而不是增加细胞群。神经胶质细胞只分裂几次，通过后不会进一步生长。不要稀释细胞悬浮液。12孔板的一个汇合孔的细胞可以分布到12孔板的一个孔或24孔板的两个孔上。当使用涂层盖玻片时，只有大约三分之一的盖玻片被涂覆。因此，位于24孔板中的六个盖玻片，具有汇合细胞（〜80%-90%）可以从12孔板的融合细胞的一孔中获得。也可以选择其他比率来增加或减少细胞密度。对于该协议，使用一只 Cre +报告小鼠[一个实验，两个处理:miR-25或对照-miR;技术重复n = 3（每次处理三个盖玻片），生物重复n = 1]。技术和生物重复的数量可以根据实验设计以不同的方式定义。

  1. 检查细胞是否汇合90%-100%（也在井的边缘; 图 3E，F）。
  2. 取出培养基，加入1毫升HBSS（室温）洗涤。轻轻摇动盘子（来回，左右）。完全删除哈佛商学院。
  3. 加入500μL预热的含胰蛋白酶的溶液（在金属珠浴中预热在37°C下）以将细胞从孔中分离。轻轻摇晃（来回，从左到右）并在37°C培养箱中孵育2分钟。
  4. 将培养皿从培养箱移至平衡计分卡。倾斜时，吸出含有胰蛋白酶的溶液，并将其小心缓慢地分散在孔上几次，直到细胞完全分离。将板对着灯，确保底部没有细胞。
  5. 将此细胞悬浮液转移到无菌的1.5 mL管中。在4°C下以300× g 离心8分钟。
  6. 取出上清液，并通过加入600μL（每孔100μL，6孔/盖玻片）预热生长培养基（补充EGF; 1:1000）小心地重悬细胞沉淀。并上下移液约30-40次。
    注意:此时可以在-80°C或液氮中冷冻细胞，并按照解冻细胞系的标准方案解冻。如果细胞被冷冻，它们将不会重悬于EGF补充培养基（生长培养基）中。它们将被重悬于碱性培养基（无EGF）和冷冻溶液（1/1比例）中。步骤6.1.1至6.6.2描述了冷冻细胞的步骤。如果没有细胞被冷冻，请继续执行步骤6.7。
    1. 通过混合100μLDMSO和400μLFBS（每孔/样品总体积为500μL）来制备冷冻溶液。
    2. 将细胞沉淀重悬于500μL预热的生长培养基中。将细胞悬浮液加入500μLDMSO / FBS冷冻溶液（总体积为1mL）中。将试管保持在冰上，直到所有样品都处理完毕。将细胞在-20°C下冷冻1小时，然后在-80°C下储存。
  7. 通过将100μL的600μL细胞/培养基悬浮液（步骤6.6）置于24孔板的六个涂覆盖玻片（参见步骤5）的中心来接种细胞。将板小心地放入培养箱中，让细胞沉降。
    注意:100 μL的600 μL细胞悬浮液（从12孔板的一个孔中收获）将产生90%-100%的细胞汇合度，这是转染所必需的。
  8. 3小时后检查细胞，看看它们是否已经落在盖玻片上。加入400μL补充EGF的生长培养基。
    注意:细胞通常已准备好在第二天进行转染（图3G）。如果没有汇合（90%-100%），请将它们留到另一天。如果仍不能融合，请勿将其用于转染。如果进行其他下游应用，例如miRNA分析，RNA-Seq，RT-qPCR或蛋白质印迹，则需要将细胞传代到12孔板中（1:1比例，无需板处理）并收获以进行RNA /蛋白质提取。

7. 转染

注意:转染阶段仅包括转染介质中的3小时阶段（转染程序在转染试剂随附的转染手册中描述）和延长阶段，其中转染试剂和miRNA仍然存在，但添加了具有所需补充的神经元培养基（总持续时间为2天; 图 1B）。在该协议中，将转染六个孔:三个孔将接收重编程miRNA miR-25，三个孔将接收对照miRNA。

  1. 检查细胞是否达到90%汇合度，并在转染前记录/成像细胞。
  2. 取出生长培养基并加入500μL HBSS（室温）以洗涤细胞。
  3. 取出HBSS并加入400μL用于转染的还原血清培养基。将板放回37°C培养箱中。
  4. 按照制造商转染试剂方案的说明准备转染混合物。制成两种混合物:转染试剂混合物和miRNA混合物（参见 图1B 的插图）。
    1. 准备转染试剂混合物:对于24孔板，一孔（总共50μL）需要49μL还原血清培养基和1μL转染试剂。对于六个孔，将294μL还原血清培养基和6μL转染试剂混合并通过轻轻上下移液充分混合。
    2. 制备miRNA模拟混合物:对于24孔板，一个孔需要50μL模拟混合物的总体积。三个孔将接收对照miRNA，其他三个孔将用miR-25处理。对于该协议，使用200 nM的最终浓度。
      1. 对于miR-25处理（三个孔），通过轻轻地上下移液，将150μL还原血清培养基和3μLmiR-25模拟物（100μM储备溶液）混合并充分混合。孵育5分钟。
        对于对照模拟处理（三个孔），将150μL还原的血清培养基和3μL对照-miRNA模拟物（100μM储备溶液）混合并通过轻轻上下移液充分混合。孵育5分钟。
        注意:miRNA模拟物的体积取决于稀释因子和所需的浓度（20-500 nM）。也可以使用miRNA抑制剂（抗标记物）或其他分子，包括质粒。此外，分子组合也可以转染。
  5. 将miRNA模拟混合物和转染试剂混合物混合。通过轻轻地上下移液缓慢而彻底地移液，小心地混合。在室温下孵育20分钟（根据制造商的说明）。
  6. 使用20μL移液管将上述转染混合物滴加到细胞顶部，靠近孔中的培养基表面。轻轻摇晃盘子（来回，从左到右）。
  7. 在37°C培养箱中孵育3小时。
  8. 3小时后，将神经元培养基加入补充有4-羟基他莫昔芬（5mM储备用2.58mL乙醇重组，250nM终浓度）的孔（每孔50μL）以激活Cre重组酶和5-乙炔基-2'-脱氧尿苷（EdU，10mM储备溶液用2mL DMSO重组，1μM终浓度）以跟踪细胞增殖。
    注意:已知 4-羟基他莫昔芬和 EdU 是人类致癌物、致畸剂和诱变剂。使用前请阅读材料安全数据表，并戴上手套、护目镜和实验室外套。根据制造商的建议重新组合两种试剂。不要吸入该物质/混合物。使用后紧闭。废物必须按照国家和地方法规进行处置。使用该物质后洗手和洗脸。
  9. 在37°C培养箱中孵育2天（图1B）。

8. 单元格转换

注意:细胞转换阶段的持续时间约为5-6天（图1B），但可以延长周期。

  1. 每天检查细胞是否成功诱导tdTomato表达，潜在的细胞死亡和/或污染。细胞密度不变（图4）。在4-羟基他莫昔芬治疗后1天可以观察到第一个微弱的红色荧光标记的细胞。需要荧光显微镜来监测和成像细胞。
    注意:在本研究中，荧光显微镜用于实时成像。使用4倍，10倍或20倍物镜拍摄图像。
  2. 转染后两天，取出培养基，并在每个孔中加入500μL补充有4-羟基他莫昔芬和EdU的预热神经元培养基。
  3. 每隔一天用新鲜培养基替换培养基，直到细胞被收获。
  4. 拍摄实时图像以评估和评估红色荧光（Ascl1表达）细胞的数量及其形态变化（图4和图5A-C）。

9. 细胞收获:免疫荧光标记的固定

注意:细胞可以收获用于其他下游应用，包括散装或scRNA-Seq，RT-qPCR或蛋白质印迹。

  1. 取出培养基，每孔加入500μL冷HBSS（4°C），轻轻摇动板（来回，从左到右）。移除哈佛商学院。
  2. 通过加入500μL2%多聚甲醛（PFA）固定细胞，并在室温下孵育20分钟。
  3. 根据既定方案进行免疫荧光标记。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

结果

该协议描述了如何从P12小鼠视网膜中生长MG，以及如何使用 Ascl1CreERT:td多巴托斯托普/fl RPC报告小鼠将这些细胞用miR-25重新编程为视网膜神经元。该方法在先前的工作中详细报告了其他合适的miRNA（模仿物或抑制剂，作为单分子或组合）以将MG重新编程为RPC，然后采用神经元细胞特征27。该方法已被修改以更快地生长培养物，从而最大限度地减少人工环境随时...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

讨论

该协议描述了如何从解离的小鼠视网膜中生长MG，以使用miRNA进行重编程研究。如先前各种研究所显示和证实的那样，在这些培养物中发现的绝大多数（80%-90%）细胞是MG20，23，24。这种方法是一种非常可靠和可靠的技术，如果正确遵循协议21，27，可以很容易地重现结果。然而，培养?...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

披露声明

华盛顿大学已经与发明人尼古拉斯·约斯塔德，斯蒂芬妮·沃尔和托马斯·雷赫申请了包括本报告中一些发现的专利。该专利的标题为"刺激视网膜再生的方法和组合物"。

致谢

作者感谢Ann Beaton博士和所有实验室成员对手稿的意见。特别感谢Tom Reh博士，朱莉娅·波拉克博士和Russ Taylor博士在西雅图华盛顿大学的博士后培训期间将MG主要文化作为筛选工具介绍给S.G.W.。该研究由帝国创新计划（EIP）资助给S.G.W.和纽约州立大学验光学院向S.G.W.的启动资金资助，以及美国国家眼科研究所（NEI）向S.G.W.颁发的R01EY032532奖。

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

材料

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

参考文献

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632(2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t, Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330(2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173(2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759(2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423(2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377(2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556(2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204(2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603(2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279(2020).
  37. Brzezinski, J. A. t, Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t, Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817(2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615(2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408(2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

转载和许可

请求许可使用此 JoVE 文章的文本或图形

请求许可

探索更多文章

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

政策

使用条款

隐私

联系我们

向图书馆推荐

JoVE 新闻简报

科研

教育

发表

图书馆员

关于 JoVE

版权所属 © 2025 MyJoVE 公司版权所有，本公司不涉及任何医疗业务和医疗服务。