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In diesem Artikel

  • Zusammenfassung
  • Zusammenfassung
  • Einleitung
  • Protokoll
  • Ergebnisse
  • Diskussion
  • Offenlegungen
  • Danksagungen
  • Materialien
  • Referenzen
  • Nachdrucke und Genehmigungen

Zusammenfassung

Müller-Glia-Primärkulturen, die aus Mausnetzhaut gewonnen werden, stellen ein sehr robustes und zuverlässiges Werkzeug dar, um die Umwandlung von Gliazellen in retinale Vorläuferzellen nach einer microRNA-Behandlung zu untersuchen. Einzelne Moleküle oder Kombinationen können vor der anschließenden Anwendung von In-vivo-Ansätzen getestet werden.

Zusammenfassung

Müller-Glia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut und können als regenerative Quelle für retinale Neuronen fungieren. Bei niederen Wirbeltieren wie Fischen findet die MG-getriebene Regeneration auf natürliche Weise statt; Bei Säugetieren ist jedoch eine Stimulation mit bestimmten Faktoren oder eine genetische/epigenetische Manipulation erforderlich. Da MG nur 5% der retinalen Zellpopulation ausmachen, besteht ein Bedarf an Modellsystemen, die ausschließlich die Untersuchung dieser Zellpopulation ermöglichen. Eines dieser Modellsysteme sind primäre MG-Kulturen, die reproduzierbar sind und für eine Vielzahl von Anwendungen verwendet werden können, einschließlich Molekül- / Faktor-Screening und -Identifizierung, Testen von Verbindungen oder Faktoren, Zellüberwachung und / oder Funktionstests. Dieses Modell wird verwendet, um das Potenzial von murinem MG zu untersuchen, sich nach Supplementierung oder Hemmung von microRNAs (miRNAs) durch Transfektion künstlicher miRNAs oder ihrer Inhibitoren in retinale Neuronen umzuwandeln. Die Verwendung von MG-spezifischen Reportermäusen in Kombination mit Immunfluoreszenzmarkierung und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (scRNA-seq) bestätigte, dass 80% -90% der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG sind. Mit diesem Modell wurde entdeckt, dass miRNAs MG in retinale Vorläuferzellen (RPCs) umprogrammieren können, die sich anschließend in neuronale Zellen differenzieren. Die Vorteile dieser Technik bestehen darin, dass miRNA-Kandidaten vor ihrer Verwendung in In-vivo-Anwendungen auf ihre Effizienz und ihr Ergebnis getestet werden können.

Einleitung

Die Müllerglia (MG) sind die vorherrschenden Gliazellen in der neuronalen Netzhaut. Sie haben ähnliche Funktionen im Vergleich zu anderen Gliazellen in anderen Teilen des zentralen Nervensystems, wie z.B. die Aufrechterhaltung der Wasser- und Ionenhomöostase, die Ernährung von Neuronen und den Schutz des Gewebes. MG haben eine weitere faszinierende Eigenschaft: Obwohl sie reife Gliazellen sind, exprimieren sie immer noch viele Gene, die in retinalen Vorläuferzellen (RPCs) während der späten Entwicklung exprimiertwerden 1,2. Es wird angenommen, dass diese Ähnlichkeit der Grund für die natürlich vorkommende MG-basierte neuronale Regeneration in der Netzhaut der Fische nach Netzhautschädenist 3,4. Während dieses Prozesses tritt MG wieder in den Zellzyklus ein und dedifferenziert sich in RPCs, die sich dann in alle sechs Arten von Netzhautneuronen differenzieren. Obwohl dieses Phänomen natürlich bei Fischen auftritt, wandeln sich MG von Säugetieren nicht in Neuronenum 5,6. Sie können jedoch umprogrammiert werden. Es wurde gezeigt, dass eine Vielzahl von Faktoren MG in RPCs / Neuronen umprogrammiert; Zu diesen Faktoren gehört der grundlegende Helix-Loop-Helix (bHLH)-Transkriptionsfaktor achaete-scute homolog 1 (Ascl1), der an der Fischregeneration beteiligt ist 7,8. Bei Mäusen wird Ascl1 während der Retinogenese nur in RPCs exprimiert, fehlt jedoch in reifen MG- oder retinalen Neuronen9.

Die direkte Reprogrammierung von Zellen in vivo ist nicht nur eine methodische Herausforderung, sondern erfordert auch die Genehmigung eines institutionellen Ausschusses für Tierpflege und -nutzung. Um die Zulassung zu erhalten, sind vorläufige Daten über die verwendeten oder veränderten Faktoren, Konzentrationen, Off-Target-Effekte, zugrunde liegende Mechanismen, Toxizität und Effizienz erforderlich. Zellkultursysteme ermöglichen es, diese Kriterien vor der Verwendung in In-vivo-Modellen zu testen. Da MG nur etwa 5% der gesamten retinalen Zellpopulationausmachen 10, ermöglichen MG-Kulturen die Untersuchung ihrer Funktion 11 sowie ihres Verhaltens, einschließlich Migration 12,13, Proliferation 14, Stressreaktion auf Verletzungen/Schäden15,16, ihrer Interaktion mit anderen Zelltypen wie Mikroglia 17 oder retinalen Ganglienzellen (RGCs)18, oder ihr neurogenes Potential 19,20,21. Viele Forscher verwenden immortalisierte Zelllinien für ihre Studien, da sie ein unbegrenztes proliferatives Potenzial haben und leicht aufrechterhalten und transfiziert werden können. Primärzellen sind jedoch für biologisch relevante Assays besser geeignet als unsterbliche Zellen, da sie echte Zelleigenschaften (Gen- und Proteinexpression) aufweisen und, was noch wichtiger ist, ein bestimmtes Entwicklungsstadium darstellen und daher ein "Alter" haben. Das Alter eines Tieres (und folglich der von einem Tier gewonnenen Zellen) ist ein besonders entscheidender Faktor bei der zellulären Reprogrammierung, da die Zellplastizität mit fortschreitendem Entwicklungsstadium abnimmt22.

Dieses Protokoll beschreibt detailliert, wie primäres MG mit miRNAs als aktuelle In-vitro-Methode zur Untersuchung der Regeneration umprogrammiert werden kann. Dieses MG-Primärkulturmodell wurde 2012 etabliert, um die Zellproliferationseigenschaften von MG in P53-Knock-out-Mäusen (trp53-/- Mäuse)23 zu bewerten. Es wurde gezeigt, dass kultivierte MG ihre Gliaeigenschaften beibehalten (d. h. Expression von S100β-, Pax6- und Sox2-Proteinen, die über Immunfluoreszenzmarkierung bewertet werden) und dass sie in vivo MG (Microarray of FACS-gereinigtem MG)23 ähneln. Kurz darauf wurden gliale mRNA und Proteinexpression validiert und in einem anderen Ansatz mit viralen Vektorenbestätigt 20. Einige Jahre später wurde bestätigt, dass die überwiegende Mehrheit der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG ist, indem die MG-spezifische Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl Reportermaus24 verwendet wurde. Darüber hinaus zeigte die Quantifizierung des Satzes von miRNAs sowohl in FACS-gereinigtem MG als auch in kultiviertem primärem MG, dass die Spiegel von MG-miRNAs (mGLiomiRs) in kultiviertem MG während der Wachstumsphase nicht sehr unterschiedlich sind. Verlängerte Kulturperioden verursachen jedoch Veränderungen der miRNA-Spiegel und folglich der mRNA-Spiegel und der Proteinexpression, da miRNAs translationale Regulatorensind 25.

Im Jahr2013 wurde dieses MG-Kulturmodell verwendet, um eine Vielzahl von Transkriptionsfaktoren in Bezug auf ihre Fähigkeit zu testen, MG in retinale Neuronen 20 umzuprogrammieren. Ascl1 erwies sich als sehr robuster und zuverlässiger Reprogrammierungsfaktor. Die Überexpression von Ascl1 über virale Vektoren induzierte morphologische Veränderungen, die Expression neuronaler Marker und den Erwerb neuronaler elektrophysiologischer Eigenschaften. Noch wichtiger ist, dass die Erkenntnisse und Ergebnisse aus diesen ersten In-vitro-Experimenten erfolgreich auf In-vivo-Anwendungenübertragen wurden 22,26, die zeigen, dass primäre MG-Kulturen ein solides und zuverlässiges Werkzeug für anfängliche Faktor-Screenings und die Bewertung von Glia-Merkmalen vor der In-vivo-Implementierung darstellen.

Vor einigen Jahren wurde gezeigt, dass die mit dem Gehirn angereicherte miRNA miR-124, die auch in retinalen Neuronen hoch exprimiert wird, die Ascl1-Expression in kultiviertem MG21 induzieren kann. Die Ascl1-Expression in lebenden Zellen wurde über eine Ascl1-Reportermaus (Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/fl) visualisiert. Eine Reportermaus ist eine gentechnisch veränderte Maus, in deren DNA ein Reportergen eingefügt wurde. Dieses Reporter-Gen kodiert für ein Reporterprotein, das in dieser Studie tdTomato, ein rot fluoreszierendes Protein, ist. Dieses Reporterprotein berichtet über die Expression eines Gens von Interesse, in diesem Fall Ascl1. Mit anderen Worten, Zellen, die Ascl1 ausdrücken, werden rot. Da Ascl1 nur in RPCs9 exprimiert wird, ermöglicht diese Ascl1 CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl-Maus die Verfolgung der MG-Umwandlung in Ascl1-exprimierende RPCs, was bedeutet, dass die Umwandlung von Zellen rot fluoreszierendes tdTomaten-Reporterprotein exprimiert. Dies ist eine irreversible Markierung, da die DNA dieser Zellen verändert ist. Folglich wird jede nachfolgende neuronale Differenzierung visualisiert, da die tdTomato-Markierung in differenzierenden Zellen verbleibt. Wenn Ascl1-exprimierende MG-abgeleitete RPCs (mit tdTomato-Label) in Neuronen differenzieren, haben diese Neuronen immer noch ihre rote Markierung. Diese Maus ermöglicht daher nicht nur die Markierung von MG-abgeleiteten RPCs für die Live-Cell-Bildgebung, sondern ermöglicht auch die Schicksalskartierung und Abstammungsverfolgung dieser MG-abgeleiteten (roten) RPCs. In jüngerer Zeit wurde der Satz von miRNAs in RPCs identifiziert und MG-Kulturen von Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-Reporter-Mäusen wurden verwendet, um die Wirkung dieser miRNAs auf die Reprogrammierungskapazität und -effizienz zu screenen und zu testen27. Ein Kandidat, die RPC-miRNA miR-25, wurde in der Lage befunden, kultiviertes MG in Ascl1-exprimierende (Ascl1-Tomato+) Zellen umzuprogrammieren. Diese reprogrammierten Zellen nehmen im Laufe der Zeit neuronale Merkmale an, einschließlich der neuronalen Morphologie (kleine Somata und entweder kurze oder lange Feinprozesse), der Expression neuronaler Transkripte, die über scRNA-Seq gemessen werden, sowie der Expression neuronaler Proteine, die über Immunfluoreszenzmarkierung validiert wurden27.

Hier beschreibt das Protokoll, wie MG von P12-Mäusen gezüchtet und transfiziert werden kann, angepasst an die vorherige Arbeit21,24,27. Für dieses Protokoll wurde die oben erwähnte miRNA miR-25 ausgewählt, eine miRNA, die in RPCs hoch exprimiert wird, mit niedrigen Expressionsspiegeln in MG- oder Netzhautneuronen. Um miR-25 zu überexprimieren, werden murine miR-25-Moleküle verwendet, d.h. künstliche miRNA-Moleküle. Zur Kontrolle werden Nachahmungen einer miRNA aus Caenorhabditis elegans gewählt, die in Säugetierzellen keine Funktion haben. Die Visualisierung der Umwandlung von MG in RPCs erfolgte über die RPC-Reportermaus (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), eine Maus mit gemischtem Hintergrund (C57BL/6, S129 und ICR-Dehnungen). Diese Kultur kann jedoch mit allen Mausstämmen, einschließlich Wildtyp-Stämmen, durchgeführt werden. In den letzten Jahren wurde das ursprüngliche Protokoll modifiziert, um die Dauer der Wachstumsphase und die Gesamtkulturperiode zu reduzieren und einen robusteren Gliazellenstatus zu gewährleisten und den Grad der zellulären Degeneration, die in längeren Kulturperioden auftritt, zu minimieren. Auch das reguläre Transfektionszeitfenster wurde von 3 h auf 2 Tage verlängert. Obwohl das aktuelle Protokoll MG-Kulturen als Werkzeug für Regenerationsstudien beschreibt, ist die Methode nicht nur zum Testen von Reprogrammierungsfaktoren nützlich, sondern kann auch für andere Anwendungen angepasst werden, einschließlich Studien über MG-Migrations- oder Proliferationsverhalten, Verletzungs- / Zellschadensparadigmen und / oder die Identifizierung zugrunde liegender Mechanismen und Signalwege.

Protokoll

Verfahren mit tierischen Probanden wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) am SUNY College of Optometry genehmigt.

HINWEIS: Dieses Kulturprotokoll besteht aus drei Phasen: Wachstums-, Transfektions- und Konversionsphase. Eine Zusammenfassung des Gesamtprotokolls mit dem Zeitplan ist in Abbildung 1 dargestellt.

1. Aufbereitung von Medien und allen erforderlichen Reagenzien

HINWEIS: Alle Schritte müssen in einer A2- oder B2-Biosicherheitskabine (BSC) durchgeführt werden. Während der Wachstumsphase wird ein hochserumes Wachstumsmedium verwendet, das aus einem basalen neuronalen Medium besteht, das mit einem epidermalen Wachstumsfaktor (EGF) ergänzt wird. Für die Konversionsphase wird ein serumarmes neurophysiologisches Basalmedium, das mit neuronalen Nahrungsergänzungsmitteln ergänzt wird, verwendet, um die neuronale Differenzierung und das Überleben zu sichern.

  1. Bereiten Sie das Wachstumsmedium (während der Wachstumsphase verwendet) vor, indem Sie 200 ml basales neuronales Medium mit 20 ml fetalem Rinderserum (FBS, 10%), 1 ml 200 mM L-Glutamin (0,5%), 2 ml Penicillin / Streptomycin (1%) und 2 ml N2-Ergänzung (1%) ergänzen. Sterilfiltration (Filtereinheiten mit 0,22 μm Porengröße). Das Medium vor Gebrauch im 37 °C großen Metallperlenbad vorwärmen.
  2. Vorbereiten des neuronalen Mediums (während der Umstellungsphase verwendet) gemäß den Anweisungen des Herstellers (siehe Materialtabelle) durch Ergänzung von 100 ml serumfreiem neurophysiologischem Basalmedium mit 2 ml neuronalem B27-Supplement (2%), 1 ml N2-Ergänzung (1%), 20 μL 100 ng/ml hirnabgeleitetem neurotrophem Faktor (BDNF, rekonstituieren in 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) in phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS, Endkonzentration 20 ng/ml), 20 μL 100 ng/ml Gliazell-abgeleiteter neurotropher Faktor (GDNF, rekonstituiert in steriler Hanks' Balanced Salt Solution [HBSS], Endkonzentration 20 ng/ml), 500 μL 100 mg/ml Dibutyryl-cAMP (rekonstituiert in DMSO), 70 μL 50 ng/ml Ascorbinsäure (rekonstituiert in sterilem PBS) und 1,5 ml Penicillin/Streptomycin. Sterilfiltration (Filtereinheiten mit 0,22 μm Porengröße). Vorgewärmtes Medium im 37 °C Metallperlenbad vor Gebrauch.
    HINWEIS: Diese Medien können 1 Monat lang bei 4 °C gelagert werden.
  3. Rekonstituieren Sie Papain-, DNase I- und Ovomucoid-Reagenzien, die für die retinale Dissoziation gemäß dem Protokoll des Herstellers erforderlich sind. Aliquot 750 μL Papain in sterilen 1,5-ml-Röhrchen, 75 μL DNase I in sterilen 0,6-ml-Röhrchen und 750 μL Ovomucoid-Proteasehemmer in 2-ml-Röhrchen. Papain und DNase I Aliquots bei -20 °C einfrieren und Ovomucoid-Aliquots bei 4 °C aufbewahren, um einen Abbau der Reagenzien zu vermeiden. Bei Raumtemperatur kurz vor Gebrauch auftauen.
    HINWEIS: Papain, DNase I und Ovomucoid sind in einem Kit namens Papain-Dissoziationssystem enthalten (siehe Materialtabelle).
  4. Rekonstituieren Sie Poly-L-Ornithin (Poly-O) und Laminin für die Deckglasbeschichtung, wenn die Immunfluoreszenzmarkierung gemäß den Anweisungen des Datenblatts durchgeführt wird (Poly-O: 0,1 mg/ml in sterilem Wasser; Laminin: 1,2 mg/ml bei 1:50 in DMEM verdünnen). Aliquot Poly-O und Laminin (2,5 ml) und aliquot bei -20 °C einfrieren. Bei Raumtemperatur kurz vor Gebrauch auftauen.
    HINWEIS: Schritt 1.4. ist nur erforderlich, wenn eine Immunfluoreszenzmarkierung und Laser-Scanning-Mikroskopie durchgeführt wird.

2. Mäuse und Gewebeextraktion

HINWEIS: Für diese Reprogrammierungsstudien wurde die Ascl1 CreERT:tdTomato STOPfl/fl-Maus durch Kreuzung einer Ascl1 CreERT-Maus (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) mit einer tdTomatoSTOPfl/fl-Maus (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914) erstellt. Diese Maus hat einen gemischten Hintergrund (C57BL/6, S129 und ICR-Dehnung). Der Genotyp dieser Maus ist in Abbildung 1A dargestellt. Alle Stämme können für dieses Protokoll verwendet werden.

  1. Tragen Sie Handschuhe und desinfizieren Sie den Arbeitsbereich, einschließlich des Seziermikroskops und aller feinen Werkzeuge (Dumont # 5 feine und Dumont # 7 gebogene Pinzette, feine Schere und Vannas-Schere) mit 70% Ethanol. Desinfizieren Sie eine 10 cm mit Silikon beschichtete schwarze Sezierschüssel, indem Sie sie 20 Minuten lang UV-Licht aussetzen.
  2. Zubereitung von Geschirr und Tellern für die Gewebeextraktion
    1. Bereiten Sie eine 24-Well-Platte für die Augenentnahme und Probentrennung vor (zwei Augen pro Maus in einem Well, gekennzeichnet mit Maus-IDs) mit ~ 1 ml kaltem HBSS (4 ° C) pro Well. Legen Sie die 24-Well-Platte auf Eis.
    2. Füllen Sie eine sterile 10 cm Petrischale (zum Waschen) und die desinfizierte silikonbeschichtete Sezierschale mit mehreren ml kaltem HBSS (4 °C), um sicherzustellen, dass das Gewebe vollständig mit HBSS bedeckt ist.
    3. Bereiten Sie ein steriles 1,5-ml-Röhrchen mit 1 ml 70% Ethanol vor.
    4. Bereiten Sie eine 12-Well-Kulturplatte vor, indem Sie die Platte mit Kulturnummer, Datum, Stamm und allen erforderlichen Informationen beschriften.
  3. Euthanasie P12-Mäuse mit einer zugelassenen Methode.
  4. Augenentfernung
    1. Halten Sie den Mauskopf vorsichtig mit Daumen und Zeigefinger um das Auge.
    2. Gehen Sie mit einer gebogenen Pinzette von Dumont #7 vorsichtig hinter den Augapfel und befestigen Sie den Sehnerv. Nehmen Sie vorsichtig das Auge heraus.
      HINWEIS: Wenn erwachsene Mäuse verwendet werden, verwenden Sie keine gebogene Pinzette und ziehen Sie nicht am Auge. Schneiden Sie stattdessen sorgfältig um den Augenglobus mit einer feinen Schere; Schneiden Sie den Sehnerv ab, aber schneiden Sie nicht das Auge selbst. Verwenden Sie eine Pinzette, um den Augapfel vorsichtig zu entfernen.
  5. Augapfelreinigung
    1. Tauchen Sie den Augapfel kurz in ein ethanolhaltiges Röhrchen, um eine Verschleppung von Bakterien vom Tier zu vermeiden.
    2. Waschen Sie den Augapfel kurz in der 10 cm Petrischale, bevor Sie ihn in die 24-fache Platte auf Eis legen.
  6. Wiederholen Sie die Schritte 2.4 und 2.5 für die anderen Augen. Halten Sie die Brunnenplatte während des Vorgangs auf dem Eis. Legen Sie zwei Augen von einem Tier in die Sezierschüssel, die unter einem Seziermikroskop mit einer Lichtquelle platziert ist.
  7. Netzhaut-Extraktion
    1. Fixieren Sie einen Augapfel, indem Sie den Sehnerv und das umgebende Bindegewebe um die Sklera mit Dumont #5 feiner Pinzette greifen und vorsichtig gegen die Sezierschale drücken (Hornhaut nach oben).
    2. Machen Sie ein Loch in der Mitte der Hornhaut mit einer 30-G-Nadel, um den Zugang für die Vannas-Schere zu erleichtern.
    3. Sezieren Sie die Hornhaut um den Ziliarkörper mit einer Vannas-Schere und entfernen Sie Hornhaut, Linse, Iris und Glaskörper vorsichtig mit Dumont #5 feinen Pinzetten. Abbildung 2A zeigt eine Augenmuschel mit der Netzhaut im Inneren.
    4. Sezieren Sie die Sklera mit einer Vannas-Schere, bis der Sehnerv erreicht ist. Befestigen Sie den Sehnerv und extrahieren Sie die Netzhaut vorsichtig mit Dumont # 5 feiner Pinzette.
    5. Verwenden Sie ein zweites Paar Dumont # 5 feine Pinzetten, um gegen die Netzhaut zu drücken und die vollständige Entfernung des Glaskörpers zu ermöglichen. Abbildung 2B zeigt zwei extrahierte Netzhäute.
  8. Transfer und Waschen
    1. Schneiden Sie etwa 2,5 cm der Spitze einer sterilen Transferpipette ab, um den Durchmesser zu vergrößern. Nehmen Sie mit diesem Tipp die gesamte Netzhaut auf (saugen Sie sie ein), ohne das Gewebe zu beschädigen.
    2. Die Netzhaut in eine neue sterile Petrischale mit kaltem HBSS (4 °C) geben und die Schale (hin und her, links und rechts) schaukeln.
    3. Schieben Sie die Netzhaut mit der Transferpipettenspitze vorsichtig herum, um retinale Pigmentepithelzellen (RPE) abzuwaschen.
      HINWEIS: Alternativ kann die gesamte Netzhaut mit Linse und Glaskörper aus der Augenmuschel entfernt werden. Dann können die Linse und der Glaskörper von der extrahierten Netzhaut entfernt werden. Wenn die Netzhaut gerissen ist, stellen Sie sicher, dass Sie alle Stücke zur Dissoziation sammeln. Andernfalls werden nicht genügend Gewebemengen vorhanden sein, um konfluierende Zellschichten zu züchten.
  9. Legen Sie die isolierte Netzhaut sofort in eine neue, saubere Vertiefung der 24-Well-Platte, die mit 1 ml HBSS gefüllt ist. Halten Sie die 24-Well-Platte während des Seziervorgangs auf dem Eis.
  10. Wiederholen Sie die Schritte 2.7-2.9, um die zweite Netzhaut zu isolieren.

3. Netzhautdissoziation

HINWEIS: Alle folgenden Schritte (bis zur Zellernte) müssen in einer A2- oder B2-Biosicherheitskabine (BSC) durchgeführt werden.

  1. Stellen Sie das Papain/DNase I-Dissoziationsgemisch wie folgt her.
    1. Für sechs Netzhäute werden 75 μL DNase I in die Tube mit 750 μL Papain (ab Schritt 1.3) gegeben und vorsichtig gemischt (Dissoziationsmischung).
    2. Für die individuelle Probenvorbereitung, die für dieses Protokoll erforderlich ist, teilen Sie das Gesamtvolumen von 825 μL in drei Aliquots auf: 275 μL der Mischung in einem 1,5 ml Röhrchen pro Maus (zwei Netzhäute). Berechnen Sie die erforderlichen Mengen an DNase I und Papain entsprechend.
      HINWEIS: Bis zu sechs Netzhäute können in einer Tube Papain/DNase I-Mischung dissoziiert werden. Die individuelle Probenvorbereitung führt jedoch zu weniger Klumpen und einem besseren Zellwachstum als bei kombinierten Proben.
  2. Übertragen Sie zwei Netzhäute auf die Dissoziationsmischung Papain/DNase I. Verwenden Sie eine Transferpipette mit einem vergrößerten Spitzendurchmesser (Schritt 2.8.1), nehmen Sie die Netzhaut auf, warten Sie, bis sich die Netzhaut am unteren Rand der Spitze absetzt, und geben Sie dann die Netzhaut ohne übermäßige HBSS in den Schlauch frei, der das Papain/DNase I-Gemisch enthält.
  3. Auf einen Nutator legen und 10 min in einem Zellkultur-Inkubator (37 °C, 5% CO2) inkubieren.
  4. Dissoziieren Sie die Zellen, indem Sie vorsichtig mit einer 1-ml-Pipette (ca. 20-30 mal) auf und ab pipettieren. Nachdem die Zellen dissoziiert wurden (d.h. was zu einer homogenen Lösung ohne Brocken führt), fügen Sie 275 μL Ovomucoid-Proteasehemmer aus dem Papain-Dissoziationskit hinzu, um das Papain zu neutralisieren. Vorsichtig durch Pipettieren auf und ab mischen.
    HINWEIS: Wenn sechs Netzhäute in 825 μL Papain/DNase I-Mischung dissoziiert wurden, sind 825 μL Ovomucoid erforderlich.
  5. Zentrifugieren Sie das Gemisch bei 300 x g für 10 min bei 4 °C.
  6. Fügen Sie dem berechneten Volumen des bei 37 °C vorerwärmten Wachstumsmediums (1 ml pro 1 ml des Wachstumsmediums, rekonstituiert bei 200 μg/ml in PBS) den epidermalen Wachstumsfaktor (EGF, 1 μl pro 1 ml des Wachstumsmediums, rekonstituiert bei 200 μg/ml in PBS) hinzu.
    HINWEIS: Je nach experimentellem Design können zu Beginn der Kulturperiode der Proliferationsmarker 5-Ethynyl-2'-desoxyuridin (EdU) sowie 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) oder andere erforderliche Faktoren hinzugefügt werden.
  7. Entfernen Sie die Röhrchen vorsichtig aus der Zentrifuge. Berühren Sie nicht das Pellet am Boden des Rohres.
  8. Entfernen Sie den Überstand vorsichtig und vollständig. Resuspendiert das Zellpellet mit 500 μL EGF-ergänztem Wachstumsmedium.
  9. Übertragen Sie die Zellsuspension in eine Vertiefung der markierten 12-Well-Platte (Abbildung 2C). Spülen Sie das Röhrchen mit weiteren 500 μL des EGF-ergänzten Wachstumsmediums aus und geben Sie es dem Bohrloch hinzu (Gesamtvolumen von 1 ml pro Well).
  10. Wiederholen Sie die Schritte 3.8 und 3.9 mit allen anderen Beispielen.
  11. Schaukeln Sie die Bohrlochplatte dreimal vorsichtig (hin und her; links und rechts). Legen Sie die Platte in den Inkubator (37 °C, CO2).
    HINWEIS: Wenn transgene Mäuse verwendet werden, führen Sie eine Genotypisierung für jedes Tier durch (Abbildung 2D). Identifizieren Sie positive und negative Mäuse der Cre-Rekombinase und kennzeichnen Sie die Platte entsprechend. Für dieses Protokoll wurden nur Zellen von Cre-Rekombinase-positiven Reportermäusen für die nächsten Schritte verwendet. Zellen von Cre-negativen Proben werden eingefroren und für andere Anwendungen verwendet.

4. Wachstumsphase

HINWEIS: Die Wachstumsphase hat eine Dauer von ca. 4-5 Tagen (Abbildung 1B). Für die Zugabe von Flüssigkeiten zu Vertiefungen, die Zellen enthalten, muss die Pipette auf die Wand des Brunnens zeigen und die Flüssigkeit muss langsam freigesetzt werden, um eine Zellablösung zu vermeiden. Pipetten Sie nicht direkt auf die Zellen.

  1. Entfernen Sie einen Tag nach der Dissoziation das Medium und fügen Sie 1 ml frisches EGF-ergänztes Wachstumsmedium hinzu.
  2. Entfernen Sie am Tag 3 das Medium und fügen Sie 1 ml HBSS (Raumtemperatur) hinzu, um Zelltrümmer zu entfernen. Felsen Sie sanft von links nach rechts hin und her. Entfernen Sie HBSS, wiederholen Sie den Waschschritt und fügen Sie 1 ml vorgewärmtes EGF-ergänztes Wachstumsmedium hinzu.
  3. Überwachen Sie die Zellen jeden Tag und bewerten Sie ihren Wachstumsstatus, bis die Zellen eine 90% -100% ige Konfluenz erreichen. Abbildung 3 zeigt ein Beispiel für ein gutes MG-Wachstum im Laufe der Zeit. Überprüfen Sie auf mögliche Kontamination oder Zelltod (Ergänzende Abbildung 1). Entsorgen Sie kontaminierte Kulturen.
    HINWEIS: Um den Zellzustand zu überwachen und aufzuzeichnen, nehmen Sie Bilder mit verschiedenen Vergrößerungen mit einem Lichtmikroskop mit angeschlossener Kamera und 4x-, 10x- oder 20x-Objektiven auf. In dieser Studie wird ein Fluoreszenzmikroskop verwendet.

5. Herstellung von Deckgläsern mit Poly-L-Ornithin (Poly-O) und Laminin-Beschichtung

HINWEIS: Dieser Schritt ist nur notwendig, wenn eine Immunfluoreszenzmarkierung und eine konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie durchgeführt werden. Für die ordnungsgemäße Bildgebung sind runde Glasabdeckungen (12 mm Durchmesser) erforderlich. Das Beschichtungsprotokoll finden Sie auch im Datenblatt des neuronalen Mediums (siehe Materialtabelle).

  1. Platzieren Sie sterile Deckgläser vorsichtig in der Mitte jedes Brunnens einer 24-Well-Platte mit sterilen Dumont-#2AP Pinzetten.
    HINWEIS: Legen Sie Deckgläser in die Mitte des Brunnens. Das Anbringen von Deckgläsern in der Nähe der Wand eines Brunnens verursacht bei den folgenden Schritten Probleme mit der Oberflächenspannung.
  2. Tauen Sie ein 2,5 mL Poly-O Aliquot bei Raumtemperatur auf und legen Sie 100 μL davon in die Mitte jedes Deckglases.
  3. Inkubieren Sie die Bohrlochplatte für 30 min in einem 37 °C Inkubator.
  4. Entfernen Sie Poly-O und waschen Sie den Brunnen dreimal mit dem Deckglas mit ~ 1 ml sterilem Wasser.
  5. Lassen Sie die Brunnenplatte über Nacht im BSC trocknen. Tauen Sie 2,5 ml Laminin bei 4 °C über Nacht auf.
  6. Am nächsten Morgen 100 μL Laminin in die Mitte jedes Deckglases geben und 4 h in einem 37 °C Inkubator inkubieren.
  7. Entfernen Sie das Laminin vorsichtig und vollständig.
  8. Halten Sie die Platte bei 4 °C, wenn das Passieren nicht sofort durchgeführt werden kann.
    HINWEIS: Die beschichteten Deckgläser in vorbereiteten Platten können einige Tage bei 4 °C aufbewahrt werden.

6. Zellpassage zur Entfernung neuronaler Überlebender

HINWEIS: Die Zellpassage ist erforderlich, um neuronale Zellen zu entfernen, nicht um die Zellpopulation zu erhöhen. Glia teilen sich nur ein paar Mal und werden nach der Passage nicht weiter wachsen. Zellsuspensionen nicht verdünnen. Die Zellen einer konfluierenden Vertiefung einer 12-Well-Platte können auf eine Vertiefung einer 12-Well-Platte oder zwei Wells einer 24-Well-Platte verteilt werden. Bei der Verwendung von beschichteten Deckgläsern wird nur etwa ein Drittel des Deckglases beschichtet. Daher können sechs Deckgläser, die in einer 24-Well-Platte mit konfluierenden Zellen (~ 80% -90%) sitzen, aus einer Vertiefung von konfluierenden Zellen einer 12-Well-Platte erhalten werden. Andere Verhältnisse können ebenfalls gewählt werden, um die Zelldichte zu erhöhen oder zu verringern. Für dieses Protokoll wird eine Cre+ Reportermaus verwendet [ein Experiment, zwei Behandlungen: miR-25 oder control-miR; technische Replikate n = 3 (drei Deckgläser pro Behandlung), biologisches Replikat n = 1]. Die Anzahl der technischen und biologischen Replikate kann je nach Versuchsplan unterschiedlich definiert werden.

  1. Überprüfen Sie, ob die Zellen zu 90% -100% konfluent sind (auch am Rand des Bohrlochs; Abbildung 3E,F).
  2. Entfernen Sie das Medium und geben Sie 1 ml HBSS (Raumtemperatur) zum Waschen. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig (hin und her, links und rechts). Entfernen Sie HBSS vollständig.
  3. Fügen Sie 500 μL einer vorgewärmten trypsinhaltigen Lösung hinzu (vorgewärmt bei 37 °C in einem Metallperlenbad), um die Zellen aus dem Brunnen zu lösen. Sanft schaukeln (hin und her, von links nach rechts) und 2 min in einem 37 °C Inkubator inkubieren.
  4. Verschieben Sie die Platte vom Inkubator nach BSC. Saugen Sie beim Kippen die trypsinhaltige Lösung ab und verteilen Sie sie mehrmals vorsichtig und langsam über den Brunnen, bis sich die Zellen vollständig lösen. Halten Sie die Platte gegen das Licht und stellen Sie sicher, dass unten keine Zellen mehr vorhanden sind.
  5. Übertragen Sie diese Zellsuspension in ein steriles 1,5-ml-Röhrchen. Zentrifuge bei 300 x g für 8 min bei 4 °C.
  6. Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet vorsichtig, indem Sie 600 μL (100 μL pro Vertiefung für 6 Vertiefungen/Deckgläser) vorgewärmtes Wachstumsmedium (ergänzt mit EGF; 1:1000) hinzufügen. und Pipettieren auf und ab ~30-40 mal.
    HINWEIS: Die Zellen können zu diesem Zeitpunkt bei -80 °C oder in flüssigem Stickstoff eingefroren und nach Standardprotokollen zum Auftauen von Zelllinien aufgetaut werden. Wenn Zellen eingefroren werden, werden sie nicht in EGF-ergänztem Medium (Wachstumsmedium) resuspendiert. Sie werden in Basismedium (ohne EGF) und Gefrierlösung (Verhältnis 1/1) resuspendiert. In den Schritten 6.1.1 bis 6.6.2 werden die Schritte zum Einfrieren der Zellen beschrieben. Wenn keine Zellen eingefroren sind, fahren Sie mit Schritt 6.7 fort.
    1. Bereiten Sie die Gefrierlösung vor, indem Sie 100 μL DMSO und 400 μL FBS (Gesamtvolumen von 500 μL pro Well/Probe) mischen.
    2. Resuspendiert das Zellpellet in 500 μL vorerwärmtem Wachstumsmedium. Fügen Sie die Zellsuspension zu 500 μL DMSO/FBS-Gefrierlösung (Gesamtvolumen von 1 ml) hinzu. Halten Sie die Röhrchen auf Eis, bis alle Proben verarbeitet sind. Zellen bei -20 °C für 1 h einfrieren und dann bei -80 °C lagern.
  7. Samenzellen durch Platzieren von 100 μL der 600 μL Zell-/Mediensuspension (Schritt 6.6) in der Mitte von sechs beschichteten Deckgläsern (siehe Schritt 5) der 24-Well-Platte. Legen Sie die Platte vorsichtig in den Inkubator und lassen Sie die Zellen absetzen.
    HINWEIS: 100 μL der 600 μL Zellsuspension (geerntet aus einer Vertiefung einer 12-Well-Platte) führen zu einer Zellkonfluenz von 90% -100%, die für die Transfektion erforderlich ist.
  8. Überprüfen Sie die Zellen nach 3 h, um zu sehen, ob sie sich auf dem Deckglas abgesetzt haben. Fügen Sie 400 μL Wachstumsmedium hinzu, das mit EGF ergänzt wird.
    HINWEIS: Die Zellen sind in der Regel am nächsten Tag für die Transfektion bereit (Abbildung 3G). Wenn nicht konfluent (90%-100%), lassen Sie sie für einen anderen Tag. Wenn immer noch nicht konfluent, verwenden Sie sie nicht für die Transfektion. Wenn andere nachgelagerte Anwendungen wie miRNA-Profiling, RNA-Seq, RT-qPCR oder Western Blot durchgeführt werden, müssen Zellen in 12-Well-Platten (Verhältnis 1: 1; keine Plattenbehandlung erforderlich) geleitet und für die RNA / Protein-Extraktion geerntet werden.

7. Transfektion

HINWEIS: Die Transfektionsphase besteht aus einer 3-stündigen Phase nur im Transfektionsmedium (Transfektionsverfahren sind im Transfektionshandbuch beschrieben, das mit dem Transfektionsreagenz geliefert wird) und einer länglichen Phase, in der Transfektionsreagenz und miRNAs noch vorhanden sind, aber neuronales Medium mit erforderlichen Ergänzungen hinzugefügt wird (Gesamtdauer beträgt 2 Tage; Abbildung 1B). In diesem Protokoll werden sechs Wells transfiziert: Drei Wells erhalten die reprogrammierende miRNA miR-25 und drei Wells erhalten die Kontroll-miRNA.

  1. Überprüfen Sie, ob die Zellen eine Konfluenz von 90% erreicht haben und zeichnen Sie die Zellen vor der Transfektion auf.
  2. Entfernen Sie das Wachstumsmedium und fügen Sie 500 μL HBSS (Raumtemperatur) hinzu, um die Zellen zu waschen.
  3. Entfernen Sie HBSS und fügen Sie 400 μL reduziertes Serummedium hinzu, das für Transfektionen verwendet wird. Legen Sie die Platte wieder in einen 37 °C Inkubator.
  4. Bereiten Sie das Transfektionsgemisch vor, indem Sie die Anweisungen des Transfektionsreagenzprotokolls des Herstellers befolgen. Machen Sie zwei Mischungen: Transfektionsreagenzienmischung und miRNA-Mischung (siehe Abbildung 1B zur Veranschaulichung).
    1. Bereiten Sie das Transfektionsreagenzgemisch vor: Für eine 24-Well-Platte sind 49 μL reduziertes Serummedium und 1 μL Transfektionsreagenz für eine Vertiefung (insgesamt 50 μL) erforderlich. Für sechs Vertiefungen werden 294 μL reduziertes Serummedium und 6 μL Transfektionsreagenz kombiniert und gut gemischt, indem vorsichtig auf und ab pipettiert wird.
    2. Vorbereiten der miRNA-Mimikmischung: Für eine 24-Well-Platte ist ein Gesamtvolumen von 50 μL der mimischen Mischung für eine Vertiefung erforderlich. Drei Bohrlöcher erhalten die Kontroll-miRNA und die anderen drei Bohrlöcher werden mit miR-25 behandelt. Für dieses Protokoll wird eine Endkonzentration von 200 nM verwendet.
      1. Für die miR-25-Behandlung (drei Vertiefungen) werden 150 μL reduziertes Serummedium und 3 μL miR-25-Mimics (100 μM Stammlösung) kombiniert und durch sanftes Pipettieren auf und ab gut gemischt. 5 min inkubieren
        Für die Behandlung von Kontrollmimiken (drei Vertiefungen) werden 150 μL reduziertes Serummedium und 3 μL Kontroll-miRNA-Mimics (100 μM Stammlösung) kombiniert und durch sanftes Auf- und Abpipettieren gut gemischt. 5 min inkubieren
        HINWEIS: Das Volumen der miRNA-Nachahmungen hängt vom Verdünnungsfaktor und der erforderlichen Konzentration ab (20-500 nM). miRNA-Inhibitoren (AntagomiRs) oder andere Moleküle einschließlich Plasmide können ebenfalls verwendet werden. Auch Kombinationen von Molekülen können transfiziert werden.
  5. Kombinieren Sie miRNA-Mimikmischung und Transfektionsreagenzmischung. Vorsichtig mischen, indem Sie langsam und gründlich pipettieren, indem Sie vorsichtig auf und ab pipettieren. 20 min bei Raumtemperatur inkubieren (nach Herstellerangaben).
  6. Fügen Sie die obige Transfektionsmischung tropfenweise und langsam auf die Zellen hinzu, nahe der Medienoberfläche in der Vertiefung mit einer 20-μL-Pipette. Schaukeln Sie die Platte vorsichtig (hin und her, von links nach rechts).
  7. Inkubieren Sie in einem 37 °C Inkubator für 3 h.
  8. Nach 3 h fügen Sie den Vertiefungen (500 μL pro Well) neuronales Medium hinzu, ergänzt mit 4-Hydroxytamoxifen (5 mM Stamm, rekonstituiert mit 2,58 ml Ethanol, 250 nM Endkonzentration), um die Cre-Rekombinase und 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU, 10 mM Stammlösung, rekonstituiert mit 2 ml DMSO, 1 μM Endkonzentration) zu aktivieren, um die Zellproliferation zu verfolgen.
    ACHTUNG: 4-Hydroxytamoxifen und EdU sind als menschliche Karzinogene, Teratogene und Mutagene bekannt. Lesen Sie vor dem Gebrauch das Sicherheitsdatenblatt und tragen Sie Handschuhe, Schutzbrillen und Laborkittel. Rekonstituieren Sie beide Reagenzien gemäß den Empfehlungen des Herstellers. Inhalieren Sie den Stoff/das Gemisch nicht. Nach Gebrauch fest verschlossen. Abfallstoffe müssen gemäß den nationalen und lokalen Vorschriften entsorgt werden. Waschen Sie Hände und Gesicht nach der Arbeit mit der Substanz.
  9. Inkubieren Sie 2 Tage lang in einem Inkubator mit einer Temperatur von 37 °C (Abbildung 1B).

8. Zellumwandlung

HINWEIS: Die Zellumwandlungsphase hat eine Dauer von ca. 5-6 Tagen (Abbildung 1B), längere Zeiträume sind jedoch möglich.

  1. Überprüfen Sie die Zellen täglich auf eine erfolgreiche Induktion der tdTomatenexpression, einen möglichen Zelltod und / oder eine Kontamination. Die Zelldichte ändert sich nicht (Abbildung 4). Die ersten schwachen roten, fluoreszierend markierten Zellen können 1 Tag nach der 4-Hydroxytamoxifen-Behandlung beobachtet werden. Ein Fluoreszenzmikroskop ist erforderlich, um die Zellen zu überwachen und abzubilden.
    HINWEIS: In dieser Studie wird ein Fluoreszenzmikroskop für die Live-Bildgebung verwendet. Die Bilder werden mit 4x-, 10x- oder 20x-Objektiven aufgenommen.
  2. Entfernen Sie zwei Tage nach der Transfektion das Medium und fügen Sie 500 μL vorerwärmtes neuronales Medium, ergänzt mit 4-Hydroxytamoxifen und EdU, in jede Vertiefung hinzu.
  3. Ersetzen Sie das Medium jeden zweiten Tag durch ein frisches Medium, bis die Zellen geerntet sind.
  4. Nehmen Sie Live-Bilder auf, um die Anzahl der rot fluoreszierenden (Ascl1-exprimierenden) Zellen und ihre morphologischen Veränderungen zu bewerten und zu bewerten (Abbildung 4 und Abbildung 5A-C).

9. Zellernte: Fixierung zur Immunfluoreszenzmarkierung

HINWEIS: Zellen können für andere nachgelagerte Anwendungen geerntet werden, einschließlich Bulk oder scRNA-Seq, RT-qPCR oder Western Blot.

  1. Entfernen Sie das Medium und fügen Sie 500 μL kaltes HBSS (4 °C) pro Vertiefung hinzu und schwingen Sie die Platte vorsichtig (hin und her, von links nach rechts). Entfernen Sie HBSS.
  2. Fixieren Sie die Zellen durch Zugabe von 500 μL 2% Paraformaldehyd (PFA) und inkubieren Sie für 20 Minuten bei Raumtemperatur.
  3. Führen Sie eine Immunfluoreszenzmarkierung gemäß den festgelegten Protokollen durch.

Ergebnisse

Dieses Protokoll beschreibt, wie man MG aus P12-Maus-Netzhäuten züchtet und wie man diese Zellen mit miR-25 mit der Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-Reportermaus in Netzhautneuronen umprogrammiert. Diese Methode wurde in früheren Arbeiten verwendet, in denen detailliert über andere geeignete miRNAs (Mimics oder Inhibitoren, als Einzelmoleküle oder in Kombination) berichtet wurde, um MG in RPC umzuprogrammieren, die dann neuronale Zelleigenschaften annehmen27. D...

Diskussion

Dieses Protokoll beschreibt, wie MG aus dissoziierten Mausnetzhäuten für Reprogrammierungsstudien mit miRNAs gezüchtet werden kann. Wie in einer Vielzahl früherer Studien gezeigt und bestätigt wurde, ist die überwiegende Mehrheit (80% -90%) der in diesen Kulturen gefundenen Zellen MG20,23,24. Diese Methode ist eine sehr robuste und zuverlässige Technik und die Ergebnisse können leicht reproduziert werden, wenn das Protok...

Offenlegungen

Ein Patent, das einige der Ergebnisse dieses Berichts enthält, wurde von der University of Washington bei den Erfindern Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl und Thomas A. Reh angemeldet. Das Patent trägt den Titel "Methoden und Zusammensetzungen zur Stimulierung der Netzhautregeneration.

Danksagungen

Die Autoren danken Dr. Ann Beaton und allen Labormitgliedern für ihren Beitrag zum Manuskript. Besonderer Dank geht an Dr. Tom Reh, Dr. Julia Pollak und Dr. Russ Taylor für die Einführung von MG-Primärkulturen als Screening-Tool für S.G.W. während der Postdoc-Ausbildung an der University of Washington in Seattle. Die Studie wurde durch den Empire Innovation Program (EIP) Grant an S.G.W. und Start-up-Mittel von SUNY Optometry an S.G.W. sowie den R01EY032532 Award des National Eye Institute (NEI) an S.G.W. finanziert.

Materialien

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
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231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
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1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

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