JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

תרביות ראשוניות של Müller glia המתקבלות מרשתיות עכברים מייצגות כלי חזק ואמין מאוד לחקר המרת גליה לתאי אב רשתית לאחר טיפול במיקרו-רנ"א. ניתן לבדוק מולקולות בודדות או שילובים לפני היישום הבא של גישות in vivo .

Abstract

Müller glia (MG) הם הגליה השולטת ברשתית העצבית ויכולים לתפקד כמקור רגנרטיבי לנוירונים ברשתית. אצל בעלי חוליות נמוכים יותר כגון דגים, התחדשות מונעת MG מתרחשת באופן טבעי; ביונקים, לעומת זאת, נדרש גירוי עם גורמים מסוימים או מניפולציה גנטית/אפיגנטית. מכיוון ש-MG מהווה רק 5% מאוכלוסיית תאי הרשתית, יש צורך במערכות מודל המאפשרות לחקור את אוכלוסיית התאים הזו באופן בלעדי. אחת ממערכות המודל הללו היא תרביות MG ראשוניות הניתנות לשחזור וניתן להשתמש בהן למגוון יישומים, כולל סינון וזיהוי של מולקולות/גורמים, בדיקת תרכובות או גורמים, ניטור תאים ו/או בדיקות פונקציונליות. מודל זה משמש לחקר הפוטנציאל של מורין MG להמיר לנוירונים ברשתית לאחר תוספת או עיכוב של מיקרו-רנ"א (miRNA) באמצעות טרנספקציה של miRNA מלאכותיים או מעכביהם. השימוש בעכברי דיווח ספציפיים ל-MG בשילוב עם תיוג אימונופלואורסצנטי וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq) אישר כי 80%-90% מהתאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG. באמצעות מודל זה, התגלה כי miRNAs יכולים לתכנת מחדש את MG לתאי אב רשתית (RPCs), אשר לאחר מכן מתמיינים לתאים דמויי נוירונים. היתרונות של טכניקה זו הם שניתן לבחון מועמדים ל-miRNA על יעילותם ותוצאתם לפני השימוש בהם ביישומי in vivo .

Introduction

גליה מולר (באנגלית: Müller glia) היא הגליה השולטת ברשתית העצבית. יש להם תפקודים דומים בהשוואה לגליה אחרים בחלקים אחרים של מערכת העצבים המרכזית, כגון שמירה על הומאוסטזיס של מים ויונים, הזנת נוירונים והגנה על הרקמה. ל-MG יש תכונה מרתקת נוספת: למרות שהם גליה בוגרים, הם עדיין מבטאים גנים רבים המתבטאים בתאי אב רשתית (RPCs) במהלך התפתחות מאוחרת 1,2. ההנחה היא שדמיון זה הוא הסיבה להתחדשות העצבית הטבעית המבוססת על MG ברשתית הדגים לאחר נזק לרשתית 3,4. במהלך תהליך זה, MG נכנסת מחדש למחזור התאים ומתמיינת מחדש ל-RPCs שלאחר מכן מתמיינים לכל ששת הסוגים של נוירוני הרשתית. למרות שתופעה זו מתרחשת באופן טבעי בדגים, יונקים MG אינם ממירים לנוירונים 5,6. עם זאת, ניתן לתכנת אותם מחדש. הודגם כי מגוון גורמים מתכנתים מחדש את MG ל-RPCs/נוירונים; בין גורמים אלה נמצא גורם השעתוק הבסיסי סליל-לולאה-סליל (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) המעורב בהתחדשות דגים 7,8. בעכברים, Ascl1 מתבטא רק ב-RPCs במהלך רטינוגנזה, אך הוא נעדר ב-MG בוגר או בתאי עצב ברשתית9.

תכנות מחדש של תאים ישירות in vivo הוא לא רק מאתגר מבחינה מתודולוגית, אלא גם דורש אישור מוועדה מוסדית לטיפול בבעלי חיים ולשימוש בהם. כדי לקבל אישור, נדרשים נתונים ראשוניים על הגורמים שבהם נעשה שימוש או שינוי, ריכוזים, השפעות מחוץ למטרה, מנגנונים בסיסיים, רעילות ויעילות. מערכות תרביות תאים מאפשרות בדיקה של קריטריונים אלה לפני השימוש במודלים in vivo. יתר על כן, מכיוון ש-MG מהווים רק כ-5% מכלל אוכלוסיית תאי הרשתית10, תרביות MG מאפשרות לחקור את תפקודן11 וכן את התנהגותן, כולל נדידה12,13, התפשטות14, תגובת עקה לפציעה/נזק15,16, האינטראקציה שלהן עם סוגי תאים אחרים כגון מיקרוגליה17 או תאי גנגליון רשתית (RGCs)18, או הפוטנציאל הנוירוגני שלהם 19,20,21. חוקרים רבים משתמשים בקווי תאים מונצחים לצורך המחקרים שלהם מכיוון שיש להם פוטנציאל התפשטות בלתי מוגבל וניתן לתחזק אותם בקלות ולתמר אותם. תאים ראשוניים, לעומת זאת, עדיפים על מבחנים רלוונטיים מבחינה ביולוגית מאשר תאים מונצחים, שכן יש להם מאפייני תאים אמיתיים (ביטוי גנים וחלבונים), וחשוב מכך, הם מייצגים שלב מסוים בהתפתחות ולכן יש להם "גיל". גילו של בעל חיים (וכתוצאה מכך של התאים המתקבלים מבעל חיים) הוא גורם מכריע במיוחד בתכנות מחדש של התאים, שכן הפלסטיות של התאים פוחתת עם התקדמות שלב ההתפתחות22.

פרוטוקול זה מתאר בפירוט כיצד לתכנת מחדש MG ראשוני עם miRNAs כשיטת מבחנה נוכחית לחקר התחדשות. מודל תרבית ראשוני זה של MG הוקם בשנת 2012 כדי להעריך את מאפייני התפשטות התאים של MG בעכברי נוק-אאוט P53 (trp53-/- עכברים)23. הודגם כי MG מתורבתים שומרים על תכונות הגליה שלהם (כלומר, ביטוי של חלבוני S100β, Pax6 ו-Sox2 שהוערכו באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי), וכי הם דומים ל-in vivo MG (מיקרו-מערך של MG מטוהר FACS)23. זמן קצר לאחר מכן, mRNA גליאלי וביטוי חלבונים אומתו ואושרו בגישה שונה באמצעות וקטורים נגיפיים20. כמה שנים לאחר מכן, אושר כי הרוב המכריע של התאים שנמצאים בתרביות אלה הם MG על ידי שימוש בעכבר Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl reporter24 הספציפי ל-MG. יתר על כן, כימות של קבוצת ה-miRNAs הן ב-MG המטוהר ב-FACS והן ב-MG ראשי מתורבת הראה כי הרמות של MG miRNAs (mGLiomiRs) אינן משתנות הרבה ב-MG מתורבת במהלך שלב הצמיחה. עם זאת, תקופות תרבית מוארכות גורמות לשינויים ברמות ה-miRNA וכתוצאה מכך ברמות ה-mRNA ובביטוי החלבון, שכן miRNA הם מווסתים תרגומיים25.

בשנת 2013, מודל תרבית MG זה שימש לבדיקת מגוון גורמי שעתוק ביחס ליכולתם לתכנת מחדש את MG לנוירונים ברשתית20. Ascl1 נמצא כגורם תכנות מחדש חזק ואמין מאוד. ביטוי יתר של Ascl1 באמצעות וקטורים ויראליים גרם לשינויים מורפולוגיים, ביטוי של סמנים עצביים ורכישת תכונות אלקטרופיזיולוגיות עצביות. חשוב מכך, התובנות והתוצאות שהתקבלו מניסויים ראשונים אלה במבחנה הועברו בהצלחה ליישומי in vivo 22,26, מה שמדגים כי תרבויות MG ראשוניות מייצגות כלי מוצק ואמין להקרנות גורמים ראשוניות ולהערכה של תכונות גליה לפני יישום in vivo.

לפני מספר שנים, הוכח כי miRNA miR-124 המועשר במוח, אשר מתבטא מאוד גם בתאי עצב ברשתית, יכול לגרום לביטוי Ascl1 בתרבית MG21. ביטוי Ascl1 בתאים חיים הודגם באמצעות עכבר כתב Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). עכבר עיתונאי הוא עכבר מהונדס גנטית שיש לו גן עיתונאי המוחדר לדנ"א שלו. גן מדווח זה מקודד לחלבון עיתונאי, שנמצא במחקר זה tdTomato, חלבון פלואורסצנטי אדום. חלבון כתב זה מדווח על ביטוי של גן בעל עניין, במקרה זה, Ascl1. במילים אחרות, תאים המבטאים Ascl1 יהפכו לאדומים. מכיוון ש- Ascl1 מתבטא רק ב- RPCs9, עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl זה מאפשר מעקב אחר המרת MG ל- Ascl1 המבטאת RPCs, כלומר המרת תאים תבטא חלבון כתב tdTomato פלואורסצנטי אדום. זהו תיוג בלתי הפיך מכיוון שהדנ"א של תאים אלה משתנה. כתוצאה מכך, כל התמיינות עצבית עוקבת תודגם מכיוון שהתווית tdTomato נשארת בתאים מתמיינים. אם Ascl1 מבטא RPCs שמקורם ב-MG (עם תווית tdTomato) מתמיינים לנוירונים, נוירונים אלה עדיין יהיו בעלי התווית האדומה שלהם. עכבר זה, אם כן, מאפשר לא רק תיוג של RPCs שמקורם ב-MG להדמיית תאים חיים, אלא גם מאפשר מיפוי גורל ומעקב אחר שושלת של RPCs אלה שמקורם ב-MG (אדום). לאחרונה זוהתה קבוצת miRNA ב-RPCs ותרביות MG של Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter עכברים שימשו לסינון ובדיקת ההשפעה של miRNA אלה על יכולת התכנות מחדש והיעילות27. מועמד אחד, ה-RPC-miRNA miR-25, נמצא מסוגל לתכנת מחדש את MG בתרבית לתאים המבטאים Ascl1 (Ascl1-Tomato+). תאים מתוכנתים מחדש אלה מאמצים תכונות עצביות לאורך זמן, כולל מורפולוגיה עצבית (סומטה קטנה ותהליכים עדינים קצרים או ארוכים), ביטוי של תעתיקים עצביים הנמדדים באמצעות scRNA-Seq, כמו גם ביטוי של חלבונים עצביים המאומתים באמצעות תיוג אימונופלואורסצנטי27.

כאן, הפרוטוקול מפרט כיצד לגדל ולהחליף MG מעכברי P12 שהותאמו מהעבודה הקודמת 21,24,27. נבחר לפרוטוקול זה הוא miRNA miR-25 הנ"ל, miRNA המבוטא מאוד ב-RPCs, עם רמות ביטוי נמוכות ב-MG או בתאי עצב ברשתית. על מנת לבטא יתר על המידה miR-25, מורין miR-25 מחקה, כלומר, מולקולות miRNA מלאכותיות משמשות. כבקרה, נבחרים חיקויים של miRNA מ- Caenorhabditis elegans, שאין להם שום תפקיד בתאי יונקים. ההדמיה של ההמרה של MG ל-RPCs נעשתה באמצעות עכבר הכתב RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), עכבר עם רקע מעורב (זני C57BL/6, S129 ו-ICR). עם זאת, תרבות זו יכולה להתבצע עם כל זני העכברים, כולל זנים מסוג בר. בשנים האחרונות, הפרוטוקול המקורי שונה כדי לקצר את משך שלב הגדילה ואת תקופת התרבית הכוללת ולהבטיח מצב חזק יותר של תאי גליה ולמזער את מידת הניוון התאי, המתרחשת בתקופות תרבית ממושכות. חלון הזמן הרגיל של הטרנספקציה הוארך גם הוא מ-3 שעות ליומיים. כפי שצוין קודם לכן, למרות שהפרוטוקול הנוכחי מתאר תרביות MG ככלי למחקרי התחדשות, השיטה לא רק שימושית לבדיקת גורמי תכנות מחדש, אלא יכולה להיות מותאמת גם ליישומים אחרים, כולל מחקרים על התנהגות נודדת או התפשטות של MG, פרדיגמות הקשורות לפציעה/נזק לתאים, ו/או זיהוי מנגנונים ומסלולים בסיסיים.

Protocol

נהלים הנוגעים לנבדקים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) במכללת SUNY לאופטומטריה.

הערה: פרוטוקול תרבות זה מורכב משלושה שלבים: גדילה, טרנספקציה ושלב המרה. סיכום של הפרוטוקול הכולל עם ציר הזמן ניתן באיור 1.

1. הכנת מדיה וכל הריאגנטים הנדרשים

הערה: כל השלבים צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית A2 או B2 (BSC). במהלך שלב הגדילה, נעשה שימוש במדיום גדילה גבוה בסרום המורכב ממדיום עצבי בסיסי בתוספת גורם גדילה אפידרמלי (EGF). עבור שלב ההמרה, נעשה שימוש במדיום בסיסי נוירופיזיולוגי נמוך בסרום בתוספת תוספי תזונה עצביים כדי להבטיח התמיינות עצבית והישרדות.

  1. הכן מדיום גדילה (המשמש בשלב הגדילה) על ידי תוספת של 200 מ"ל של תווך עצבי בסיסי עם 20 מ"ל של סרום בקר עוברי (FBS, 10%), 1 מ"ל של 200 mM L-גלוטמין (0.5%), 2 מ"ל של פניצילין / סטרפטומיצין (1%) ו -2 מ"ל של תוסף N2 (1%). בצע סינון סטרילי (יחידות סינון עם גודל נקבובית של 0.22 מיקרומטר). מחממים מראש את המדיום באמבט חרוזי מתכת בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
  2. הכינו את המדיום העצבי (שנעשה בו שימוש בשלב ההמרה) בהתאם להוראות היצרן (ראו טבלת חומרים) על ידי הוספת 100 מ"ל של תווך בסיסי נוירופיזיולוגי ללא סרום עם 2 מ"ל של תוסף נוירונים B27 (2%), 1 מ"ל של תוסף N2 (1%), 20 μL של 100 ננוגרם/מ"ל של גורם נוירוטרופי שמקורו במוח (BDNF), משוחזר ב-0.1% אלבומין סרום בקר (BSA) במי מלח מוחץ פוספט (PBS, ריכוז סופי של 20 ננוגרם/מ"ל), 20 μL של 100 ננוגרם/מ"ל גרם נוירוטרופי שמקורו בתאי גליה (GDNF, משוחזר בתמיסת המלח המאוזנת של הנקס הסטרילית [HBSS], ריכוז סופי של 20 ננוגרם/מ"ל), 500 μL של 100 מ"ג/מ"ל דיבוטיריל-cAMP (משוחזר ב-DMSO), 70 μL של חומצה אסקורבית של 50 ng/mL (משוחזר ב-PBS סטרילי), ו-1.5 מ"ל של פניצילין/סטרפטומיצין. בצע סינון סטרילי (יחידות סינון עם גודל נקבובית של 0.22 מיקרומטר). מדיום חם מראש באמבט חרוזי מתכת של 37 מעלות צלזיוס לפני השימוש.
    הערה: ניתן לאחסן מדיה זו בטמפרטורה של 4 °C (7 °F), למשך חודש אחד.
  3. ריאגנטים משוחזרים של Papain, DNase I ו-Ovomucoid הנדרשים לדיסוציאציה של הרשתית בעקבות פרוטוקול היצרן. Aliquot 750 μL של Papain בצינורות סטריליים של 1.5 מ"ל, 75 μL של DNase I בצינורות סטריליים של 0.6 מ"ל, ו-750 μL של מעכב פרוטאז אובומוקואידי בצינורות 2 מ"ל. הקפיאו את ההקפאין ואת DNase I aliquots בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס ושמרו על אליקוטים אובומוקואידים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס כדי למנוע השפלה של הריאגנטים. להפשיר בטמפרטורת החדר ממש לפני השימוש.
    הערה: פפאין, DNase I ואובומוקואיד נמצאים בערכה הנקראת מערכת דיסוציאציה של פפאין (ראו טבלת חומרים).
  4. משחזרים פולי-L-אורניתין (Poly-O) ולמינין לציפוי כיסוי אם התווית immunofluorescent מבוצעת בהתאם להוראות גיליון הנתונים (Poly-O: 0.1 מ"ג/מ"ל במים סטריליים; למינין: לדלל 1.2 מ"ג/מ"ל בשעה 1:50 ב-DMEM). Aliquot Poly-O ו- Laminin (2.5 מ"ל) ולהקפיא אליקוטים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס. להפשיר בטמפרטורת החדר ממש לפני השימוש.
    הערה: שלב 1.4. נדרש רק אם מתבצעת התוויה אימונופלואורסנטית ומיקרוסקופיה לסריקת לייזר.

2. מיצוי עכברים ורקמות

הערה: עבור מחקרי תכנות מחדש אלה, עכבר Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl נוצר על ידי חציית עכבר Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) עם עכבר tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). לעכבר זה יש רקע מעורב (C57BL/6, S129 וזן ICR). הגנוטיפ של העכבר הזה מוצג באיור 1A. ניתן להשתמש בכל הזנים לפרוטוקול זה.

  1. לבשו כפפות וחטאו את סביבת העבודה, כולל מיקרוסקופ דיסקציה וכל הכלים העדינים (Dumont #5 fine ו-Dumont #7 מלקחיים מעוקלים, מספריים עדינים ומספריים של Vannas) עם 70% אתנול. יש לחטא צלחת כריתה שחורה מצופה סיליקון בקוטר 10 ס"מ על ידי חשיפתה לאור UV למשך 20 דקות.
  2. הכנת כלים וצלחות למיצוי רקמות
    1. הכינו צלחת של 24 בארות לאיסוף עיניים והפרדת דגימות (שתי עיניים לכל עכבר בבאר אחת, עם תווית של מזהי עכבר) עם כ-1 מ"ל של HBSS קר (4 מעלות צלזיוס) לבאר. הניחו את צלחת 24 הבאר על הקרח.
    2. מלאו צלחת פטרי סטרילית בקוטר 10 ס"מ (לשטיפה) ואת צלחת הכריתה המצופה בסיליקון מחוטא בכמה מ"ל של HBSS קר (4 מעלות צלזיוס) כדי להבטיח שהרקמה מכוסה במלואה ב-HBSS.
    3. הכינו צינור סטרילי 1.5 מ"ל עם 1 מ"ל של 70% אתנול.
    4. הכינו צלחת תרבית של 12 בארות על ידי תיוג הצלחת במספר תרבית, תאריך, זן וכל המידע הנדרש.
  3. המתת חסד עכברי P12 בכל שיטה מאושרת.
  4. הסרת עיניים
    1. החזק בעדינות את ראש העכבר עם האגודל והאצבע המורה סביב העין.
    2. באמצעות מלקחיים מעוקלים של Dumont #7, כנסו בעדינות אל מאחורי גלגל העין וחתכו את עצב הראייה. בזהירות תוציאו את העין החוצה.
      הערה: אם משתמשים בעכברים בוגרים, אין להשתמש במלקחיים מעוקלים ולא למשוך את העין. במקום זאת חותכים בזהירות סביב כדור הארץ באמצעות מספריים עדינים; לחתוך את עצב הראייה אבל לא לחתוך את העין עצמה. השתמש במלקחיים כדי להסיר בזהירות את גלגל העין.
  5. ניקוי גלגלי עיניים
    1. טפחו את גלגל העין לזמן קצר לתוך צינור המכיל אתנול כדי למנוע נשיאת חיידקים מבעל החיים.
    2. שטפו את גלגל העין לזמן קצר בצלחת פטרי 10 ס"מ לפני שהניחו אותה בצלחת הבאר 24 על הקרח.
  6. חזור על שלבים 2.4 ו- 2.5 לעיניים האחרות. שמור את צלחת הבאר על הקרח במהלך התהליך. מניחים שתי עיניים מבעל חיים אחד בצלחת הנתיחה המונחת תחת מיקרוסקופ דיסקציה עם מקור אור.
  7. מיצוי רשתית
    1. תקן גלגל עין אחד על ידי תפיסת עצב הראייה ורקמת החיבור שמסביב לסקלרה עם מלקחיים עדינים של Dumont #5 ולחץ עליו בזהירות כנגד צלחת הנתיחה (קרנית כלפי מעלה).
    2. צרו חור במרכז הקרנית באמצעות מחט 30 גרם כדי לאפשר גישה קלה יותר למספריים של Vannas.
    3. נתחו את הקרנית סביב הגוף הציליארי באמצעות מספריים של Vannas והסירו בזהירות את הקרנית, העדשה, הקשתית והגוף הזגוגי עם מלקחיים עדינים של Dumont #5. איור 2A ממחיש עין עם הרשתית בתוכה.
    4. נתחו את הסקלרה עם מספריים של ואנה עד שמגיעים לעצב הראייה. גזור את עצב הראייה וחלץ בזהירות את הרשתית באמצעות מלקחיים עדינים של Dumont #5.
    5. השתמש בזוג שני של מלקחיים עדינים מסוג Dumont #5 כדי לדחוף את הרשתית ולאפשר הסרה מלאה של הגוף הזגוגי. איור 2B ממחיש שתי רשתות שחולצו.
  8. העברה ושטיפה
    1. חותכים כ-2.5 ס"מ מקצה פיפטת העברה סטרילית כדי להגדיל את הקוטר. בעזרת קצה זה, להרים (למצוץ פנימה) רשתיות שלמות מבלי לפגוע ברקמה.
    2. מעבירים את הרשתיות לתוך צלחת פטרי סטרילית חדשה עם HBSS קר (4 מעלות צלזיוס) ומטלטלים את המנה (קדימה ואחורה, שמאלה וימינה).
    3. בעזרת קצה פיפטת ההעברה, דחפו בזהירות את הרשתיות כדי לשטוף את תאי האפיתל של פיגמנט הרשתית (RPE).
      הערה: לחלופין, ניתן להסיר את כל הרשתית עם העדשה והגוף הזגוגי מכוס העין. לאחר מכן, ניתן להסיר את העדשה ואת הגוף הזגוגי מהרשתית שחולצה. אם הרשתית נקרעת, הקפידו לאסוף את כל החלקים לצורך דיסוציאציה; אחרת, לא יהיו מספיק כמויות של רקמות כדי לגדל שכבות של תאים נפגשים.
  9. מיד מניחים את הרשתית המבודדת בבאר חדשה ונקייה של צלחת 24 הבארות המלאה ב-1 מ"ל של HBSS. שמור את צלחת 24 הבאר על הקרח במהלך תהליך הנתיחה.
  10. חזור על שלבים 2.7-2.9 כדי לבודד את הרשתית השנייה.

3. דיסוציאציה של הרשתית

הערה: כל השלבים הבאים (עד לקצירת התאים) צריכים להתבצע בארון בטיחות ביולוגית A2 או B2 (BSC).

  1. הכינו את תערובת הדיסוציאציה של Papain/DNase I כדלקמן.
    1. עבור שש רשתיות, הוסיפו 75 μL של DNase I לתוך הצינור המכיל 750 μL של פאפאין (משלב 1.3) וערבבו בזהירות (תערובת דיסוציאציה).
    2. להכנת דגימה בודדת הנדרשת לפרוטוקול זה, חלקו את הנפח הכולל של 825 μL לשלושה aliquots: 275 μL של התערובת בצינור אחד של 1.5 מ"ל לכל עכבר (שתי רשתיות). חשב את הכמויות הנדרשות של DNase I ו- Papain בהתאם.
      הערה: ניתן לנתק עד שש רשתיות בצינור אחד של תערובת Papain/DNase I. עם זאת, הכנת דגימות בודדות מביאה לפחות גושים ולצמיחה טובה יותר של התאים מאשר בדגימות משולבות.
  2. מעבירים שתי רשתיות לתערובת הדיסוציאציה של Papain/DNase I. השתמשו בפיפטת העברה עם קוטר קצה מוגדל (שלב 2.8.1), הרימו את הרשתיות, המתינו עד שהרשתיות ישקעו בתחתית הקצה, ואז שחררו את הרשתיות ללא HBSS מוגזם לתוך הצינור המכיל תערובת Papain/DNase I.
  3. מניחים על מנוטע ומדגרים אותו למשך 10 דקות בחממת תרביות תאים (37 מעלות צלזיוס, 5% CO2).
  4. נתקו את התאים על ידי צניחה קפדנית למעלה ולמטה (בערך 20-30 פעמים) עם פיפטה של 1 מ"ל. לאחר שהתאים מנותקים (כלומר, וכתוצאה מכך נוצרת תמיסה הומוגנית ללא גושים), הוסיפו 275 μL של מעכב פרוטאזות אובומוקואידי מהערכה לדיסוציאציה של פפאין כדי לנטרל את הפפאין. מערבבים בעדינות על ידי צנרת למעלה ולמטה.
    הערה: אם שש רשתיות נותקו ב-825 μL של תערובת Papain/DNase I, נדרש 825 μL של אובומוקואיד.
  5. צנטריפוגה את התערובת ב 300 x g במשך 10 דקות ב 4 ° C.
  6. הוסף גורם גדילה אפידרמלי (EGF, 1 μL לכל 1 מ"ל של מדיום הגדילה, משוחזר ב 200 מיקרוגרם /מ"ל ב- PBS) לנפח המחושב של מדיום גדילה (1 מ"ל לכל עכבר) שחומם מראש ב- 37 °C (37 °C).
    הערה: בהתאם לתכנון הניסויי, ניתן להוסיף את סמן ההתרבות 5-אתיניל-2'-דאוקסיורידין (EdU), כמו גם 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT) או גורמים נדרשים אחרים בתחילת תקופת התרבות.
  7. הסר את הצינורות בזהירות מהצנטריפוגה. אין לגעת בכדור בתחתית הצינור.
  8. הסר את ה-supernatant בזהירות ובאופן מלא. החייאת גלולת התא עם 500 μL של מדיום גדילה בתוספת EGF.
  9. העבר את מתלי התא לבאר אחת של הלוחית המסומנת ב-12 בארות (איור 2C). יש לשטוף את הצינור עם עוד 500 μL של מדיום הגדילה בתוספת EGF ולהוסיף אותו לבאר (נפח כולל של 1 מ"ל לבאר).
  10. חזור על שלבים 3.8 ו- 3.9 עם כל הדוגמאות האחרות.
  11. נדנדו את צלחת הבאר שלוש פעמים בזהירות (קדימה ואחורה; שמאלה, וימינה). מכניסים את הצלחת לחממה (37 מעלות צלזיוס, CO2).
    הערה: אם משתמשים בעכברים מהונדסים, בצעו גנוטיפ עבור כל בעל חיים (איור 2D). זהה את Cre רקומבינאז בעכברים חיוביים ושליליים ותייג את הצלחת בהתאם. עבור פרוטוקול זה, רק תאים של עכברי דיווח חיובי של Cre רקומבינאז שימשו לשלבים הבאים. תאים של דגימות שליליות Cre מוקפאים ומשמשים ליישומים אחרים.

4. שלב הצמיחה

הערה: משך שלב הצמיחה הוא כ-4-5 ימים (איור 1B). כדי להוסיף נוזלים לבארות המכילות תאים, הפיפטה צריכה להצביע על דופן הבאר והנוזל צריך להשתחרר לאט כדי למנוע ניתוק תאים. אין לקטר ישירות על גבי התאים.

  1. יום אחד לאחר הדיסוציאציה, הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של מדיום צמיחה טרי בתוספת EGF.
  2. ביום השלישי, הסירו את המדיום והוסיפו 1 מ"ל של HBSS (טמפרטורת החדר) כדי להסיר פסולת תאים. רוק בעדינות קדימה ואחורה משמאל לימין. הסר HBSS, חזור על שלב ההדחה והוסף 1 מ"ל של מדיום צמיחה מחומם מראש בתוספת EGF.
  3. עקוב אחר התאים מדי יום והערך את מצב הגדילה שלהם עד שהתאים יגיעו למפגש של 90%-100%. איור 3 מראה דוגמה לצמיחה טובה של MG לאורך זמן. בדוק אם יש זיהום אפשרי או מוות תאי (איור משלים 1). להשליך תרביות מזוהמות.
    הערה: כדי לנטר ולתעד את מצב התא, צלם תמונות בהגדלה שונה באמצעות מיקרוסקופ אור עם מצלמה מחוברת ומטרות של 4x, 10x או 20x. במחקר זה נעשה שימוש במיקרוסקופ פלואורסצנטי.

5. הכנת כיסויים עם פולי-L-אורניתין (Poly-O) ומעיל למינין

הערה: שלב זה נחוץ רק אם מתבצעות תיוג אימונופלואורסצנטי ומיקרוסקופיה קונפוקלית לסריקת לייזר. כיסויי זכוכית עגולים (קוטר 12 מ"מ) נדרשים להדמיה נכונה. ניתן למצוא את פרוטוקול הציפוי גם בגליון הנתונים של המדיום העצבי (ראו טבלת חומרים).

  1. הניחו בזהירות כיסויים סטריליים במרכז כל באר של צלחת בעלת 24 בארות באמצעות מלקחיים סטריליים של דומונט #2AP.
    הערה: מקם כיסויים במרכז הבאר. הצבת כיסויים קרוב לדופן הבאר תגרום לבעיות מתח פני השטח בשלבים הבאים.
  2. להפשיר 2.5 מ"ל Poly-O aliquot בטמפרטורת החדר ולהניח 100 μL ממנו במרכז כל כיסוי.
  3. דגירה של צלחת הבאר למשך 30 דקות בחממה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הסר את Poly-O ושטף את הבאר עם כיסוי שלוש פעמים עם ~ 1 מ"ל של מים סטריליים.
  5. תנו לצלחת הבאר להתייבש למשך הלילה ב-BSC. להפשיר 2.5 מ"ל של Laminin ב 4 °C (84 °F) לילה.
  6. למחרת בבוקר, הוסיפו 100 μL של למינין במרכז כל כיסוי ודגרו במשך 4 שעות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  7. הסר את הלמינין בזהירות ובאופן מלא.
  8. שמור על הצלחת ב 4 °C (64 °F) אם לא ניתן לבצע מעבר באופן מיידי.
    הערה: ניתן לשמור את הכיסויים המצופים בצלחות מוכנות במשך מספר ימים בטמפרטורה של 4 מעלות צלזיוס.

6. מעבר תא כדי להסיר ניצולים עצביים

הערה: מעבר תאים נדרש כדי להסיר תאים עצביים, לא כדי להגדיל את אוכלוסיית התאים. גליה מתחלקת רק כמה פעמים ולא תגדל עוד יותר לאחר המעבר. אין לדלל את מתלי התאים. ניתן לפזר את התאים של באר מפגש אחת של צלחת בת 12 בארות על באר אחת של צלחת בת 12 בארות או שתי בארות של צלחת בת 24 בארות. כאשר נעשה שימוש בכיסויים מצופים, רק כשליש מהכיסוי מצופה. לכן, ניתן לקבל שישה כיסויים היושבים בצלחת של 24 בארות, עם תאים מפגשיים (כ-80%-90%) מבאר אחת של תאים מתמזגים של צלחת של 12 בארות. ניתן לבחור גם ביחסים אחרים כדי להגדיל או להקטין את צפיפות התאים. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בעכבר כתב Cre+ אחד [ניסוי אחד, שני טיפולים: miR-25 או control-miR; שכפולים טכניים n = 3 (שלושה כיסויים לכל טיפול), שכפול ביולוגי n = 1]. ניתן להגדיר את מספר השכפולים הטכניים והביולוגיים באופן שונה בהתאם לתכנון הניסוי.

  1. בדוק אם התאים הם 90%-100% confluent (גם בשולי הבאר; איור 3E,F).
  2. הסר את המדיום והוסף 1 מ"ל של HBSS (טמפרטורת החדר) לשטיפה. נדנדו בעדינות את הצלחת (קדימה ואחורה, שמאלה וימינה). הסר HBSS לחלוטין.
  3. הוסיפו 500 μL של תמיסה המכילה טריפסין שחוממה מראש (שחוממה מראש בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס באמבט חרוזי מתכת) כדי לנתק את התאים מהבאר. רוק בעדינות (קדימה ואחורה, משמאל לימין) ודגירה במשך 2 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס.
  4. העבר את הצלחת מהאינקובטור ל- BSC. תוך כדי הטיה, שאפו לתמיסה המכילה טריפסין ופזרו אותה בזהירות ובאיטיות על פני הבאר מספר פעמים עד שהתאים מתנתקים לחלוטין. החזיקו את הצלחת כנגד האור וודאו שלא נותרו תאים בתחתית.
  5. מעבירים את תרחיף התא הזה לצינור סטרילי של 1.5 מ"ל. צנטריפוגה ב 300 x g במשך 8 דקות ב 4 ° C.
  6. הסר את הסופרנאטנט ובצע החייאה קפדנית של גלולת התא על ידי הוספת 600 μL (100 μL לכל באר עבור 6 בארות / כיסויים) של מדיום גדילה מחומם מראש (בתוספת EGF; 1:1000). וזינוק למעלה ולמטה ~ 30-40 פעמים.
    הערה: ניתן להקפיא את התאים בשלב זה בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או בחנקן נוזלי ולהפשיר אותם בהתאם לפרוטוקולים סטנדרטיים להפשרת קווי תאים. אם התאים מוקפאים, הם לא יוחזקו בהחייאה במדיום תוסף EGF (מדיום גדילה). הם יוחזקו מחדש במדיום בסיסי (ללא EGF) ובתמיסת הקפאה (יחס של 1/1). שלבים 6.1.1 עד 6.6.2 מתארים את השלבים להקפאת התאים. אם אין תאים קפואים, המשך עם שלב 6.7.
    1. הכן תמיסת הקפאה על ידי ערבוב של 100 μL של DMSO ו- 400 μL של FBS (נפח כולל של 500 μL לכל באר / מדגם).
    2. בצעו החייאה של כדור התא ב-500 μL של מדיום גדילה מחומם מראש. הוסף את מתלי התא ל-500 μL של תמיסת הקפאה DMSO/FBS (נפח כולל של 1 מ"ל). שמור צינורות על קרח עד שכל הדגימות מעובדות. הקפיאו תאים בטמפרטורה של -20 מעלות צלזיוס למשך שעה אחת, ולאחר מכן אחסנו בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס.
  7. תאי זרעים על ידי הצבת 100 μL של תרחיף התא/מדיה של 600 μL (שלב 6.6) במרכזם של שישה כיסויים מצופים (ראו שלב 5) של הלוח בעל 24 הבארות. מניחים את הצלחת בזהירות באינקובטור ונותנים לתאים להתיישב.
    הערה: 100 μL של תרחיף התא 600 μL (שנקטף מבאר אחת של צלחת של 12 בארות) יגרום למפגש תאים של 90%-100%, הנדרש לצורך טרנספקציה.
  8. בדוק את התאים לאחר 3 שעות כדי לראות אם הם התיישבו על הכיסוי. הוסף 400 μL של מדיום גדילה בתוספת EGF.
    הערה: תאים בדרך כלל מוכנים להעברה למחרת (איור 3G). אם לא נפגשים (90%-100%), השאירו אותם ליום אחר. אם עדיין לא confluent, אל תשתמש בהם עבור transfection. אם מתבצעים יישומים אחרים במורד הזרם, כגון פרופיל miRNA, RNA-Seq, RT-qPCR או כתם מערבי, יש להעביר את התאים ללוחות של 12 בארות (יחס של 1:1; אין צורך בטיפול בצלחת) ולקטוף אותם לצורך מיצוי RNA/חלבון.

7. טרנספקציה

הערה: שלב הטרנספקציה מורכב משלב של 3 שעות במדיום טרנספקציה בלבד (הליכי טרנספקציות מתוארים במדריך הטרנספקציה שמגיע עם ריאגנט הטרנספקציה) ושלב מוארך שבו עדיין קיימים מגיב טרנספקציה ו- miRNAs, אך מתווספים מדיום עצבי עם התוספים הנדרשים (משך הזמן הכולל הוא יומיים; איור 1B). בפרוטוקול זה יעברו שש בארות: שלוש בארות יקבלו את התכנות מחדש miRNA miR-25 ושלוש בארות יקבלו את ה-miRNA הבקרהי.

  1. בדקו אם התאים הגיעו ל-90% מפגש ותעדו/תצלמו את התאים לפני ההעברה.
  2. הסר את מדיום הגדילה והוסף 500 μL של HBSS (טמפרטורת החדר) כדי לשטוף את התאים.
  3. הסר HBSS והוסף 400 μL של מדיום סרום מופחת המשמש לטרנספקציות. החזירו את הצלחת לחממה של 37 מעלות צלזיוס.
  4. הכן את תערובת הטרנספקציה על ידי ביצוע ההוראות של פרוטוקול ריאגנט הטרנספקציה של היצרן. הכינו שתי תערובות: תערובת ריאגנטים של טרנספקציה ותערובת miRNA (ראו איור 1B להמחשה).
    1. הכינו את תערובת ריאגנט הטרנספקציה: עבור צלחת של 24 בארות, 49 μL של מדיום סרום מופחת ו-1 μL של ריאגנט טרנספקציה נדרשים לבאר אחת (50 μL בסך הכל). עבור שש בארות, 294 μL של מדיום סרום מופחת ו-6 μL של מגיב טרנספקציה משולבים ומעורבבים היטב על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה.
    2. הכינו תערובת חיקוי miRNA: עבור צלחת של 24 בארות, נדרש נפח כולל של 50 μL של תערובת החיקוי עבור באר אחת. שלוש בארות יקבלו את ה-miRNA הבקרה ושלוש הבארות האחרות יטופלו ב-miR-25. עבור פרוטוקול זה, נעשה שימוש בריכוז סופי של 200 ננומטר.
      1. עבור הטיפול ב-miR-25 (שלוש בארות), 150 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של miR-25 מחקה (תמיסת מלאי של 100 μM) משולבים ומעורבבים היטב על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. אינקובציה למשך 5 דקות
        עבור הטיפול המחקה של הבקרה (שלוש בארות), 150 μL של מדיום סרום מופחת ו-3 μL של חיקויי בקרה-miRNA (תמיסת מלאי 100 μM) משולבים ומעורבבים היטב על ידי צניחה עדינה למעלה ולמטה. אינקובציה למשך 5 דקות
        הערה: נפח החיקויים של miRNA תלוי בגורם הדילול ובריכוז הדרושים (20-500 ננומטר). ניתן להשתמש גם במעכבי miRNA (אנטגומירים), או במולקולות אחרות כולל פלסמידים. כמו כן, שילובים של מולקולות ניתנים להעברה.
  5. שלבו תערובת חיקוי miRNA ותערובת ריאגנט טרנספקציה. יש לערבב בזהירות על ידי צנרת איטית ויסודית על ידי צנרת עדינה למעלה ולמטה. דגירה למשך 20 דקות בטמפרטורת החדר (לפי הוראות היצרן).
  6. הוסיפו את תערובת הטרנספקציה הנ"ל בצורה טיפתית ולאט לאט על גבי התאים, קרוב למשטח המדיה בבאר באמצעות פיפטה של 20 μL. נדנדו את הצלחת בעדינות (קדימה ואחורה, משמאל לימין).
  7. אינקובציה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך 3 שעות.
  8. לאחר 3 שעות, הוסיפו מדיום עצבי לבארות (500 μL לכל באר) בתוספת 4-Hydroxytamoxifen (מלאי של 5 mM משוחזר עם 2.58 מ"ל של אתנול, ריכוז סופי של 250 ננומטר) כדי להפעיל את ה-Cre רקומבינאז ו-5-אתניל-2'-דאוקסיורידין (EdU, תמיסת מלאי של 10 mM משוחזרת עם 2 מ"ל של DMSO, ריכוז סופי של 1 μM) כדי לעקוב אחר התפשטות התאים.
    אזהרה: 4-הידרוקסיטאמוקסיפן ו-EdU ידועים כמסרטן אנושי, טרטוגנים ומוטגנים. קרא את גיליון נתוני בטיחות החומרים לפני השימוש והרכב כפפות, משקפי מגן ומעיל מעבדה. בנה מחדש את שני הריאגנטים על פי המלצות היצרן. אין לשאוף את החומר/התערובת. סגור היטב לאחר השימוש. יש להיפטר מחומרי פסולת בהתאם לתקנות הלאומיות והמקומיות. לשטוף ידיים ופנים לאחר עבודה עם החומר.
  9. דגירה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס למשך יומיים (איור 1B).

8. המרת תאים

הערה: שלב המרת התאים הוא בעל משך זמן של כ-5-6 ימים (איור 1B), אך תקופות ארוכות יותר אפשריות.

  1. בדוק את התאים מדי יום לאיתור אינדוקציה מוצלחת של ביטוי tdTomato, מוות פוטנציאלי של תאים ו/או זיהום. צפיפות התא אינה משתנה (איור 4). ניתן לראות לראשונה תאים בעלי תווית פלואורסצנטית אדומה קלושה יום אחד לאחר טיפול של 4-Hydroxytamoxifen. מיקרוסקופ פלואורסצנטי נדרש כדי לנטר ולדמות את התאים.
    הערה: במחקר זה, מיקרוסקופ פלואורסצנטי משמש להדמיה חיה. התמונות צולמו עם מטרות של 4x, 10x או 20x.
  2. יומיים לאחר ההעברה, הסר את המדיום והוסף 500 μL של תווך עצבי שחומם מראש בתוספת 4-Hydroxytamoxifen ו- EdU בכל באר.
  3. החליפו את המדיום במדיום טרי כל יומיים עד שהתאים נקצרים.
  4. צלם תמונות חיות לצורך הערכה והערכה של מספר התאים הפלואורסצנטיים האדומים (Ascl1 המבטאים) והשינויים המורפולוגיים שלהם (איור 4 ואיור 5A-C).

9. קצירת תאים: קיבוע לסימון אימונופלואורסצנטי

הערה: ניתן לקצור תאים עבור יישומים אחרים במורד הזרם, כולל בתפזורת או scRNA-Seq, RT-qPCR או כתם מערבי.

  1. הסר את המדיום והוסף 500 μL של HBSS קר (4 °C) לכל באר וטלטל את הצלחת בעדינות (קדימה ואחורה, משמאל לימין). הסר HBSS.
  2. תקן את התאים על ידי הוספת 500 μL של 2% Paraformaldehyde (PFA) ודגירה במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר.
  3. בצע תיוג אימונופלואורסצנטי על פי פרוטוקולים מבוססים.

תוצאות

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר P12 וכיצד לתכנת מחדש את התאים האלה עם miR-25 לנוירונים ברשתית באמצעות עכבר הכתב Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. שיטה זו שימשה בעבודה קודמת המדווחת בפירוט על miRNAs מתאימים אחרים (מחקים או מעכבים, כמולקולות בודדות או בשילוב) כדי לתכנת מחדש את MG ל-RPC שמאמ...

Discussion

פרוטוקול זה מתאר כיצד לגדל MG מרשתיות עכבר מנותקות לצורך תכנות מחדש של מחקרים באמצעות miRNAs. כפי שהוכח ואושר במגוון מחקרים קודמים, הרוב המכריע (80%-90%) של התאים שנמצאו בתרביות אלה הם MG 20,23,24. שיטה זו היא טכניקה חזקה ואמינה מאוד וניתן לשחזר בקלות ?...

Disclosures

פטנט הכולל חלק מהממצאים בדו"ח זה הוגש על ידי אוניברסיטת וושינגטון עם הממציאים ניקולאס ג'ורסטאד, סטפני ג' וואהל ותומאס א' רה. הפטנט נקרא ''שיטות והרכבים לעידוד התחדשות הרשתית.

Acknowledgements

המחברים מודים לד"ר אן ביטון ולכל חברי המעבדה על התייחסותם לכתב היד. תודה מיוחדת לד"ר טום רה, ג'וליה פולק וראס טיילור על הצגת התרבויות הראשוניות של MG ככלי סינון ל- S.G.W. במהלך הכשרת פוסט-דוקטורט באוניברסיטת וושינגטון בסיאטל. המחקר מומן על ידי מענק תוכנית החדשנות של האימפריה (EIP) ל- S.G.W. וקרנות סטארט-אפ מ- SUNY אופטומטריה ל- S.G.W., כמו גם פרס R01EY032532 ממכון העיניים הלאומי (NEI) ל- S.G.W.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

References

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t., Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
  37. Brzezinski, J. A. t., Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t., Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved