Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Fare retinalarından elde edilen Müller glia primer kültürleri, mikroRNA tedavisinden sonra retinal progenitör hücrelere glial dönüşümü incelemek için çok sağlam ve güvenilir bir araçtır. Tek moleküller veya kombinasyonlar, daha sonra in vivo yaklaşımların uygulanmasından önce test edilebilir.

Özet

Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glia'dır ve retinal nöronlar için rejeneratif bir kaynak olarak işlev görebilir. Balıklar gibi alt omurgalılarda, MG güdümlü rejenerasyon doğal olarak gerçekleşir; Bununla birlikte, memelilerde, belirli faktörlerle stimülasyon veya genetik / epigenetik manipülasyon gereklidir. MG, retinal hücre popülasyonunun sadece% 5'ini oluşturduğundan, yalnızca bu hücre popülasyonunun incelenmesine izin veren model sistemlere ihtiyaç vardır. Bu model sistemlerden biri, tekrarlanabilir ve molekül / faktör taraması ve tanımlama, bileşiklerin veya faktörlerin test edilmesi, hücre izleme ve / veya fonksiyonel testler dahil olmak üzere çeşitli uygulamalar için kullanılabilen birincil MG kültürleridir. Bu model, yapay miRNA'ların veya inhibitörlerinin transfeksiyonu yoluyla mikroRNA'ların (miRNA'lar) takviyesi veya inhibisyonundan sonra murin MG'nin retinal nöronlara dönüşme potansiyelini incelemek için kullanılır. MG'ye özgü muhabir farelerin immünofloresan etiketleme ve tek hücreli RNA dizilimi (scRNA-seq) ile birlikte kullanılması, bu kültürlerde bulunan hücrelerin% 80-90'ının MG olduğunu doğruladı. Bu modeli kullanarak, miRNA'ların MG'yi retinal progenitör hücrelere (RPC'ler) yeniden programlayabildiği keşfedildi. Bu tekniğin avantajları, miRNA adaylarının in vivo uygulamalarda kullanılmadan önce verimlilikleri ve sonuçları açısından test edilebilmeleridir.

Giriş

Müller glia (MG), nöral retinadaki baskın glialardır. Merkezi sinir sisteminin diğer bölgelerindeki diğer glia'lara kıyasla, su ve iyon homeostazını korumak, nöronları beslemek ve dokuyu korumak gibi benzer işlevlere sahiptirler. MG'nin başka bir büyüleyici özelliği daha vardır: olgun glia olmalarına rağmen, geç gelişim sırasında retinal progenitör hücrelerde (RPC'ler) eksprese edilen birçok geni hala eksprese ederler 1,2. Bu benzerliğin, retina hasarından sonra balık retinasında doğal olarak oluşan MG bazlı nöronal rejenerasyonun nedeni olduğu varsayılmaktadır 3,4. Bu işlem sırasında, MG hücre döngüsüne tekrar girer ve daha sonra altı tip retinal nöronun hepsine farklılaşan RPC'lere farklılaşır. Bu fenomen balıklarda doğal olarak meydana gelmesine rağmen, memeli MG nöronlara dönüşmez 5,6. Bununla birlikte, yeniden programlanabilirler. MG'yi RPC'lere / nöronlara yeniden programlayan çeşitli faktörler gösterilmiştir; Bu faktörler arasında balık rejenerasyonunda rol oynayan temel sarmal-döngü-sarmal (bHLH) transkripsiyon faktörü achaete-scute homolog 1 (Ascl1) 7,8'dir. Farelerde, Ascl1 sadece retinogenez sırasında RPC'lerde eksprese edilir, ancak olgun MG veya retinal nöronlardayoktur 9.

Hücrelerin doğrudan in vivo olarak yeniden programlanması sadece metodolojik olarak zor değil, aynı zamanda kurumsal bir hayvan bakımı ve kullanım komitesinin onayını gerektirir. Onay almak için, kullanılan veya değiştirilen faktör(ler), konsantrasyonlar, hedef dışı etkiler, altta yatan mekanizmalar, toksisite ve verimlilik hakkında ön veriler gereklidir. Hücre kültürü sistemleri, in vivo modellerde kullanılmadan önce bu kriterlerin test edilmesine izin verir. Dahası, MG tüm retinal hücre popülasyonunun sadece% 5'ini oluşturduğundan 10, MG kültürleri fonksiyonlarının 11'inin yanı sıra göç 12,13, proliferasyon 14, yaralanma / hasara stres reaksiyonu15,16, mikroglia 17 veya retinal ganglion hücreleri (RGC'ler) gibi diğer hücre tipleriyle etkileşimleri de dahil olmak üzere davranışlarının incelenmesine izin verir. veya nörojenik potansiyelleri 19,20,21. Birçok araştırmacı, sınırsız bir proliferatif potansiyele sahip oldukları ve kolayca korunabildikleri ve transfekte edilebildikleri için çalışmaları için ölümsüzleştirilmiş hücre hatları kullanır. Bununla birlikte, birincil hücreler, biyolojik olarak ilgili analizler için ölümsüzleştirilmiş hücrelerden daha tercih edilir, çünkü gerçek hücre özelliklerine (gen ve protein ekspresyonu) sahiptirler ve daha da önemlisi, gelişimde belirli bir aşamayı temsil ederler ve bu nedenle bir "yaş" vardır. Bir hayvanın yaşı (ve dolayısıyla bir hayvandan elde edilen hücrelerin), hücresel yeniden programlamada özellikle önemli bir faktördür, çünkü hücre plastisitesi, gelişimin ilerleme aşamasıyla azalır22.

Bu protokol, primer MG'nin miRNA'larla rejenerasyonu incelemek için akım in vitro bir yöntem olarak nasıl yeniden programlanacağını ayrıntılı olarak açıklamaktadır. Bu MG birincil kültür modeli, P53 nakavt farelerde (trp53-/- fareler)23 MG'nin hücre proliferasyon özelliklerini değerlendirmek için 2012 yılında kurulmuştur. Kültürlenmiş MG'nin glial özelliklerini koruduğu (yani, immünofloresan etiketleme yoluyla değerlendirilen S100β, Pax6 ve Sox2 proteinlerinin ekspresyonu) ve in vivo MG'ye (FACS-saflaştırılmış MG'nin mikrodizisi) benzedikleri gösterilmiştir23. Kısa bir süre sonra, glial mRNA ve protein ekspresyonu, viral vektörler20 kullanılarak farklı bir yaklaşımla doğrulandı ve doğrulandı. Birkaç yıl sonra, MG'ye özgü Rlbp1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl muhabir faresi24 kullanılarak bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğunun MG olduğu doğrulandı. Dahası, hem FACS-saflaştırılmış MG hem de kültürlenmiş primer MG'deki miRNA setinin nicelleştirilmesi, MG miRNA'larının (mGLiomiR'ler) seviyelerinin, büyüme aşamasında kültürlenmiş MG'de çok fazla değişmediğini göstermiştir. Bununla birlikte, uzamış kültür dönemleri, miRNA'lar translasyonel düzenleyiciler olduğu için miRNA seviyelerinde ve dolayısıyla mRNA seviyelerinde ve protein ekspresyonunda değişikliklere neden olur25.

2013 yılında, bu MG kültür modeli, MG'yi retinal nöronlara yeniden programlama yeteneklerine göre çeşitli transkripsiyon faktörlerini test etmek için kullanılmıştır20. Ascl1'in çok sağlam ve güvenilir bir yeniden programlama faktörü olduğu bulunmuştur. Ascl1'in viral vektörler yoluyla aşırı ekspresyonu, morfolojik değişikliklere, nöronal belirteçlerin ekspresyonuna ve nöronal elektrofizyolojik özelliklerin kazanılmasına neden olmuştur. Daha da önemlisi, bu ilk in vitro deneylerden elde edilen içgörüler ve sonuçlar, primer MG kültürlerinin in vivo uygulamadan önce ilk faktör taramaları ve glial özelliklerin değerlendirilmesi için sağlam ve güvenilir bir araç olduğunu gösteren 22,26 in vivo uygulamalara başarıyla aktarılmıştır.

Birkaç yıl önce, retinal nöronlarda da yüksek oranda eksprese edilen beyinle zenginleştirilmiş miRNA miR-124'ün, kültürlü MG21'de Ascl1 ekspresyonunu indükleyebileceği gösterilmiştir. Canlı hücrelerdeki Ascl1 ekspresyonu, bir Ascl1 muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl) aracılığıyla görselleştirildi. Bir muhabir faresi, DNA'sına yerleştirilmiş bir muhabir genine sahip genetik olarak tasarlanmış bir faredir. Bu muhabir geni, bu çalışmada kırmızı bir floresan proteini olan tdTomato'da bulunan bir muhabir proteinini kodlar. Bu muhabir proteini, ilgilenilen bir genin, bu durumda, Ascl1'in ekspresyonunu bildirir. Başka bir deyişle, Ascl1'i eksprese eden hücreler kırmızıya döner. Ascl1 yalnızca RPC9'da ifade edildiğinden, bu Ascl1 CreERT: tdDomatesSTOPfl / fl faresi, MG dönüşümünün RPC'leri ifade eden Ascl1'e dönüştürülmesinin izlenmesine izin verir, yani dönüştürücü hücreler kırmızı floresan tdDomates raporlayıcı proteinini ifade edecektir. Bu, bu hücrelerin DNA'sı değiştirildiği için geri dönüşümsüz bir etiketlemedir. Sonuç olarak, sonraki herhangi bir nöronal farklılaşma görselleştirilecektir, çünkü tdDomates etiketi farklılaşan hücrelerde kalır. MG kaynaklı RPC'leri (tdDomates etiketli) ifade eden Ascl1 nöronlara farklılaşırsa, bu nöronlar hala kırmızı etiketlerine sahip olacaktır. Bu nedenle, bu fare, yalnızca MG türevli RPC'lerin canlı hücre görüntüleme için etiketlenmesine izin vermekle kalmaz, aynı zamanda bu MG türevi (kırmızı) RPC'lerin kader haritalamasına ve soy izlemesine de izin verir. Daha yakın zamanlarda, RPC'lerdeki miRNA seti tanımlandı ve bu miRNA'ların yeniden programlama kapasitesi ve verimliliği üzerindeki etkisini taramak ve test etmek için Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl / fl RPC-reporter farelerin MG kültürleri kullanıldı27. Bir aday, RPC-miRNA miR-25, kültürlenmiş MG'yi Ascl1 eksprese eden (Ascl1-Domates +) hücrelere yeniden programlayabildiği bulundu. Bu yeniden programlanmış hücreler, nöronal morfoloji (küçük somata ve kısa veya uzun ince süreçler), scRNA-Seq ile ölçülen nöronal transkriptlerin ekspresyonu ve immünofloresan etiketleme27 ile doğrulanan nöronal proteinlerin ekspresyonu dahil olmak üzere zamanla nöronal özellikleri benimser.

Burada, protokol, önceki çalışma21,24,27'den uyarlanmış P12 farelerinden MG'nin nasıl yetiştirileceğini ve transfekte edileceğini detaylandırıyor. Bu protokol için seçilen, yukarıda belirtilen miRNA miR-25, RPC'lerde yüksek oranda eksprese edilen, MG veya retinal nöronlarda düşük ekspresyon seviyelerine sahip bir miRNA'dır. MiR-25'i aşırı eksprese etmek için murin miR-25 taklitleri, yani yapay miRNA molekülleri kullanılır. Kontrol olarak, Caenorhabditis elegans'tan bir miRNA'nın taklitleri, memeli hücrelerinde hiçbir işlevi olmayan seçilir. MG'nin RPC'lere dönüşümünün görselleştirilmesi, RPC muhabir faresi (Ascl1CreERT:tdDomatesSTOPfl/fl), karışık arka plana sahip bir fare (C57BL/6, S129 ve ICR suşları) ile gerçekleştirildi. Bununla birlikte, bu kültür, vahşi tip suşlar da dahil olmak üzere tüm fare suşlarıyla gerçekleştirilebilir. Son birkaç yılda, orijinal protokol, büyüme fazı süresini ve genel kültür dönemini azaltmak ve daha sağlam bir glia hücresi durumu sağlamak ve uzun kültür dönemlerinde meydana gelen hücresel dejenerasyon derecesini en aza indirmek için değiştirilmiştir. Düzenli transfeksiyon süresi de 3 saatten 2 güne uzatıldı. Daha önce de belirtildiği gibi, mevcut protokol MG kültürlerini rejenerasyon çalışmaları için bir araç olarak tanımlasa da, yöntem sadece yeniden programlama faktörlerini test etmek için yararlı değildir, aynı zamanda MG göçü veya proliferatif davranışı, yaralanma / hücre hasarı ile ilgili paradigmalar ve / veya altta yatan mekanizmaların ve yolların tanımlanması ile ilgili çalışmalar da dahil olmak üzere diğer uygulamalar için de uyarlanabilir.

Protokol

Hayvan denekleri içeren prosedürler, SUNY College of Optometry'deki Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

NOT: Bu kültür protokolü üç aşamadan oluşur: büyüme, transfeksiyon ve dönüşüm aşaması. Zaman çizelgesi ile genel protokolün bir özeti Şekil 1'de verilmiştir.

1. Ortamın ve gerekli tüm reaktiflerin hazırlanması

NOT: Tüm adımların bir A2 veya B2 biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir. Büyüme aşamasında, epidermal büyüme faktörü (EGF) ile desteklenmiş bir bazal nöronal ortamdan oluşan yüksek serum büyüme ortamı kullanılır. Konversiyon fazı için, nöronal farklılaşma ve sağkalımı sağlamak için nöronal takviyelerle desteklenmiş düşük serum nörofizyolojik bazal bir ortam kullanılır.

  1. 200 mL bazal nöronal besiyeri (FBS, %10), 1 mL 200 mM L-glutamin (%0.5), 2 mL penisilin/streptomisin (%1) ve 2 mL N2 takviyesi (%1) ile takviye ederek büyüme ortamı hazırlayın (büyüme aşamasında kullanılır). Steril filtreleme gerçekleştirin (0,22 μm gözenek boyutuna sahip filtre üniteleri). Kullanmadan önce ortamı 37 °C metal boncuk banyosunda önceden ısıtın.
  2. Üreticinin talimatlarını izleyerek nöronal ortam hazırlayın (bkz. Malzeme Tablosu) 100 mL serumsuz nörofizyolojik bazal ortamı 2 mL B27 nöronal takviyesi (%2), 1 mL N2 takviyesi (%1), 20 μL 100 ng/ mL beyin kaynaklı nörotrofik faktör (BDNF, fosfat tamponlu salin (PBS, nihai konsantrasyon 20 ng / mL), 100 ng / mL glia hücresi kaynaklı nörotrofik faktörün 20 μL'si (GDNF, steril Hanks'in Dengeli Tuz Çözeltisinde [HBSS], nihai konsantrasyon 20 ng / mL'de reforme olur), 500 μL 100 mg / mL Dibutyryl-cAMP (DMSO'da reforme olur), 70 μL 50 ng / mL askorbik asit (steril PBS'de reforme olur) ve 1.5 mL penisilin / streptomisin. Steril filtreleme gerçekleştirin (0,22 μm gözenek boyutuna sahip filtre üniteleri). Kullanmadan önce 37 °C metal boncuk banyosunda ön ılık ortam.
    NOT: Bu ortamlar 4 °C'de 1 ay boyunca saklanabilir.
  3. Üreticinin protokolünü izleyerek retina ayrışması için gerekli Papain, DNaz I ve Ovomukoid reaktifleri yeniden oluşturur. Steril 1.5 mL tüplerde Aliquot 750 μL Papain, steril 0.6 mL tüplerde 75 μL DNaz I ve 2 mL tüplerde 750 μL Ovomukoid proteaz inhibitörü. Papain ve DNaz I alikotlarını -20 ° C'de dondurun ve reaktiflerin bozulmasını önlemek için Ovomukoid alikotları 4 ° C'de tutun. Kullanmadan hemen önce oda sıcaklığında çözün.
    NOT: Papain, DNaz I ve Ovomukoid, Papain Dissosiyasyon Sistemi adı verilen bir kitte bulunur (bkz.
  4. Veri sayfası talimatlarını izleyerek immünofloresan etiketleme yapılırsa, kapak kaplaması için poli-L-ornitin (Poli-O) ve Laminin'i yeniden oluşturur (Poli-O: steril suda 0.1 mg/mL; Laminin: DMEM'de 1:50'de 1.2 mg / mL seyreltin). Aliquot Poly-O ve Laminin (2.5 mL) ve -20 °C'de alikotları dondurun. Kullanmadan hemen önce oda sıcaklığında çözün.
    NOT: Adım 1.4. sadece immünofloresan etiketleme ve lazer tarama mikroskobu yapılırsa gereklidir.

2. Fareler ve doku ekstraksiyonu

NOT: Bu yeniden programlama çalışmaları için Ascl1 CreERT:tdDomates STOPfl/fl fare, bir Ascl1CreERT fareyi (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) bir tdDomatesSTOPfl/fl fare (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914) ile geçerek oluşturulmuştur. Bu fare karışık bir arka plana sahiptir (C57BL/6, S129 ve ICR suşu). Bu farenin genotipi Şekil 1A'da gösterilmiştir. Tüm suşlar bu protokol için kullanılabilir.

  1. Diseksiyon mikroskobu ve tüm ince aletler (Dumont #5 fine ve Dumont #7 kavisli forseps, ince makas ve Vannas makas) dahil olmak üzere eldiven giyin ve çalışma alanını %70 etanol ile sterilize edin. 10 cm'lik silikon kaplı siyah diseksiyon kabını 20 dakika boyunca UV ışığına maruz bırakarak sterilize edin.
  2. Doku ekstraksiyonu için tabakların ve tabakların hazırlanması
    1. Göz toplama ve numune ayırma için 24 delikli bir plaka hazırlayın (bir kuyucukta fare başına iki göz, fare kimlikleriyle etiketlenmiş) kuyu başına ~1 mL soğuk HBSS (4 ° C) ile. 24 kuyucuklu plakayı buzun üzerine yerleştirin.
    2. Steril bir 10 cm'lik Petri kabını (yıkamak için) ve sterilize silikon kaplı diseksiyon kabını, dokunun HBSS ile tamamen kaplandığından emin olmak için birkaç mL soğuk HBSS (4 ° C) ile doldurun.
    3. 1 mL% 70 etanol içeren steril bir 1,5 mL tüp hazırlayın.
    4. Plakayı kültür numarası, tarih, gerinim ve gerekli tüm bilgilerle etiketleyerek 12 kuyu kültür plakası hazırlayın.
  3. Onaylanmış herhangi bir yöntemi kullanarak P12 farelerini ötenazileştirin.
  4. Göz giderme
    1. Fare kafasını başparmağı ve işaret parmağı gözün etrafına gelecek şekilde yavaşça tutun.
    2. Dumont #7 kavisli forseps kullanarak, yavaşça göz küresinin arkasına geçin ve optik siniri kırpın. Dikkatlice gözünüzü dışarı çıkarın.
      NOT: Yetişkin fareler kullanılıyorsa, kavisli forseps kullanmayın ve gözü çekmeyin. Bunun yerine ince makas kullanarak göz küresinin etrafını dikkatlice kesin; optik siniri kesin, ancak gözün kendisini kesmeyin. Göz küresini dikkatlice çıkarmak için forseps kullanın.
  5. Göz küresi temizliği
    1. Bakterilerin hayvandan taşınmasını önlemek için göz küresini kısaca etanol içeren bir tüpe batırın.
    2. Göz küresini buz üzerindeki 24 kuyucuklu tabağa yerleştirmeden önce 10 cm'lik Petri kabında kısaca yıkayın.
  6. Diğer gözler için 2.4 ve 2.5 adımlarını tekrarlayın. İşlem sırasında kuyu plakasını buzun üzerinde tutun. Bir hayvandan iki gözü, ışık kaynağı olan bir diseksiyon mikroskobunun altına yerleştirilen diseksiyon kabına yerleştirin.
  7. Retina ekstraksiyonu
    1. Optik siniri ve skleranın etrafındaki bağ dokusunu Dumont #5 ince forseps ile tutarak bir göz küresini sabitleyin ve diseksiyon kabına (kornea yukarı doğru) dikkatlice bastırın.
    2. Vannas makaslarına daha kolay erişim sağlamak için 30 G'lik bir iğne kullanarak korneanın merkezinde bir delik açın.
    3. Vannas makası kullanarak siliyer cismin etrafındaki korneayı diseke edin ve kornea, lens, iris ve vitreus gövdesini Dumont #5 ince forseps ile dikkatlice çıkarın. Şekil 2A , retinanın içinde olduğu bir göz kapağını göstermektedir.
    4. Optik sinire ulaşana kadar sklerayı Vannas makası ile diseke edin. Optik siniri kırpın ve Dumont #5 ince forseps kullanarak retinayı dikkatlice çıkarın.
    5. Retinaya doğru itmek ve vitreus gövdesinin tamamen çıkarılmasına izin vermek için ikinci bir çift Dumont # 5 ince forseps kullanın. Şekil 2B , çıkarılan iki retinayı göstermektedir.
  8. Transfer ve yıkama
    1. Çapı büyütmek için steril bir transfer pipetinin ucunun yaklaşık 2,5 cm'sini kesin. Bu ucu kullanarak, dokuya zarar vermeden tüm retinaları alın (emer).
    2. Retinaları soğuk HBSS (4 ° C) ile yeni bir steril Petri kabına aktarın ve çanağı sallayın (ileri geri, sol ve sağ).
    3. Transfer pipet ucunu kullanarak, retinal pigment epitel (RPE) hücrelerini yıkamak için retinaları dikkatlice itin.
      NOT: Alternatif olarak, lens ve vitreus gövdeli retinanın tamamı vizör adaptöründen çıkarılabilir. Daha sonra, lens ve vitreus gövdesi çıkarılan retinadan çıkarılabilir. Retina yırtılırsa, ayrışma için tüm parçaları topladığınızdan emin olun; aksi takdirde, akan hücre katmanlarını büyütmek için yetersiz miktarda doku olacaktır.
  9. İzole edilmiş retinayı derhal 1 mL HBSS ile doldurulmuş 24 delikli plakanın yeni, temiz bir kuyucuğuna yerleştirin. Diseksiyon işlemi sırasında 24 delikli plakayı buzun üzerinde tutun.
  10. İkinci retinayı izole etmek için 2.7-2.9 arasındaki adımları tekrarlayın.

3. Retina ayrışması

NOT: Aşağıdaki tüm adımların (hücre hasadına kadar) bir A2 veya B2 biyogüvenlik kabininde (BSC) gerçekleştirilmesi gerekir.

  1. Papain/DNase I ayrışma karışımını aşağıdaki gibi hazırlayın.
    1. Altı retina için, 750 μL Papain içeren tüpe 75 μL DNaz I ekleyin (adım 1.3'ten itibaren) ve dikkatlice karıştırın (ayrışma karışımı).
    2. Bu protokol için gerekli olan bireysel numune hazırlama için, toplam 825 μL hacmini üç alikota bölün: fare başına bir 1.5 mL tüpte (iki retina) karışımın 275 μL'si. Gerekli DNase I ve Papain miktarlarını buna göre hesaplayın.
      NOT: Bir Papain/DNaz I karışımı tüpünde altı adede kadar retina ayrıştırılabilir. Bununla birlikte, bireysel numune hazırlama, kombine numunelere göre daha az kümelenme ve daha iyi hücre büyümesi ile sonuçlanır.
  2. İki retinayı Papain/DNaz I ayrışma karışımına aktarın. Büyütülmüş uç çapına sahip bir transfer pipeti kullanın (adım 2.8.1), retinaları alın, retinalar ucun altına yerleşene kadar bekleyin ve ardından retinaları aşırı HBSS olmadan Papain / DNaz I karışımını içeren tüpe bırakın.
  3. Bir nutator üzerine yerleştirin ve bir hücre kültürü inkübatöründe 10 dakika boyunca inkübe edin (37 ° C,% 5 CO2).
  4. 1 mL'lik bir pipetle dikkatlice yukarı ve aşağı pipetle (yaklaşık 20-30 kez) pipetleyerek hücreleri ayırın. Hücreler ayrıştıktan sonra (yani, parçasız homojen bir çözelti ile sonuçlanır), Papain'i nötralize etmek için Papain Dissosiyasyon Kitinden 275 μL Ovomukoid proteaz inhibitörü ekleyin. Yukarı ve aşağı pipetle çekerek hafifçe karıştırın.
    NOT: 825 μL Papain/DNaz I karışımında altı retina ayrışmışsa, 825 μL Ovomukoid gereklidir.
  5. Karışımı 4 °C'de 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj yapın.
  6. Epidermal büyüme faktörünü (EGF, büyüme ortamının 1 mL'si başına 1 μL, PBS'de 200 μg / mL'de yeniden yapılandırılmış) 37 ° C'de önceden ısıtılmış hesaplanan büyüme ortamı hacmine (fare başına 1 mL) ekleyin.
    NOT: Deneysel tasarıma bağlı olarak, proliferasyon belirteci 5-etinil-2'-deoksiüridin (EdU) ve ayrıca 4-Hidroksitamoksifen (4-OHT) veya diğer gerekli faktörler kültür periyodunun başında eklenebilir.
  7. Tüpleri santrifüjden dikkatlice çıkarın. Tüpün altındaki pelete dokunmayın.
  8. Süpernatantı dikkatlice ve tamamen çıkarın. Hücre peletini 500 μL EGF takviyeli büyüme ortamı ile yeniden askıya alın.
  9. Hücre süspansiyonunu etiketli 12 delikli plakanın bir kuyucuğuna aktarın (Şekil 2C). Tüpü EGF takviyeli büyüme ortamının başka bir 500 μL'si ile durulayın ve kuyuya ekleyin (kuyu başına toplam 1 mL hacim).
  10. 3.8 ve 3.9 numaralı adımları diğer tüm örneklerle birlikte yineleyin.
  11. Kuyu plakasını üç kez dikkatlice sallayın (ileri geri; sol ve sağ). Plakayı inkübatöre yerleştirin (37 °C, CO2).
    NOT: Transgenik fareler kullanılıyorsa, her hayvan için genotipleme yapın (Şekil 2D). Cre rekombinaz pozitif ve negatif fareleri tanımlayın ve plakayı buna göre etiketleyin. Bu protokol için, sonraki adımlar için sadece Cre rekombinaz pozitif muhabir farelerin hücreleri kullanılmıştır. Cre negatif numunelerin hücreleri dondurulur ve diğer uygulamalar için kullanılır.

4. Büyüme aşaması

NOT: Büyüme aşaması yaklaşık 4-5 günlük bir süreye sahiptir (Şekil 1B). Hücreleri içeren kuyucuklara sıvı eklemek için, pipetin kuyunun duvarına işaret etmesi ve hücre ayrılmasını önlemek için sıvının yavaşça serbest bırakılması gerekir. Doğrudan hücrelerin üzerine pipet uygulamayın.

  1. Ayrışmadan bir gün sonra, ortamı çıkarın ve 1 mL taze EGF takviyeli büyüme ortamı ekleyin.
  2. 3. günde, ortamı çıkarın ve hücre kalıntılarını gidermek için 1 mL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin. Yavaşça ileri geri soldan sağa doğru sallayın. HBSS'yi çıkarın, yıkama adımını tekrarlayın ve 1 mL önceden ısıtılmış EGF takviyeli büyüme ortamı ekleyin.
  3. Hücreleri her gün izleyin ve hücreler% 90 -% 100 akıcılığa ulaşana kadar büyüme durumlarını değerlendirin. Şekil 3 , zaman içinde iyi MG büyümesinin bir örneğini göstermektedir. Olası kontaminasyon veya hücre ölümünü kontrol edin (Ek Şekil 1). Kirlenmiş kültürleri atın.
    NOT: Hücre durumunu izlemek ve kaydetmek için, bağlı bir kameraya ve 4x, 10x veya 20x hedeflerine sahip bir ışık mikroskobu kullanarak çeşitli büyütmelerde görüntüler çekin. Bu çalışmada floresan mikroskobu kullanılmıştır.

5. Poli-L-ornitin (Poli-O) ve Laminin kaplama ile kapak kapaklarının hazırlanması

NOT: Bu adım yalnızca immünofloresan etiketleme ve konfokal lazer tarama mikroskobu yapıldığında gereklidir. Doğru görüntüleme için yuvarlak cam kapaklar (12 mm çaplı) gereklidir. Kaplama protokolü ayrıca nöronal ortam veri sayfasında da bulunabilir (bkz.

  1. Steril Dumont #2AP forseps kullanarak steril kapakları 24 delikli bir plakanın her bir kuyucuğunun ortasına dikkatlice yerleştirin.
    NOT: Kapak fişlerini kuyunun ortasına yerleştirin. Kapak kaymalarını bir kuyunun duvarına yakın bir yere yerleştirmek, aşağıdaki adımlar için yüzey gerilimi sorunlarına neden olacaktır.
  2. Oda sıcaklığında 2,5 mL'lik bir Poli-O aliquot'u çözün ve her bir kapak kaymasının ortasına 100 μL'sini yerleştirin.
  3. Kuyu plakasını 37 °C'lik bir inkübatörde 30 dakika boyunca inkübe edin.
  4. Poly-O'yu çıkarın ve kuyuyu ~ 1 mL steril su ile üç kez kapak kaymasıyla yıkayın.
  5. Kuyu plakasının BSC'de gece boyunca kurumasını bekleyin. Gece boyunca 4 °C'de 2,5 mL Laminin çözün.
  6. Ertesi sabah, her bir kapak kapağının ortasına 100 μL Laminin ekleyin ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 4 saat boyunca inkübe edin.
  7. Laminin'i dikkatlice ve tamamen çıkarın.
  8. Pasaj hemen yapılamazsa plakayı 4 ° C'de tutun.
    NOT: Hazırlanan plakalardaki kaplamalı kapaklar 4 °C'de birkaç gün bekletilebilmektedir.

6. Nöronal hayatta kalanları çıkarmak için hücre geçişi

NOT: Hücre geçişi, hücre popülasyonunu arttırmak için değil, nöronal hücreleri çıkarmak için gereklidir. Glia sadece birkaç kez bölünür ve geçişten sonra daha fazla büyümez. Hücre süspansiyonlarını seyreltmeyin. 12 delikli bir plakanın bir akıcılık kuyusunun hücreleri, 12 delikli bir plakanın bir kuyucuğuna veya 24 delikli bir plakanın iki kuyucuğuna dağıtılabilir. Kaplamalı kapak kaymaları kullanıldığında, kapak kaymasının sadece üçte biri kaplanır. Bu nedenle, 24 delikli bir plakada oturan, birleşik hücrelerle (~% 80 -% 90) altı kapak kayması, 12 delikli bir plakanın birleştirilmiş hücrelerinin bir kuyucuğundan elde edilebilir. Hücre yoğunluğunu artırmak veya azaltmak için diğer oranlar da seçilebilir. Bu protokol için bir Cre+ muhabir faresi kullanılır [bir deney, iki tedavi: miR-25 veya kontrol-miR; teknik replikasyonlar n = 3 (tedavi başına üç kapak kayması), biyolojik replikasyon n = 1]. Teknik ve biyolojik replikaların sayısı, deneysel tasarıma bağlı olarak farklı şekilde tanımlanabilir.

  1. Hücrelerin% 90 -% 100 birleşik olup olmadığını kontrol edin (ayrıca kuyunun kenarında; Şekil 3E,F).
  2. Ortamı çıkarın ve yıkamak için 1 mL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın (ileri geri, sola ve sağa). HBSS'yi tamamen kaldırın.
  3. Hücreleri kuyudan ayırmak için önceden ısıtılmış tripsin içeren bir çözeltiden 500 μL (metal boncuk banyosunda 37 ° C'de önceden ısıtılmış) ekleyin. Yavaşça sallayın (ileri geri, soldan sağa) ve 37 ° C'lik bir inkübatörde 2 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
  4. Plakayı inkübatörden BSC'ye taşıyın. Eğerken, tripsin içeren çözeltiyi aspire edin ve hücreler tamamen ayrılana kadar dikkatlice ve yavaşça kuyunun üzerine birkaç kez dağıtın. Plakayı ışığa karşı tutun ve altta hücre kalmadığından emin olun.
  5. Bu hücre süspansiyonunu steril bir 1,5 mL tüpe aktarın. 4 °C'de 8 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj.
  6. Süpernatantı çıkarın ve önceden ısıtılmış büyüme ortamının (EGF ile desteklenmiş; 1:1000) 600 μL (6 kuyucuk / kapak kayması için kuyucuk başına 100 μL) ekleyerek hücre peletini dikkatlice yeniden askıya alın. ve ~ 30-40 kez yukarı ve aşağı pipetleme.
    NOT: Hücreler şu anda -80 °C'de veya sıvı azotta dondurulabilir ve hücre hatlarının çözülmesi için standart protokoller izlenerek çözülebilir. Hücreler dondurulmuşsa, EGF takviyeli ortamda (büyüme ortamı) yeniden askıya alınmazlar. Temel ortamda (EGF'siz) ve dondurma çözeltisinde (1/1 oranında) yeniden askıya alınacaklardır. 6.1.1 ila 6.6.2 arasındaki adımlar, hücreleri dondurma adımlarını açıklar. Hiçbir hücre dondurulmamışsa, adım 6.7 ile devam edin.
    1. 100 μL DMSO ve 400 μL FBS (kuyu/numune başına toplam hacim 500 μL) karıştırarak dondurma çözeltisi hazırlayın.
    2. Hücre peletini 500 μL önceden ısıtılmış büyüme ortamında yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunu 500 μL DMSO / FBS dondurma çözeltisine ekleyin (toplam hacim 1 mL). Tüm numuneler işlenene kadar tüpleri buz üzerinde tutun. Hücreleri -20 °C'de 1 saat boyunca dondurun ve ardından -80 °C'de saklayın.
  7. 600 μL hücre/ortam süspansiyonunun 100 μL'sini (adım 6.6) 24 delikli plakanın altı kaplamalı kapak kapağının ortasına (bkz. adım 5) yerleştirerek tohum hücreleri. Plakayı dikkatlice inkübatöre yerleştirin ve hücrelerin yerleşmesine izin verin.
    NOT: 600 μL hücre süspansiyonunun 100 μL'si (12 delikli bir plakanın bir kuyucuğundan toplanır), transfeksiyon için gerekli olan% 90-100 hücre akıcılığına neden olur.
  8. Kapak kapağına yerleşip yerleşmediklerini görmek için hücreleri 3 saat sonra kontrol edin. EGF ile desteklenmiş 400 μL büyüme ortamı ekleyin.
    NOT: Hücreler genellikle ertesi gün transfeksiyona hazırdır (Şekil 3G). Akıcı değilse (% 90 -% 100), onları başka bir güne bırakın. Hala birleşik değilse, bunları transfeksiyon için kullanmayın. MiRNA profilleme, RNA-Seq, RT-qPCR veya batı lekesi gibi diğer aşağı akış uygulamaları yapılırsa, hücrelerin 12 delikli plakalara (1: 1 oranı; plaka tedavisi gerekmez) geçirilmesi ve RNA / protein ekstraksiyonu için toplanması gerekir.

7. Transfeksiyon

NOT: Transfeksiyon fazı, sadece transfeksiyon ortamında 3 saatlik bir fazdan (transfeksiyon prosedürleri, transfeksiyon reaktifi ile birlikte gelen transfeksiyon el kitabında açıklanmıştır) ve transfeksiyon reaktifi ve miRNA'ların hala mevcut olduğu, ancak gerekli takviyeleri içeren nöronal ortamın eklendiği uzun bir fazdan oluşur (toplam süre 2 gündür; Şekil 1B). Bu protokolde, altı kuyu transfekte edilecek: üç kuyu yeniden programlama miRNA miR-25'i alacak ve üç kuyu kontrol miRNA'sını alacak.

  1. Hücrelerin% 90 akıcılığa ulaşıp ulaşmadığını kontrol edin ve transfeksiyondan önce hücreleri kaydedin / görüntüleyin.
  2. Büyüme ortamını çıkarın ve hücreleri yıkamak için 500 μL HBSS (oda sıcaklığı) ekleyin.
  3. HBSS'yi çıkarın ve transfeksiyonlar için kullanılan 400 μL azaltılmış serum ortamı ekleyin. Plakayı tekrar 37 °C'lik bir inkübatöre yerleştirin.
  4. Transfeksiyon karışımını, üreticinin transfeksiyon reaktif protokolünün talimatlarını izleyerek hazırlayın. İki karışım yapın: transfeksiyon reaktif karışımı ve miRNA karışımı (örnek için Şekil 1B'ye bakınız).
    1. Transfeksiyon reaktif karışımını hazırlayın: 24 delikli bir plaka için, bir kuyucuk için 49 μL indirgenmiş serum ortamı ve 1 μL transfeksiyon reaktifi gereklidir (toplamda 50 μL). Altı kuyucuk için, 294 μL indirgenmiş serum ortamı ve 6 μL transfeksiyon reaktifi birleştirilir ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetlenerek iyice karıştırılır.
    2. MiRNA mimik karışımını hazırlayın: 24 delikli bir plaka için, bir kuyucuk için toplam 50 μL mimik karışımı hacmi gereklidir. Üç kuyu kontrol miRNA'sını alacak ve diğer üç kuyu miR-25 ile muamele edilecektir. Bu protokol için 200 nM'lik bir nihai konsantrasyon kullanılır.
      1. MiR-25 tedavisi için (üç kuyucuk), 150 μL indirgenmiş serum ortamı ve 3 μL miR-25 mimik (100 μM stok çözeltisi) birleştirilir ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetlenerek iyice karıştırılır. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
        Kontrol mimikleri tedavisi için (üç kuyucuk), 150 μL indirgenmiş serum ortamı ve 3 μL kontrol-miRNA taklitleri (100 μM stok çözeltisi) birleştirilir ve hafifçe yukarı ve aşağı pipetlenerek iyice karıştırılır. 5 dakika boyunca kuluçkaya yatırın.
        NOT: miRNA taklitlerinin hacmi, seyreltme faktörüne ve gereken konsantrasyona (20-500 nM) bağlıdır. miRNA inhibitörleri (antagomiR'ler) veya plazmidler de dahil olmak üzere diğer moleküller de kullanılabilir. Ayrıca, molekül kombinasyonlarının transfekte edilmesi mümkündür.
  5. MiRNA mimik karışımı ve transfeksiyon reaktif karışımını birleştirin. Yavaşça ve iyice pipetleyerek yukarı ve aşağı hafifçe pipetleyerek dikkatlice karıştırın. Oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin (üreticinin talimatlarına göre).
  6. Yukarıdaki transfeksiyon karışımını, 20 μL'lik bir pipet kullanarak kuyucuktaki ortam yüzeyine yakın bir yerde, hücrelerin üzerine damla damla ve yavaşça ekleyin. Plakayı yavaşça sallayın (ileri geri, soldan sağa).
  7. 37 °C'lik bir inkübatörde 3 saat boyunca inkübe edin.
  8. 3 saat sonra, hücre proliferasyonunu izlemek için Cre rekombinazını ve 5-etinil-2'-deoksiüridini (EdU, 2 mL DMSO, 1 μM nihai konsantrasyon ile yeniden oluşturulmuş 10 mM stok çözeltisi) aktive etmek için 4-Hidroksitamoksifen (2.58 mL etanol ile yeniden yapılandırılmış 5 mM stok, 250 nM nihai konsantrasyon) ile desteklenmiş kuyucuklara (kuyu başına 500 μL) nöronal ortam ekleyin.
    DİKKAT: 4-Hidroksitamoksifen ve EdU'nun insan kanserojenleri, teratojenleri ve mutajenleri olduğu bilinmektedir. Kullanmadan önce Malzeme Güvenlik Bilgi Formu'nu okuyun ve eldiven, gözlük ve laboratuvar önlüğü giyin. Her iki reaktifi de üreticinin tavsiyelerine göre yeniden oluşturun. Maddeyi/karışımı solumayın. Kullanımdan sonra sıkıca kapatın. Atık malzemeler ulusal ve yerel yönetmeliklere uygun olarak bertaraf edilmelidir. Madde ile çalıştıktan sonra ellerinizi ve yüzünüzü yıkayın.
  9. 37 °C'lik bir inkübatörde 2 gün boyunca inkübe edin (Şekil 1B).

8. Hücre dönüşümü

NOT: Hücre dönüştürme aşaması yaklaşık 5-6 günlük bir süreye sahiptir (Şekil 1B), ancak daha uzun süreler mümkündür.

  1. TdDomates ekspresyonunun başarılı bir şekilde indüklenmesi, potansiyel hücre ölümü ve / veya kontaminasyon için hücreleri günlük olarak kontrol edin. Hücre yoğunluğu değişmez (Şekil 4). İlk soluk kırmızı floresan etiketli hücreler, 4-Hidroksitamoksifen tedavisinden 1 gün sonra gözlemlenebilir. Hücreleri izlemek ve görüntülemek için bir floresan mikroskop gereklidir.
    NOT: Bu çalışmada canlı görüntüleme için floresan mikroskop kullanılmıştır. Görüntüler 4x, 10x veya 20x hedeflerle çekilir.
  2. Transfeksiyondan iki gün sonra, ortamı çıkarın ve her bir kuyucuğa 4-Hidroksitamoksifen ve EdU ile desteklenmiş 500 μL önceden ısıtılmış nöronal ortam ekleyin.
  3. Hücreler toplanana kadar ortamı her gün taze bir ortamla değiştirin.
  4. Kırmızı floresan (Ascl1 eksprese eden) hücrelerin sayısının ve bunların morfolojik değişikliklerinin değerlendirilmesi ve değerlendirilmesi için canlı görüntüler alın (Şekil 4 ve Şekil 5A-C).

9. Hücre hasadı: immünofloresan etiketleme için fiksasyon

NOT: Hücreler, dökme veya scRNA-Seq, RT-qPCR veya batı lekesi dahil olmak üzere diğer aşağı akış uygulamaları için toplanabilir.

  1. Ortamı çıkarın ve kuyucuk başına 500 μL soğuk HBSS (4 ° C) ekleyin ve plakayı yavaşça sallayın (ileri geri, soldan sağa). HBSS'yi kaldırın.
  2. 500 μL% 2 Paraformaldehit (PFA) ekleyerek hücreleri sabitleyin ve oda sıcaklığında 20 dakika inkübe edin.
  3. Yerleşik protokollere göre immünofloresan etiketleme yapın.

Sonuçlar

Bu protokol, P12 fare retinalarından MG'nin nasıl yetiştirileceğini ve bu hücrelerin miR-25 ile Ascl1CreERT: tdDomatesSTOPfl / fl RPC muhabir faresini kullanarak retinal nöronlara nasıl yeniden programlanacağını açıklar. Bu yöntem, MG'yi RPC'ye yeniden programlamak için diğer uygun miRNA'ları (mimikler veya inhibitörler, tek moleküller olarak veya kombinasyon halinde) ayrıntılı olarak rapor eden önceki çalışmalarda kullanılmış ve daha sonra nöronal hücre özell...

Tartışmalar

Bu protokol, miRNA'ları kullanarak yeniden programlama çalışmaları için ayrışmış fare retinalarından MG'nin nasıl yetiştirileceğini açıklar. Önceki çeşitli çalışmalarda gösterildiği ve doğrulandığı gibi, bu kültürlerde bulunan hücrelerin büyük çoğunluğu (% 80-90) MG 20,23,24'tür. Bu yöntem çok sağlam ve güvenilir bir tekniktir ve protokol doğru takip edilirse sonuçlar kolayca çoğaltı...

Açıklamalar

Bu rapordaki bulguların bazılarını içeren bir patent, Washington Üniversitesi tarafından mucitler Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl ve Thomas A. Reh ile birlikte dosyalanmıştır. Patentin başlığı "Retina rejenerasyonunu uyarmak için yöntemler ve bileşimler.

Teşekkürler

Yazarlar, Dr. Ann Beaton'a ve tüm laboratuvar üyelerine makaleye katkıları için teşekkür eder. Seattle'daki Washington Üniversitesi'nde doktora sonrası eğitim sırasında MG birincil kültürlerini S.G.W.'ye bir tarama aracı olarak tanıttıkları için Dr. Tom Reh, Julia Pollak ve Russ Taylor'a özel teşekkürler. Çalışma, S.G.W.'ye Empire İnovasyon Programı (EIP) Hibesi ve SUNY Optometri'den S.G.W.'ye başlangıç fonlarının yanı sıra Ulusal Göz Enstitüsü'nden (NEI) S.G.W.'ye R01EY032532 ödülü ile finanse edildi.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

Referanslar

  1. Jadhav, A. P., Roesch, K., Cepko, C. L. Development and neurogenic potential of Müller glial cells in the vertebrate retina. Progress in Retinal and Eye Research. 28 (4), 249-262 (2009).
  2. Roesch, K., et al. The transcriptome of retinal Müller glial cells. The Journal of Comparative Neurology. 509 (2), 225-238 (2008).
  3. Goldman, D. Müller glial cell reprogramming and retina regeneration. Nature Reviews. Neuroscience. 15 (7), 431-442 (2014).
  4. Konar, G. J., Ferguson, C., Flickinger, Z., Kent, M. R., Patton, J. G. miRNAs and Muller Glia Reprogramming During Retina Regeneration. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 632632 (2020).
  5. Karl, M. O., Reh, T. A. Regenerative medicine for retinal diseases: activating endogenous repair mechanisms. Trends in Molecular Medicine. 16 (4), 193-202 (2010).
  6. Wilken, M. S., Reh, T. A. Retinal regeneration in birds and mice. Current Opinion in Genetics and Development. 40, 57-64 (2016).
  7. Fausett, B. V., Gumerson, J. D., Goldman, D. The proneural basic helix-loop-helix gene ascl1a is required for retina regeneration. The Journal of Neuroscience. 28 (5), 1109-1117 (2008).
  8. Ramachandran, R., Fausett, B. V., Goldman, D. Ascl1a regulates Müller glia dedifferentiation and retinal regeneration through a Lin-28-dependent, let-7 microRNA signalling pathway. Nature Cell Biology. 12 (11), 1101-1107 (2010).
  9. Brzezinski, J. A. t., Kim, E. J., Johnson, J. E., Reh, T. A. Ascl1 expression defines a subpopulation of lineage-restricted progenitors in the mammalian retina. Development. 138 (16), 3519-3531 (2011).
  10. Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. The major cell populations of the mouse retina. The Journal of Neuroscience. 18 (21), 8936-8946 (1998).
  11. Del Rio, P., et al. GDNF-induced osteopontin from Muller glial cells promotes photoreceptor survival in the Pde6brd1 mouse model of retinal degeneration. Glia. 59 (5), 821-832 (2011).
  12. Pena, J., et al. Controlled microenvironments to evaluate chemotactic properties of cultured Muller glia. Experimental Eye Research. 173, 129-137 (2018).
  13. Pena, J. S., Vazquez, M. VEGF Upregulates EGFR expression to stimulate chemotactic behaviors in the rMC-1 model of Muller glia. Brain Sciences. 10 (6), 330 (2020).
  14. Ueki, Y., Reh, T. A. EGF stimulates Müller glial proliferation via a BMP-dependent mechanism. Glia. 61 (5), 778-789 (2013).
  15. Zhang, X., Feng, Z., Li, C., Zheng, Y. Morphological and migratory alterations in retinal Muller cells during early stages of hypoxia and oxidative stress. Neural Regeneration Research. 7 (1), 31-35 (2012).
  16. Sheline, C. T., Zhou, Y., Bai, S. Light-induced photoreceptor and RPE degeneration involve zinc toxicity and are attenuated by pyruvate, nicotinamide, or cyclic light. Molecular Vision. 16, 2639-2652 (2010).
  17. Wang, M., Ma, W., Zhao, L., Fariss, R. N., Wong, W. T. Adaptive Muller cell responses to microglial activation mediate neuroprotection and coordinate inflammation in the retina. Journal of Neuroinflammation. 8, 173 (2011).
  18. Pereiro, X., Miltner, A. M., La Torre, A., Vecino, E. Effects of adult muller cells and their conditioned media on the survival of stem cell-derived retinal ganglion cells. Cells. 9 (8), 1759 (2020).
  19. Xia, X., Teotia, P., Patel, H., Van Hook, M. J., Ahmad, I. Chemical induction of neurogenic properties in mammalian Muller glia. Stem Cells. 39 (8), 1081-1090 (2021).
  20. Pollak, J., et al. ASCL1 reprograms mouse Müller glia into neurogenic retinal progenitors. Development. 140 (12), 2619-2631 (2013).
  21. Wohl, S. G., Reh, T. A. miR-124-9-9* potentiates Ascl1-induced reprogramming of cultured Muller glia. Glia. 64 (5), 743-762 (2016).
  22. Ueki, Y., et al. Transgenic expression of the proneural transcription factor Ascl1 in Müller glia stimulates retinal regeneration in young mice. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 112 (44), 13717-13722 (2015).
  23. Ueki, Y., et al. P53 is required for the developmental restriction in Müller glial proliferation in mouse retina. Glia. 60 (10), 1579-1589 (2012).
  24. Wohl, S. G., Reh, T. A. The microRNA expression profile of mouse Muller glia in vivo and in vitro. Scientific Reports. 6, 35423 (2016).
  25. Zuzic, M., Rojo Arias, J. E., Wohl, S. G., Busskamp, V. Retinal miRNA functions in health and disease. Genes (Basel). 10 (5), 377 (2019).
  26. Jorstad, N. L., et al. Stimulation of functional neuronal regeneration from Muller glia in adult mice. Nature. 548 (7665), 103-107 (2017).
  27. Wohl, S. G., Hooper, M. J., Reh, T. A. MicroRNAs miR-25, let-7 and miR-124 regulate the neurogenic potential of Muller glia in mice. Development. 146 (17), 179556 (2019).
  28. Hauck, S. M., Suppmann, S., Ueffing, M. Proteomic profiling of primary retinal Muller glia cells reveals a shift in expression patterns upon adaptation to in vitro conditions. Glia. 44 (3), 251-263 (2003).
  29. Merl, J., Ueffing, M., Hauck, S. M., von Toerne, C. Direct comparison of MS-based label-free and SILAC quantitative proteome profiling strategies in primary retinal Muller cells. Proteomics. 12 (12), 1902-1911 (2012).
  30. Buchsbaum, I. Y., et al. ECE2 regulates neurogenesis and neuronal migration during human cortical development. EMBO Reports. 21 (5), 48204 (2020).
  31. Eliscovich, C., Shenoy, S. M., Singer, R. H. Imaging mRNA and protein interactions within neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 114 (10), 1875-1884 (2017).
  32. Wohl, S. G., Jorstad, N. L., Levine, E. M., Reh, T. A. Muller glial microRNAs are required for the maintenance of glial homeostasis and retinal architecture. Nature Communications. 8 (1), 1603 (2017).
  33. Yamamoto, H., Kon, T., Omori, Y., Furukawa, T. Functional and evolutionary diversification of Otx2 and Crx in vertebrate retinal photoreceptor and bipolar cell development. Cell Reports. 30 (3), 658-671 (2020).
  34. Kaufman, M. L., et al. Initiation of Otx2 expression in the developing mouse retina requires a unique enhancer and either Ascl1 or Neurog2 activity. Development. 148 (12), (2021).
  35. Emerson, M. M., Cepko, C. L. Identification of a retina-specific Otx2 enhancer element active in immature developing photoreceptors. Developmental Biology. 360 (1), 241-255 (2011).
  36. Ghinia Tegla, M. G., et al. OTX2 represses sister cell fate choices in the developing retina to promote photoreceptor specification. eLife. 9, 54279 (2020).
  37. Brzezinski, J. A. t., Lamba, D. A., Reh, T. A. Blimp1 controls photoreceptor versus bipolar cell fate choice during retinal development. Development. 137 (4), 619-629 (2010).
  38. Brzezinski, J. A. t., Uoon Park, K., Reh, T. A. Blimp1 (Prdm1) prevents re-specification of photoreceptors into retinal bipolar cells by restricting competence. Developmental Biology. 384 (2), 194-204 (2013).
  39. Kim, H. T., et al. Mitochondrial protection by exogenous Otx2 in mouse retinal neurons. Cell Reports. 13 (5), 990-1002 (2015).
  40. Nishida, A., et al. Otx2 homeobox gene controls retinal photoreceptor cell fate and pineal gland development. Nature Neuroscience. 6 (12), 1255-1263 (2003).
  41. Nelson, B. R., et al. Genome-wide analysis of Muller glial differentiation reveals a requirement for Notch signaling in postmitotic cells to maintain the glial fate. PLoS One. 6 (8), 22817 (2011).
  42. VandenBosch, L. S., et al. Developmental changes in the accessible chromatin, transcriptome and Ascl1-binding correlate with the loss in Muller Glial regenerative potential. Scientific Reports. 10 (1), 13615 (2020).
  43. Clark, B. S., et al. Single-cell RNA-seq analysis of retinal development identifies NFI factors as regulating mitotic exit and late-born cell specification. Neuron. 102 (6), 1111-1126 (2019).
  44. Lewis, G. P., Fisher, S. K. Up-regulation of glial fibrillary acidic protein in response to retinal injury: its potential role in glial remodeling and a comparison to vimentin expression. International Review of Cytology. 230, 263-290 (2003).
  45. Luna, G., Lewis, G. P., Banna, C. D., Skalli, O., Fisher, S. K. Expression profiles of nestin and synemin in reactive astrocytes and Muller cells following retinal injury: a comparison with glial fibrillar acidic protein and vimentin. Molecular Vision. 16, 2511-2523 (2010).
  46. Pogue, A. I., et al. Micro RNA-125b (miRNA-125b) function in astrogliosis and glial cell proliferation. Neuroscience Letters. 476 (1), 18-22 (2010).
  47. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Friese, T., Witte, O. W., Isenmann, S. In situ dividing and phagocytosing retinal microglia express nestin, vimentin, and NG2 in vivo. PLoS One. 6 (8), 22408 (2011).
  48. Takamori, Y., et al. Nestin-positive microglia in adult rat cerebral cortex. Brain Research. 1270, 10-18 (2009).
  49. Alliot, F., Rutin, J., Leenen, P. J., Pessac, B. Pericytes and periendothelial cells of brain parenchyma vessels co-express aminopeptidase N, aminopeptidase A, and nestin. Journal of Neuroscience Research. 58 (3), 367-378 (1999).
  50. Dore-Duffy, P., Katychev, A., Wang, X., Van Buren, E. CNS microvascular pericytes exhibit multipotential stem cell activity. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 26 (5), 613-624 (2006).
  51. Mokry, J., et al. Expression of intermediate filament nestin in blood vessels of neural and non-neural tissues. Acta Medica (Hradec Kralove). 51 (3), 173-179 (2008).
  52. Suzuki, S., Namiki, J., Shibata, S., Mastuzaki, Y., Okano, H. The neural stem/progenitor cell marker nestin is expressed in proliferative endothelial cells, but not in mature vasculature. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 58 (8), 721-730 (2010).
  53. Wohl, S. G., Schmeer, C. W., Isenmann, S. Neurogenic potential of stem/progenitor-like cells in the adult mammalian eye. Progress in Retinal and Eye Research. 31 (3), 213-242 (2012).
  54. Eberhardt, C., Amann, B., Stangassinger, M., Hauck, S. M., Deeg, C. A. Isolation, characterization and establishment of an equine retinal glial cell line: a prerequisite to investigate the physiological function of Muller cells in the retina. Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition (Berlin). 96 (2), 260-269 (2012).
  55. Löffler, K., Schäfer, P., Völkner, M., Holdt, T., Karl, M. O. Age-dependent Müller glia neurogenic competence in the mouse retina). Glia. 63 (10), 1809-1824 (2015).
  56. Schafer, P., Karl, M. O. Prospective purification and characterization of Muller glia in the mouse retina regeneration assay. Glia. 65 (5), 828-847 (2017).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

Geli im BiyolojisiSay 181

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır