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In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Le colture primarie di glia di Müller ottenute da retine di topo rappresentano uno strumento molto robusto e affidabile per studiare la conversione gliale in cellule progenitrici retiniche dopo il trattamento con microRNA. Singole molecole o combinazioni possono essere testate prima della loro successiva applicazione di approcci in vivo .

Abstract

La glia di Müller (MG) è la glia predominante nella retina neurale e può funzionare come fonte rigenerativa per i neuroni retinici. Nei vertebrati inferiori come i pesci, la rigenerazione guidata da MG avviene naturalmente; nei mammiferi, tuttavia, è necessaria la stimolazione con determinati fattori o la manipolazione genetica/ epigenetica. Poiché le MG comprendono solo il 5% della popolazione di cellule retiniche, vi è la necessità di sistemi modello che consentano esclusivamente lo studio di questa popolazione cellulare. Uno di questi sistemi modello sono colture PRIMARIE DI MG riproducibili e possono essere utilizzate per una varietà di applicazioni, tra cui lo screening e l'identificazione di molecole / fattori, test di composti o fattori, monitoraggio cellulare e / o test funzionali. Questo modello viene utilizzato per studiare il potenziale della MG murina di convertirsi in neuroni retinici dopo l'integrazione o l'inibizione di microRNA (miRNA) tramite trasfezione di miRNA artificiali o dei loro inibitori. L'uso di topi reporter mg-specifici in combinazione con l'etichettatura immunofluorescente e il sequenziamento dell'RNA a singola cellula (scRNA-seq) ha confermato che l'80%-90% delle cellule trovate in queste colture sono MG. Utilizzando questo modello, è stato scoperto che i miRNA possono riprogrammare MG in cellule progenitrici retiniche (RPC), che successivamente si differenziano in cellule neuronali. I vantaggi di questa tecnica sono che i candidati miRNA possono essere testati per la loro efficienza e il loro risultato prima del loro utilizzo in applicazioni in vivo .

Introduzione

La glia di Müller (MG) è la glia predominante nella retina neurale. Hanno funzioni simili rispetto ad altre glia in altre parti del sistema nervoso centrale come il mantenimento dell'omeostasi dell'acqua e degli ioni, il nutrimento dei neuroni e la protezione del tessuto. Le MG hanno un'altra caratteristica affascinante: sebbene siano glia mature, esprimono ancora molti geni espressi nelle cellule progenitrici retiniche (RPC) durante lo sviluppo tardivo 1,2. Si presume che questa somiglianza sia la ragione della rigenerazione neuronale naturale basata su MG nella retina del pesce dopo il danno retinico 3,4. Durante questo processo, mg rientra nel ciclo cellulare e si de-differenzia in RPC che poi si differenziano in tutti e sei i tipi di neuroni retinici. Sebbene questo fenomeno si verifichi naturalmente nei pesci, i mammiferi MG non si convertono in neuroni 5,6. Possono, tuttavia, essere riprogrammati. Una varietà di fattori hanno dimostrato di riprogrammare MG in RPC / neuroni; tra questi fattori c'è il fattore di trascrizione di base helix-loop-helix (bHLH) achaete-scute homolog 1 (Ascl1) che è coinvolto nella rigenerazione dei pesci 7,8. Nei topi, Ascl1 è espresso solo in RPC durante la retinogenesi, ma è assente nei neuroni MG maturi o retinici9.

La riprogrammazione delle cellule direttamente in vivo non è solo metodologicamente impegnativa, ma richiede anche l'approvazione di un comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali. Per ricevere l'approvazione, sono necessari dati preliminari sui fattori utilizzati o alterati, sulle concentrazioni, sugli effetti fuori bersaglio, sui meccanismi sottostanti, sulla tossicità e sull'efficienza. I sistemi di coltura cellulare consentono di testare questi criteri prima dell'uso in modelli in vivo. Inoltre, poiché le MG comprendono solo circa il 5% dell'intera popolazione di cellule retiniche10, le colture di MG consentono lo studio della loro funzione11 e del loro comportamento, compresa la migrazione12,13, la proliferazione14, la reazione allo stress a lesioni/danni 15,16, la loro interazione con altri tipi di cellule come la microglia17 o le cellule gangliari retiniche (RGC)18, o il loro potenziale neurogeno 19,20,21. Molti ricercatori utilizzano linee cellulari immortalizzate per i loro studi poiché hanno un potenziale proliferativo illimitato e possono essere facilmente mantenute e trasfettate. Le cellule primarie, tuttavia, sono preferibili per saggi biologicamente rilevanti rispetto alle cellule immortalizzate poiché hanno caratteristiche cellulari reali (espressione genica e proteica) e, cosa più importante, rappresentano un certo stadio di sviluppo e quindi hanno una "età". L'età di un animale (e di conseguenza delle cellule ottenute da un animale) è un fattore particolarmente cruciale nella riprogrammazione cellulare poiché la plasticità cellulare si riduce con lo stadio di sviluppo progredito22.

Questo protocollo descrive in dettaglio come riprogrammare MG primario con miRNA come metodo attuale in vitro per lo studio della rigenerazione. Questo modello di coltura primaria mg è stato stabilito nel 2012 per valutare le caratteristiche di proliferazione cellulare di MG in topi knock-out P53 (topi trp53-/-)23. È stato dimostrato che le MG coltivate mantengono le loro caratteristiche gliali (cioè l'espressione delle proteine S100β, Pax6 e Sox2 valutate tramite etichettatura immunofluorescente) e che assomigliano a MG in vivo (microarray di MG purificato con FACS)23. Poco dopo, l'mRNA gliale e l'espressione proteica sono stati convalidati e confermati in un approccio diverso utilizzando vettori virali20. Alcuni anni dopo, è stato confermato che la stragrande maggioranza delle cellule trovate in queste colture sono MG utilizzando il topo reporter Rlbp1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl 24 specifico per MG. Inoltre, la quantificazione dell'insieme dei miRNA sia nella MG purificata dalla FACS che nella MG primaria in coltura ha mostrato che i livelli di MG miRNA (mGLiomiRs) non variano molto nella MG coltivata durante la fase di crescita. I periodi di coltura allungati, tuttavia, causano cambiamenti nei livelli di miRNA e di conseguenza nei livelli di mRNA e nell'espressione proteica poiché i miRNA sono regolatori traslazionali25.

Nel 2013, questo modello di coltura MG è stato utilizzato per testare una varietà di fattori di trascrizione rispetto alla loro capacità di riprogrammare MG in neuroni retinici20. Ascl1 è risultato essere un fattore di riprogrammazione molto robusto e affidabile. La sovraespressione di Ascl1 tramite vettori virali ha indotto cambiamenti morfologici, espressione di marcatori neuronali e acquisizione di proprietà elettrofisiologiche neuronali. Ancora più importante, le intuizioni e i risultati ottenuti da questi primi esperimenti in vitro sono stati trasferiti con successo alle applicazioni in vivo 22,26 dimostrando che le colture primarie di MG rappresentano uno strumento solido e affidabile per gli screening fattoriali iniziali e la valutazione delle caratteristiche gliali prima dell'implementazione in vivo.

Alcuni anni fa, è stato dimostrato che il miRNA miR-124 arricchito dal cervello, che è anche altamente espresso nei neuroni della retina, può indurre l'espressione di Ascl1 inMG 21 coltivato. L'espressione di Ascl1 nelle cellule viventi è stata visualizzata tramite un topo reporter Ascl1 (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl). Un topo reporter è un topo geneticamente modificato che ha un gene reporter inserito nel suo DNA. Questo gene reporter codifica per una proteina reporter, che è in questo studio tdTomato, una proteina fluorescente rossa. Questa proteina reporter riporta l'espressione di un gene di interesse, in questo caso, Ascl1. In altre parole, le celle che esprimono Ascl1 diventeranno rosse. Poiché Ascl1 è espresso solo in RPC9, questo mouse Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl consente il monitoraggio della conversione MG in RPC che esprimono Ascl1 , il che significa che le cellule in conversione esprimeranno la proteina reporter tdTomato fluorescente rossa. Questa è un'etichettatura irreversibile poiché il DNA di queste cellule è alterato. Di conseguenza, qualsiasi successiva differenziazione neuronale verrà visualizzata perché l'etichetta tdTomato rimane nelle cellule differenzianti. Se Ascl1 che esprime RPC derivate da MG (con etichetta tdTomato) si differenzia in neuroni, questi neuroni avranno ancora la loro etichetta rossa. Questo topo, quindi, consente non solo l'etichettatura di RPC derivati da MG per l'imaging di cellule vive, ma consente anche la mappatura del destino e il tracciamento del lignaggio di questi RPC (rossi) derivati da MG. Più recentemente, è stato identificato il set di miRNA nelle RPC e sono state utilizzate colture MG di topi ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC-reporter per lo screening e il test dell'effetto di questi miRNA sulla capacità di riprogrammazione e sull'efficienza27. Un candidato, l'RPC-miRNA miR-25, è stato trovato in grado di riprogrammare MG coltivato in cellule che esprimono Ascl1 (Ascl1-Tomato +). Queste cellule riprogrammate adottano caratteristiche neuronali nel tempo, tra cui la morfologia neuronale (piccoli somata e processi fini brevi o lunghi), l'espressione di trascritti neuronali misurati tramite scRNA-Seq, nonché l'espressione di proteine neuronali convalidate tramite l'etichettatura immunofluorescente27.

Qui, il protocollo descrive in dettaglio come coltivare e trasfettare MG da topi P12 adattati dal lavoro precedente 21,24,27. Scelto per questo protocollo è il già citato miRNA miR-25, un miRNA altamente espresso in RPC, con bassi livelli di espressione in MG o neuroni retinici. Per sovraesprimere miR-25, mi mimica miR-25 murina, cioè vengono utilizzate molecole di miRNA artificiali. Come controllo, vengono scelte imitazioni di un miRNA da Caenorhabditis elegans, che non hanno alcuna funzione nelle cellule di mammifero. La visualizzazione della conversione di MG in RPC è stata effettuata tramite il mouse reporter RPC (Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl), un mouse con sfondo misto (ceppi C57BL/6, S129 e ICR). Questa coltura può, tuttavia, essere eseguita con tutti i ceppi di topo, compresi i ceppi wild-type. Negli ultimi anni, il protocollo originale è stato modificato per ridurre la durata della fase di crescita e il periodo di coltura complessivo e garantire uno stato delle cellule glialiche più robusto e ridurre al minimo il grado di degenerazione cellulare, che si verifica in periodi di coltura prolungati. Anche la finestra temporale di trasfezione regolare è stata estesa da 3 ore a 2 giorni. Come accennato in precedenza, sebbene l'attuale protocollo descriva le colture MG come strumento per gli studi di rigenerazione, il metodo non è solo utile per testare i fattori di riprogrammazione, ma può anche essere adattato per altre applicazioni, inclusi studi sul comportamento migratorio o proliferativo della MG, paradigmi correlati a lesioni / danni cellulari e / o l'identificazione di meccanismi e percorsi sottostanti.

Protocollo

Le procedure che coinvolgono soggetti animali sono state approvate dall'Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) presso il SUNY College of Optometry.

NOTA: questo protocollo di coltura è costituito da tre fasi: crescita, trasfezione e fase di conversione. Un riepilogo del protocollo generale con la sequenza temporale è riportato nella Figura 1.

1. Preparazione dei mezzi e di tutti i reagenti necessari

NOTA: tutti i passaggi devono essere eseguiti in un armadio di biosicurezza A2 o B2 (BSC). Durante la fase di crescita, viene utilizzato un mezzo di crescita ad alto siero che consiste in un mezzo neuronale basale integrato con fattore di crescita epidermico (EGF). Per la fase di conversione, viene utilizzato un mezzo basale neurofisiologico a basso siero integrato con integratori neuronali per garantire la differenziazione e la sopravvivenza neuronale.

  1. Preparare il mezzo di crescita (utilizzato durante la fase di crescita) integrando 200 mL di mezzo neuronale basale con 20 mL di siero bovino fetale (FBS, 10%), 1 mL di 200 mM di L-glutammina (0,5%), 2 mL di penicillina/streptomicina (1%) e 2 mL di integratore di N2 (1%). Eseguire la filtrazione sterile (unità filtranti con dimensione dei pori di 0,22 μm). Preriscaldare il mezzo in un bagno di perline metalliche a 37 °C prima dell'uso.
  2. Preparare il mezzo neuronale (utilizzato durante la fase di conversione) seguendo le istruzioni del produttore (vedere tabella dei materiali) integrando 100 mL di terreno basale neurofisiologico privo di siero con 2 mL di integratore neuronale B27 (2%), 1 mL di integratore N2 (1%), 20 μL di fattore neurotrofico derivato dal cervello 100 ng/mL (BDNF, ricostituire in albumina sierica bovina allo 0,1% (BSA) in soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, concentrazione finale 20 ng/mL), 20 μL di 100 ng/mL di fattore neurotrofico derivato dalle cellule gliali (GDNF, ricostituito in soluzione salina bilanciata sterile di Hanks [HBSS], concentrazione finale 20 ng/mL), 500 μL di 100 mg/mL di Dibutyryl-cAMP (ricostituito nel DMSO), 70 μL di acido ascorbico 50 ng/mL (ricostituito in PBS sterile) e 1,5 mL di penicillina/streptomicina. Eseguire la filtrazione sterile (unità filtranti con dimensione dei pori di 0,22 μm). Mezzo preriscaldato in bagno di perline metalliche a 37 °C prima dell'uso.
    NOTA: questi supporti possono essere conservati a 4 °C, per 1 mese.
  3. Ricostituire i reagenti Papaina, DNasi I e Ovomucoide necessari per la dissociazione retinica seguendo il protocollo del produttore. Aliquota 750 μL di Papaina in tubi sterili da 1,5 mL, 75 μL di DNasi I in tubi sterili da 0,6 mL e 750 μL di inibitore della proteasi ovomucoide in tubi da 2 mL. Congelare le aliquote di Papaina e DNasi I a -20 °C e mantenere le aliquote Ovomucoidi a 4 °C per evitare la degradazione dei reagenti. Scongelare a temperatura ambiente subito prima dell'uso.
    NOTA: Papaina, DNasi I e Ovomucoide si trovano in un kit chiamato Sistema di dissociazione della Papaina (vedi Tabella dei materiali).
  4. Ricostituire la poli-L-ornitina (Poly-O) e la laminina per il rivestimento del coperchio se l'etichettatura immunofluorescente viene eseguita seguendo le istruzioni della scheda tecnica (Poly-O: 0,1 mg/mL in acqua sterile; Laminina: diluire 1,2 mg/mL a 1:50 in DMEM). Aliquote Poly-O e Laminina (2,5 mL) e aliquote di congelamento a -20 °C. Scongelare a temperatura ambiente subito prima dell'uso.
    NOTA: Passaggio 1.4. è richiesto solo se viene eseguita l'etichettatura immunofluorescente e la microscopia a scansione laser.

2. Estrazione di topi e tessuti

NOTA: Per questi studi di riprogrammazione, il mouse Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl è stato creato incrociando un mouse Ascl1CreERT (Ascl1-CreERT: Jax # 012882) con un topo tdTomatoSTOPfl/fl (B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/J: Jax # 007914). Questo mouse ha uno sfondo misto (ceppo C57BL/6, S129 e ICR). Il genotipo di questo topo è mostrato nella Figura 1A. Tutti i ceppi possono essere utilizzati per questo protocollo.

  1. Indossare guanti e disinfettare lo spazio di lavoro, compreso il microscopio di dissezione e tutti gli strumenti fini (pinze curve Dumont #5 fine e Dumont #7, forbici fini e forbici Vannas) con il 70% di etanolo. Disinfettare una piastra di dissezione nera rivestita in silicone da 10 cm esponendola alla luce UV per 20 minuti.
  2. Preparazione di piatti e piatti per l'estrazione dei tessuti
    1. Preparare una piastra a 24 pozzetti per la raccolta degli occhi e la separazione dei campioni (due occhi per topo in un pozzetto, etichettati con ID di topo) con ~ 1 mL di HBSS freddo (4 °C) per pozzetto. Posizionare il piatto a 24 pozzetti sul ghiaccio.
    2. Riempire una capsula di Petri sterile da 10 cm (per il lavaggio) e la piastra di dissezione rivestita in silicone igienizzata con diversi ml di HBSS freddo (4 °C) per assicurarsi che il tessuto sia completamente coperto con HBSS.
    3. Preparare un tubo sterile da 1,5 ml con 1 mL di etanolo al 70%.
    4. Preparare una piastra di coltura a 12 pozzetti etichettando la piastra con il numero di coltura, la data, il ceppo e tutte le informazioni richieste.
  3. Eutanasia dei topi P12 utilizzando qualsiasi metodo approvato.
  4. Rimozione degli occhi
    1. Tenere delicatamente la testa del mouse con il pollice e l'indice intorno all'occhio.
    2. Usando la pinza curva Dumont #7, vai delicatamente dietro il bulbo oculare e aggancia il nervo ottico. Togli con attenzione l'occhio.
      NOTA: se vengono utilizzati topi adulti, non utilizzare pinze curve e non tirare l'occhio. Invece tagliare con cura intorno al globo oculare usando forbici fini; tagliare il nervo ottico ma non tagliare l'occhio stesso. Utilizzare una pinza per rimuovere con cura il bulbo oculare.
  5. Pulizia del bulbo oculare
    1. Immergere brevemente il bulbo oculare in un tubo contenente etanolo per evitare il riporto di batteri dall'animale.
    2. Lavare brevemente il bulbo oculare nella capsula di Petri da 10 cm prima di metterlo nella piastra da 24 pozzetti sul ghiaccio.
  6. Ripetere i passaggi 2.4 e 2.5 per gli altri occhi. Tenere la piastra del pozzo sul ghiaccio durante il processo. Metti due occhi di un animale nel piatto di dissezione posto sotto un microscopio di dissezione con una fonte di luce.
  7. Estrazione della retina
    1. Fissare un bulbo oculare afferrando il nervo ottico e il tessuto connettivo circostante intorno alla sclera con una pinza fine Dumont #5 e premerlo con attenzione contro il piatto di dissezione (cornea verso l'alto).
    2. Fai un buco al centro della cornea usando un ago da 30 G per consentire un accesso più facile alle forbici Vannas.
    3. Seziona la cornea intorno al corpo ciliare usando le forbici Vannas e rimuovi accuratamente cornea, lente, iride e corpo vitreo con dumont #5 pinze fini. La Figura 2A illustra un oculare con la retina all'interno.
    4. Sezionare la sclera con le forbici vannas fino a raggiungere il nervo ottico. Taglia il nervo ottico ed estrai con cura la retina usando la pinza fine Dumont #5.
    5. Utilizzare un secondo paio di pinze sottili Dumont #5 per spingere contro la retina e consentire la completa rimozione del corpo vitreo. La Figura 2B illustra due retine estratte.
  8. Trasferimento e lavaggio
    1. Tagliare circa 2,5 cm della punta di una pipetta di trasferimento sterile per allargare il diametro. Usando questa punta, raccogli (succhia) intere retine senza danneggiare il tessuto.
    2. Trasferire le retine in una nuova capsula di Petri sterile con HBSS freddo (4 °C) e scuotere la piastra (avanti e indietro, sinistra e destra).
    3. Utilizzando la punta della pipetta di trasferimento, spingere con attenzione le retine per lavare via le cellule epiteliali pigmentate retiniche (RPE).
      NOTA: In alternativa, l'intera retina con lente e corpo vitreo può essere rimossa dal padiglione oculare. Quindi, la lente e il corpo vitreo possono essere rimossi dalla retina estratta. Se la retina è strappata, assicurarsi di raccogliere tutti i pezzi per la dissociazione; altrimenti, ci saranno quantità insufficienti di tessuto per far crescere strati cellulari confluenti.
  9. Posizionare immediatamente la retina isolata in un nuovo pozzo pulito della piastra a 24 pozzetti riempita con 1 mL di HBSS. Tenere la piastra a 24 pozzetti sul ghiaccio durante il processo di dissezione.
  10. Ripetere i passaggi 2.7-2.9 per isolare la seconda retina.

3. Dissociazione della retina

NOTA: tutti i passaggi successivi (fino alla raccolta delle cellule) devono essere eseguiti in un armadio di biosicurezza A2 o B2 (BSC).

  1. Preparare la miscela di dissociazione Papaina/DNasi I come segue.
    1. Per sei retine, aggiungere 75 μL di DNasi I nel tubo contenente 750 μL di Papaina (dal punto 1.3) e mescolare accuratamente (miscela di dissociazione).
    2. Per la preparazione del campione individuale richiesta per questo protocollo, dividere il volume totale di 825 μL in tre aliquote: 275 μL della miscela in un tubo da 1,5 mL per topo (due retine). Calcolare le quantità richieste di DNasi I e Papaina di conseguenza.
      NOTA: Fino a sei retine possono essere dissociate in un tubo di miscela Papaina/DNasi I. Tuttavia, la preparazione dei singoli campioni si traduce in un minor numero di grumi e una migliore crescita cellulare rispetto ai campioni combinati.
  2. Trasferire due retine alla miscela di dissociazione Papaina/DNasi I. Utilizzare una pipetta di trasferimento con un diametro della punta allargato (passaggio 2.8.1), raccogliere le retine, attendere che le retine si depositino nella parte inferiore della punta e quindi rilasciare le retine senza eccessivo HBSS nel tubo contenente la miscela di papaina / DNasi I.
  3. Mettere su un nutatore e incubarlo per 10 minuti in un incubatore di colture cellulari (37 °C, 5% CO2).
  4. Dissociare le cellule pipettando accuratamente su e giù (circa 20-30 volte) con una pipetta da 1 ml. Dopo che le cellule sono state dissociate (cioè, risultando in una soluzione omogenea senza pezzi), aggiungere 275 μL di inibitore della proteasi ovomucoide dal kit di dissociazione della papaina per neutralizzare la papaina. Mescolare delicatamente pipettando su e giù.
    NOTA: Se sei retine sono state dissociate in 825 μL di miscela Papaina/DNasi I, sono necessari 825 μL di Ovomucoide.
  5. Centrifugare la miscela a 300 x g per 10 min a 4 °C.
  6. Aggiungere il fattore di crescita epidermico (EGF, 1 μL per 1 mL del terreno di crescita, ricostituito a 200 μg/mL in PBS) al volume calcolato del terreno di coltura (1 mL per topo) preriscaldato a 37 °C.
    NOTA: A seconda del disegno sperimentale, il marcatore di proliferazione 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU), così come il 4-idrossitamoxifene (4-OHT) o altri fattori richiesti possono essere aggiunti all'inizio del periodo di coltura.
  7. Rimuovere accuratamente i tubi dalla centrifuga. Non toccare il pellet nella parte inferiore del tubo.
  8. Rimuovere il surnatante con cura e completamente. Risospesciare il pellet cellulare con 500 μL di terreno di coltura integrato con EGF.
  9. Trasferire la sospensione cellulare in un pozzetto della piastra a 12 pozzetti etichettata (Figura 2C). Risciacquare il tubo con altri 500 μL del mezzo di crescita integrato con EGF e aggiungerlo al pozzo (volume totale di 1 mL per pozzetto).
  10. Ripetere i passaggi 3.8 e 3.9 con tutti gli altri esempi.
  11. Scuotere la piastra del pozzo tre volte con attenzione (avanti e indietro; sinistra e destra). Posizionare la piastra nell'incubatrice (37 °C, CO2).
    NOTA: se vengono utilizzati topi transgenici, eseguire la genotipizzazione per ogni animale (Figura 2D). Identificare i topi Cre ricombinasi positivi e negativi ed etichettare la piastra di conseguenza. Per questo protocollo, sono state utilizzate solo cellule di topi reporter crecombinasi positivi per i passaggi successivi. Le cellule dei campioni Cre negativi vengono congelate e utilizzate per altre applicazioni.

4. Fase di crescita

NOTA: La fase di crescita ha una durata di circa 4-5 giorni (Figura 1B). Per aggiungere liquidi ai pozzetti contenenti cellule, la pipetta deve puntare alla parete del pozzo e il liquido deve essere rilasciato lentamente per evitare il distacco cellulare. Non pipettare direttamente sulla parte superiore delle celle.

  1. Un giorno dopo la dissociazione, rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di terreno di coltura fresco integrato con EGF.
  2. Il giorno 3, rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di HBSS (temperatura ambiente) per rimuovere i detriti cellulari. Oscilla delicatamente avanti e indietro da sinistra a destra. Rimuovere HBSS, ripetere la fase di lavaggio e aggiungere 1 mL di terreno di coltura preriscaldato integrato con EGF.
  3. Monitorare le cellule ogni giorno e valutare il loro stato di crescita fino a quando le cellule raggiungono il 90% -100% di confluenza. La Figura 3 mostra un esempio di buona crescita mg nel tempo. Verificare la presenza di possibili contaminazioni o morte cellulare (Figura supplementare 1). Scartare le colture contaminate.
    NOTA: per monitorare e registrare lo stato delle cellule, scattare immagini a vari ingrandimenti utilizzando un microscopio ottico con una fotocamera collegata e obiettivi 4x, 10x o 20x. In questo studio, viene utilizzato un microscopio a fluorescenza.

5. Preparazione di coverslips con poly-L-ornitina (Poly-O) e laminina

NOTA: questo passaggio è necessario solo se vengono eseguite l'etichettatura immunofluorescente e la microscopia a scansione laser confocale. Per una corretta imaging sono necessari copripavimenti rotondi in vetro (diametro 12 mm). Il protocollo di rivestimento può anche essere trovato nella scheda tecnica del mezzo neuronale (vedi Tabella dei materiali).

  1. Posizionare accuratamente le coperture sterili al centro di ogni pozzetto di una piastra a 24 pozzetti usando una pinza sterile Dumont #2AP.
    NOTA: Posizionare le coperture al centro del pozzo. Posizionare i coperchi vicino alla parete di un pozzo causerà problemi di tensione superficiale per i passaggi successivi.
  2. Scongelare un'aliquota Poly-O da 2,5 mL a temperatura ambiente e posizionarne 100 μL al centro di ogni coverslip.
  3. Incubare la piastra del pozzo per 30 minuti in un incubatore a 37 °C.
  4. Rimuovere Poly-O e lavare il pozzo con il coperchio tre volte con ~ 1 mL di acqua sterile.
  5. Lasciare asciugare il piatto del pozzo durante la notte nel BSC. Scongelare 2,5 mL di laminina a 4 °C durante la notte.
  6. La mattina successiva, aggiungere 100 μL di laminina al centro di ogni coverslip e incubare per 4 ore in un incubatore a 37 °C.
  7. Rimuovere il Laminin con cura e completamente.
  8. Tenere la piastra a 4 °C se il passaggio non può essere eseguito immediatamente.
    NOTA: I coperchi rivestiti in piastre preparate possono essere conservati per alcuni giorni a 4 °C.

6. Passaggio cellulare per rimuovere i sopravvissuti neuronali

NOTA: Il passaggio cellulare è necessario per rimuovere le cellule neuronali, non per aumentare la popolazione cellulare. Glia si dividono solo poche volte e non cresceranno ulteriormente dopo il passaggio. Non diluire le sospensioni cellulari. Le cellule di un pozzo confluente di una piastra a 12 pozzetti possono essere distribuite su un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti o due pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Quando vengono utilizzate coperture rivestite, solo circa un terzo della copertura viene rivestita. Pertanto, sei coverslip seduti in una piastra a 24 pozzetti, con cellule confluenti (~ 80% -90%) possono essere ottenuti da un pozzo di cellule confluenti di una piastra a 12 pozzetti. Altri rapporti possono essere scelti anche per aumentare o diminuire la densità cellulare. Per questo protocollo, viene utilizzato un topo reporter Cre+ [un esperimento, due trattamenti: miR-25 o control-miR; repliche tecniche n = 3 (tre coverslip per trattamento), replica biologica n = 1]. Il numero di repliche tecniche e biologiche può essere definito in modo diverso a seconda del progetto sperimentale.

  1. Controllare se le celle sono confluenti al 90%-100% (anche a margine del pozzo; Figura 3E,F).
  2. Rimuovere il mezzo e aggiungere 1 mL di HBSS (temperatura ambiente) per lavare. Scuotere delicatamente il piatto (avanti e indietro, sinistra e destra). Rimuovere completamente HBSS.
  3. Aggiungere 500 μL di una soluzione preriscaldata contenente tripsina (preriscaldata a 37 °C in un bagno di perline metalliche) per staccare le cellule dal pozzo. Oscillare delicatamente (avanti e indietro, da sinistra a destra) e incubare per 2 minuti in un incubatore a 37 °C.
  4. Spostare la piastra dall'incubatore a BSC. Durante l'inclinazione, aspirare la soluzione contenente tripsina e disperderla con attenzione e lentamente sul pozzo più volte fino a quando le cellule si staccano completamente. Tenere la piastra contro la luce e assicurarsi che non rimangano celle nella parte inferiore.
  5. Trasferire questa sospensione cellulare in un tubo sterile da 1,5 ml. Centrifugare a 300 x g per 8 min a 4 °C.
  6. Rimuovere il surnatante e risospese accuratamente il pellet cellulare aggiungendo 600 μL (100 μL per pozzetto per 6 pozzetti/coverslip) di terreno di coltura preriscaldato (integrato con EGF; 1:1000). e pipettaggio su e giù ~ 30-40 volte.
    NOTA: Le celle possono essere congelate in questo momento a -80 °C o in azoto liquido e scongelate seguendo protocolli standard per lo scongelamento delle linee cellulari. Se le cellule sono congelate, non saranno risospese in mezzo integrato con EGF (mezzo di crescita). Saranno risospesi in mezzo di base (senza EGF) e soluzione di congelamento (rapporto 1/1). I passaggi da 6.1.1 a 6.6.2 descrivono i passaggi per il congelamento delle celle. Se nessuna cella è congelata, continuare con il passaggio 6.7.
    1. Preparare la soluzione di congelamento mescolando 100 μL di DMSO e 400 μL di FBS (volume totale di 500 μL per pozzo/campione).
    2. Risospesare il pellet cellulare in 500 μL di terreno di crescita preriscaldato. Aggiungere la sospensione cellulare a 500 μL di soluzione di congelamento DMSO/FBS (volume totale di 1 mL). Tenere i tubi sul ghiaccio fino a quando tutti i campioni non vengono elaborati. Congelare le celle a -20 °C per 1 ora, quindi conservare a -80 °C.
  7. Seminare le cellule posizionando 100 μL della sospensione cellulare/media da 600 μL (fase 6.6) al centro di sei coverslip rivestiti (vedi punto 5) della piastra a 24 pozzetti. Posizionare la piastra con attenzione nell'incubatrice e lasciare che le cellule si depositino.
    NOTA: 100 μL della sospensione cellulare da 600 μL (raccolta da un pozzetto di una piastra a 12 pozzetti) determineranno una confluenza cellulare del 90%-100%, necessaria per la trasfezione.
  8. Controllare le celle dopo 3 ore per vedere se si sono depositate sul coperchio. Aggiungere 400 μL di terreno di coltura integrato con EGF.
    NOTA: le cellule sono solitamente pronte per la trasfezione il giorno seguente (Figura 3G). Se non confluenti (90%-100%), lasciarli per un altro giorno. Se ancora non confluenti, non usarli per la trasfezione. Se vengono condotte altre applicazioni a valle, come la profilazione dei miRNA, l'RNA-Seq, l'RT-qPCR o il western blot, le cellule devono essere passate in piastre a 12 pozzetti (rapporto 1:1; non è richiesto alcun trattamento con piastre) e raccolte per l'estrazione di RNA/proteine.

7. Trasfezione

NOTA: La fase di trasfezione consiste in una fase di 3 ore solo in mezzo di trasfezione (le procedure di trasfezione sono descritte nel manuale di trasfezione fornito con il reagente di trasfezione) e una fase allungata in cui il reagente di trasfezione e i miRNA sono ancora presenti, ma viene aggiunto il mezzo neuronale con gli integratori richiesti (la durata totale è di 2 giorni; Figura 1B). In questo protocollo, saranno trasfettati sei pozzi: tre pozzi riceveranno la riprogrammazione del miRNA miR-25 e tre pozzi riceveranno il miRNA di controllo.

  1. Controlla se le cellule hanno raggiunto il 90% di confluenza e registra / visualizza le cellule prima della trasfezione.
  2. Rimuovere il mezzo di crescita e aggiungere 500 μL di HBSS (temperatura ambiente) per lavare le cellule.
  3. Rimuovere HBSS e aggiungere 400 μL di siero ridotto utilizzato per le trasfezioni. Riposizionare la piastra in un incubatore a 37 °C.
  4. Preparare la miscela di trasfezione seguendo le istruzioni del protocollo del reagente di trasfezione del produttore. Fare due miscele: miscela di reagenti di trasfezione e miscela di miRNA (vedere la Figura 1B per l'illustrazione).
    1. Preparare la miscela di reagenti di trasfezione: per una piastra a 24 pozzetti, sono necessari 49 μL di mezzo sierico ridotto e 1 μL di reagente di trasfezione per un pozzo (50 μL in totale). Per sei pozzetti, 294 μL di mezzo sierico ridotto e 6 μL di reagente di trasfezione vengono combinati e miscelati bene mediante pipettaggio delicato su e giù.
    2. Preparare la miscela mimica di miRNA: per una piastra a 24 pozzetti, è necessario un volume totale di 50 μL della miscela mimica per un pozzo. Tre pozzi riceveranno il miRNA di controllo e gli altri tre pozzetti saranno trattati con miR-25. Per questo protocollo viene utilizzata una concentrazione finale di 200 nM.
      1. Per il trattamento miR-25 (tre pozzetti), 150 μL di mezzo sierico ridotto e 3 μL di imitazioni miR-25 (soluzione madre da 100 μM) vengono combinati e miscelati bene mediante pipettaggio delicato su e giù. Incubare per 5 min.
        Per il trattamento mimics di controllo (tre pozzetti), 150 μL di mezzo sierico ridotto e 3 μL di imitazioni di miRNA di controllo (soluzione madre da 100 μM) vengono combinati e miscelati bene mediante pipettaggio delicato su e giù. Incubare per 5 min.
        NOTA: Il volume dei miRNA mimici dipende dal fattore di diluizione e dalla concentrazione necessaria (20-500 nM). possono essere utilizzati anche inibitori dei miRNA (antagomiRs) o altre molecole, compresi i plasmidi. Inoltre, è possibile trasfettare combinazioni di molecole.
  5. Combinare la miscela mimica di miRNA e la miscela di reagenti di trasfezione. Mescolare con cura pipettando lentamente e accuratamente pipettando delicatamente su e giù. Incubare per 20 minuti a temperatura ambiente (secondo le istruzioni del produttore).
  6. Aggiungere la miscela di trasfezione di cui sopra a goccia e lentamente sopra le celle, vicino alla superficie del fluido nel pozzo usando una pipetta da 20 μL. Scuotere delicatamente il piatto (avanti e indietro, da sinistra a destra).
  7. Incubare in un incubatore a 37 °C per 3 ore.
  8. Dopo 3 ore, aggiungere mezzo neuronale ai pozzetti (500 μL per pozzetto) integrato con 4-idrossitamoxifene (5 mM di stock ricostituito con 2,58 mL di etanolo, 250 nM di concentrazione finale) per attivare la cre ricombinasi e la 5-etinil-2'-deossiuridina (EdU, 10 mM di soluzione madre ricostituita con 2 mL di DMSO, 1 μM di concentrazione finale) per tracciare la proliferazione cellulare.
    ATTENZIONE: 4-idrossitamoxifene ed EdU sono noti per essere cancerogeni per l'uomo, teratogeni e mutageni. Leggere la scheda di sicurezza dei materiali prima dell'uso e indossare guanti, occhiali e camice da laboratorio. Ricostituire entrambi i reagenti secondo le raccomandazioni del produttore. Non inalare la sostanza/miscela. Chiudere ermeticamente dopo l'uso. Il materiale di scarto deve essere smaltito secondo le normative nazionali e locali. Lavarsi le mani e il viso dopo aver lavorato con la sostanza.
  9. Incubare in un incubatore a 37 °C per 2 giorni (Figura 1B).

8. Conversione cellulare

NOTA: La fase di conversione cellulare ha una durata di circa 5-6 giorni (Figura 1B), ma sono possibili periodi più lunghi.

  1. Controllare quotidianamente le cellule per il successo dell'induzione dell'espressione di tdTomato, della potenziale morte cellulare e / o della contaminazione. La densità cellulare non cambia (Figura 4). Le prime deboli cellule rosse marcate fluorescenti possono essere osservate 1 giorno dopo il trattamento con 4-idrossitamoxifene. È necessario un microscopio fluorescente per monitorare e visualizzare le cellule.
    NOTA: In questo studio, viene utilizzato un microscopio a fluorescenza per l'imaging dal vivo. Le immagini vengono scattate con obiettivi 4x, 10x o 20x.
  2. Due giorni dopo la trasfezione, rimuovere il mezzo e aggiungere 500 μL di mezzo neuronale preriscaldato integrato con 4-idrossitamoxifene ed EdU in ciascun pozzetto.
  3. Sostituire il mezzo con un mezzo fresco a giorni alterni fino a quando le cellule non vengono raccolte.
  4. Scatta immagini dal vivo per la valutazione e la valutazione del numero di cellule fluorescenti rosse (Ascl1 che esprimono) e dei loro cambiamenti morfologici (Figura 4 e Figura 5A-C).

9. Raccolta cellulare: fissazione per l'etichettatura immunofluorescente

NOTA: le celle possono essere raccolte per altre applicazioni a valle, tra cui bulk o scRNA-Seq, RT-qPCR o western blot.

  1. Rimuovere il mezzo e aggiungere 500 μL di HBSS freddo (4 °C) per pozzetto e scuotere delicatamente la piastra (avanti e indietro, da sinistra a destra). Rimuovere HBSS.
  2. Fissare le cellule aggiungendo 500 μL di paraformaldeide al 2% (PFA) e incubare per 20 minuti a temperatura ambiente.
  3. Eseguire l'etichettatura immunofluorescente secondo protocolli stabiliti.

Risultati

Questo protocollo descrive come far crescere MG dalle retine di topo P12 e come riprogrammare queste cellule con miR-25 in neuroni retinici usando il topo reporter Ascl1CreERT:tdTomatoSTOPfl/fl RPC. Questo metodo è stato utilizzato in lavori precedenti riportando in dettaglio altri miRNA adatti (imitazioni o inibitori, come singole molecole o in combinazione) per riprogrammare MG in RPC che quindi adottano le caratteristiche delle cellule neuronali27. Questo metodo ...

Discussione

Questo protocollo descrive come far crescere MG da retine di topo dissociate per riprogrammare studi che utilizzano miRNA. Come mostrato e confermato in una varietà di studi precedenti, la stragrande maggioranza (80%-90%) delle cellule trovate in queste colture sono MG 20,23,24. Questo metodo è una tecnica molto robusta e affidabile e i risultati possono essere facilmente riprodotti se il protocollo viene seguito correttamente...

Divulgazioni

Un brevetto che include alcuni dei risultati di questo rapporto è stato depositato dall'Università di Washington con gli inventori Nikolas Jorstad, Stefanie G. Wohl e Thomas A. Reh. Il brevetto si intitola ''Metodi e composizioni per stimolare la rigenerazione retinica.

Riconoscimenti

Gli autori ringraziano la dottoressa Ann Beaton e tutti i membri del laboratorio per il loro contributo al manoscritto. Un ringraziamento speciale va ai dottori Tom Reh, Julia Pollak e Russ Taylor per aver introdotto le culture primarie MG come strumento di screening per S.G.W. durante la formazione post-dottorato presso l'Università di Washington a Seattle. Lo studio è stato finanziato dall'Empire Innovation Program (EIP) Grant a S.G.W. e fondi di start-up da SUNY Optometry a S.G.W., nonché dal premio R01EY032532 dal National Eye Institute (NEI) a S.G.W.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
Animals
Ascl1-CreERT mouse Ascl1tm1.1(Cre/ERT2)Jejo/JJax laboratories#012882Ascl1-CreERT mice were crossed with tdTomato mice
tdTomato-STOPfl/fl mouse  B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm14(CAG-tdTomato)Hze/JJax laboratories#007914Genotyping is requried to identify Ascl1CreER positive mice
Reagents
(Z)-4-Hydroxytamoxifen, ≥98% Z isomerSigma-AldrichH7904-5MGreconstituted in ethanol, frozen aliquots
16 % Paraformaldehyde (PFA) aqueous solutionVWR100504-7822% PFA made with Phosphate-buffered saline (PBS), frozen aliquots
Alexa Fluor 488 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories711-546-152dilution 1:500
Alexa Fluor 647 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Goat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories705-606-147dilution 1:500
Anti-human Otx2 Antibody, R&D SystemsFisher ScientificAF1979dilution 1:500
Anti-rabbit MAP2 antibodySigma-AldrichM9942-200ULdilution 1:250
Anti-Red Fluorescent Protein (RFP) antibodyAntibodies-OnlineABIN334653dilution 1:500
Ascorbic AcidSTEMCELL Technologies72132reconstituted in PBS, frozen aliquots
B-27 SupplementFisher Scientific17-504-044frozen aliquots
Brain Phys Neuronal MediumSTEMCELL Technologies05790used as neuronal medium in section 1.2, store at 4 °C (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.1643
231640.Cj0KCQiA_8OPBhDtAR
IsAKQu0gbfxhGZMTOU9mHFY
dHNsuLirnQzunvMEuS9wA08uY
-26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)
Click-iT EdU Alexa Fluor 647 Imaging KitFisher ScientificC10340reconstitute following manual, 4°C
Dibutyryl-cAMPSTEMCELL Technologies73886reconstituted in Dimethyl sulfoxide (DMSO), frozen aliquots
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Fisher ScientificMT-25950CQC
Fetal Bovine Serum (FBS)Fisher ScientificMT35010CVfrozen aliquots
Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium, GlutaMAX SupplementFisher Scientific51-985-034store at 4 °C
Gibco TrypLE Express Enzyme (1X), phenol redFisher Scientific12-605-028used as solution containing trypsin, store at 4 °C
HBSSFisher Scientific14-025-134store at 4 °C
Laminin mouse protein, naturalFisher Scientific23-017-015

frozen aliquots, (https://cdn.stemcell.com/media/files/pis/10000000225-PIS_02.pdf?_ga=2.153046205.562651831.
1643231638-1407032920.163831
5521&_gac=1.124727416.164323
1640.Cj0KCQiA_8OPBhDtARIsA
KQu0gbfxhGZMTOU9mHFYdHN
suLirnQzunvMEuS9wA08uY-
26yfSbGvNhHEaArodEALw_wcB)

L-GlutamineFisher Scientific25-030-081frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mimic Negative ControlHorizonCN-001000-01-50reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
miRIDIAN microRNA Mouse mmu-miR-25-3p mimicHorizonC-310564-05-0050reconstituted in RNase free water (200 µM), frozen aliquots
N-2 SupplementFisher Scientific17-502-048frozen aliquots
Neurobasal MediumFisher Scientific21-103-049used for growth medium in section 1.1, store at 4 °C
Papain Dissociation SystemWorthington BiochemicalLK003153reconstituted in Earle's Balanced Salt Solution, frozen aliquots
Penicillin StreptomycinFisher Scientific15-140-122frozen aliquots
Phosphate-buffered saline (PBS)Fisher Scientific20-012-043
Poly-L-ornithine hydrobromideSigma-AldrichP4538-50MGreconstituted in steriled water, frozen aliquots
Recombinant Human BDNF ProteinR&D Systems248-BDB-050/CFreconstituted in steriled PBS and FBS, frozen aliquots
Recombinant Mouse EGF ProteinFisher Scientific2028EG200reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Recombinant Rat GDNF ProteinFisher Scientific512GF010reconstituted in steriled PBS, frozen aliquots
Rhodamine Red 570 - AffiniPure F(ab')2 Fragment Donkey Anti-Rat IgG (H+L)Jackson ImmunoResearch Laboratories712-296-150dilution 1:1,000
Slide Mounting MediumFisher ScientificOB100-01
Transfection Reagent (Lipofectamine 3000)Fisher ScientificL3000015store at 4 °C
plasticware/supplies
0.6 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-120
1.5 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-129
10 µL TIP  sterile filter  Pipette TipsFisher Scientific02-707-439
100 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-431
1000 µL TIP sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-404
2.0 mL microcentrifuge tubeFisher Scientific50-408-138
20 µL TIP  sterile filter Pipette TipsFisher Scientific02-707-432
Adjustable-Volume Pipettes (2.5, 10, 20, 100, 200, & 1000 µL)Eppendorf2231300008
Disposable Transfer PipetsFisher Scientific13-669-12
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=12Fisher Scientific08-772-29
Multiwell Flat-Bottom Plates with Lids, No. of Wells=24Fisher Scientific08-772-1
PIPET  sterile filter 10ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10J
PIPET  sterile filter 50ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10Q
PIPET  sterile filter 5ML Disposable Serological PipetsFisher Scientific13-676-10H
Powder-Free Nitrile Exam GlovesFisher Scientific19-130-1597B
Round coverslips (12 mm diameter, 0.17 - 0.25 mm thickness)Fisher Scientific22293232
Vacuum Filter, Pore Size=0.22 µmFisher Scientific09-761-106
equipment
1300 B2 Biosafety cabinetThermo Scientific1310
All-in-one Fluorescence Microscope Keyence BZ-X 810Keyence9011800000
Binocular Zoom Stereo MicroscopeVision ScientificVS-1EZ-IFR07
Disposable Petri Dishes (100 mm diameter)VWR25384-088
Dumont #5 Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11252-40
Dumont #55 Forceps - Biologie/InoxFine Science Tools11255-20
Dumont #7 curved Forceps - Biologie/TitaniumFine Science Tools11272-40
Eppendorf Centrifuge 5430 REppendorf2231000508
Fine Scissors-sharpFine Science Tools14058-11
McPherson-Vannas Scissors, 8 cmWorld Precision Instruments14124
Metal bead bathLab Armor74309-714
Nutating Mixer, Electrical=115V, 60Hz, Speed=24 rpmVWR82007-202
Silicone coated dissection Petri Dish (90 mm diameter)Living Systems InstrumentationDD-ECON-90-BLK-5PK
Tweezers, economy #5World Precision Instruments501979
Water Jacketed CO2 IncubatorVWR10810-744

Riferimenti

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